KR102116691B1 - 암의 골전이 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

암의 골전이 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명의 조성물 및 키트는 암의 미세 골전이 단계에서 유리되는 혈중 순환 조골세포의 바이오마커인 오스테오칼신(Osteocalcin) 및 N-캐드헤린(N-cadherin)을 검출할 수 있어 조기에 골전이암을 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 암의 골전이 조기 진단을 위한 정보제공 방법을 통해 골전이암 환자 등의 생존율을 향상시킬 수 있다.

Description

암의 골전이 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트{COMPOSITION FOR DIAGNOSING BONE METASTASIS OF CANCER}
본 발명은 암의 골전이 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
골전이암은 악성 종양이 골 조직을 파괴시키면서 암 종에 상관없이 일단 진단된 이후 급격히 예후가 나빠지는 경우가 많다. 이렇게 되는 가장 큰 이유는 영상 검사를 활용한 현재의 골전이암의 진단이 시기적으로 매우 늦기 때문이다. 실제, 골전이가 잘 일어나는 유방암에서는 이의 예방 및 조기 진단을 위해 초기 치료 종류 후에도 통상 5년간 호르몬 억제요법을 시행하면서 “골스캔”을 6-12개월 간격으로 반복 촬영한다. 그러나, 통증이나, 골절, 신경 압박 등의 증상 없이 골스캔으로 진단되는 경우에도 이미 골파괴가 진행된 상태인 경우가 대부분이며, 결국 치료 반응이 좋지 않다.
일반적으로, 골전이암은 휴면기 단계, 미세 골전이 단계, 임상적 골전이 단계로 진행된다.
휴면기 단계에서는 암세포가 골세포에만 존재하며, 암세포와 골세포간에 상호작용이 일어나지 않는다. 그러나, 미세 골전이 단계에서는 암세포가 파골세포와 상호작용을 하며, 세포의 증식이 일어나는 단계이다. 임상적 골전이 단계에서는 암세포와 파골세포에 의해 골조직이 파괴되어 통증, 골절 등의 증상이 발견되는 단계이다.
종래 영상 검사를 활용한 암의 골전이 진단은 이러한 임상적 골전이 단계에서만 가능하였으며, 이 경우 이미 종양이 진행되어 효과적인 치료가 어려웠으며, 골조직의 형태학적 변화가 발생된 이후에 진단이 가능하다는 한계가 있었다. 이에 따라 미세 골전이 단계에서 골조직이 파괴되기 전에 조기 진단을 통해 효과적으로 치료할 수 있는 진단용 조성물, 키트 또는 진단을 위한 정보제공 방법의 필요성이 증대되고 있는 실정이다.
한국등록특허 제1821455호
본 발명은 암의 골전이를 초기 단계에서 진단할 수 있는 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 오스테오칼신(Osteocalcin)을 검출하는 물질을 포함하는 암의 골전이 진단용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 오스테오칼신을 검출하는 물질은 항체, 압타머, DNA, RNA, 단백질, 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 암의 골전이 진단용 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 물질은 오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 것인, 암의 골전이 진단용 조성물.
4. 위 3에 있어서, 상기 세포는 말초혈액단핵구인, 암의 골전이 진단용 조성물.
5. 위 3에 있어서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포 유래 조골세포, 조혈모 줄기세포 유래 조골세포 또는 조혈모세포인, 암의 골전이 진단용 조성물.
6. 위 3에 있어서, 상기 세포 또는 이의 소기관은 진단대상으로부터 분리된 뼈, 골수, 골 전이 종양 채취물 또는 말초혈액에서 검출되는 것인, 암의 골전이 진단용 조성물.
7. 위 1에 있어서, N-캐드헤린(N-cadherin)을 검출하는 물질을 더 포함하는 암의 골전이 진단용 조성물.
8. 위 7에 있어서, 상기 물질은 N-캐드헤린을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 것인, 암의 골전이 진단용 조성물.
9. 위 8에 있어서, 상기 세포는 말초혈액단핵구인, 암의 골전이 진단용 조성물.
10. 위 8에 있어서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포 유래 조골세포, 조혈모 줄기세포 유래 조골세포 또는 조혈모세포인, 암의 골전이 진단용 조성물.
11. 위 1에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 방광암, 위암, 유방암, 자궁암, 대장암, 결장암, 혈액암, 난소암, 전립선암, 이자암, 지라암, 고환암, 흉선암, 뇌암, 식도암, 신장암, 담도암, 난소암, 신장암, 갑상선암 또는 피부암 중 선택되는 적어도 하나인, 암의 골전이 진단용 조성물.
12. 위 1에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 갑상선암인, 암의 골전이 진단용 조성물.
13. 위 1 내지 12 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 암의 골전이 진단용 키트.
14. 진단 대상으로부터 분리된 시료 내 오스테오칼신을 검출하는 단계를 포함하는 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
15. 위 14에 있어서, 상기 검출은 오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 것인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
16. 위 15에 있어서, 상기 검출은 오스테오칼신을 발현하는 세포를 검출하는 것이고, 검출된 오스테오칼신을 발현하는 세포 중에서 N-캐드헤린을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 단계를 더 포함하는, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
17. 위 15 또는 16에 있어서, 상기 세포는 말초혈액 단핵구인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
18. 위 15 또는 16에 있어서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포 유래 조골세포, 조혈모 줄기세포 유래 조골세포 또는 조혈모세포인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
19. 위 14에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 방광암, 위암, 유방암, 자궁암, 대장암, 결장암, 혈액암, 난소암, 전립선암, 이자암, 지라암, 고환암, 흉선암, 뇌암, 식도암, 신장암, 담도암, 난소암, 신장암, 갑상선암 또는 피부암 중 선택되는 적어도 하나인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
20. 위 14에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 갑상선암인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
21. 위 14에 있어서, 상기 검출은 오스테오칼신을 발현하는 세포를 검출하는 것이고, 하기 수학식 1에 따른 오스테오칼신을 발현하는 세포의 수(%)를 계산하는 단계를 더 포함하는, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
[수학식 1]
순환조골세포(%) = {(CD15-/CD34-/osteocalcin+ 세포수)/ (CD15- 세포 수)} X 100(%)
(식 중, CD15-/CD34-/osteocalcin+ 세포는 CD15 및 CD34는 발현하지 않고, 오스테오칼신을 발현하는 세포이고, CD15-세포는 CD15를 발현하지 않는 세포임).
22. 위 21에 있어서, 상기 수학식 1의 값이 0.45% 이상인 경우 암이 골로 전이되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
23. 위 16에 있어서, 상기 검출은 오스테오칼신 및 N-캐드헤린을 발현하는 세포를 검출하는 것이고, 하기 수학식 2에 따른 세포의 수(%)를 계산하는 단계를 더 포함하는, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
[수학식 2]
순환조골세포(%) = {(CD15-/CD34-/osteocalcin+/N-cadherin+ 세포수)/ (CD15- 세포 수)} X 100(%)
(식 중, CD15-/CD34-/osteocalcin+/N-cadherin+ 세포는 CD15 및 CD34는 발현하지 않고, 오스테오칼신 및 N-캐드헤린을 발현하는 세포이고, CD15-세포는 CD15를 발현하지 않는 세포임).
본 발명은 뼈 스캐닝이 아닌 보다 간단한 방법으로 암의 골 전이를 진단할 수 있고, 골 전이암의 진단 시기를 획기적으로 앞당겨 환자의 생존율을 크게 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 암의 골전이 조기 진단을 위한 정보제공 방법의 일 예시를 나타낸 도로서, 암환자 혈액에서 osteocalcin+ 또는 osteocalcin+N-cadherin+ 순환 조골세포를 유세포 분석을 통해 정량한 도이다.
도 2는 골전이 유방암 마우스 모델 구축 및 해당 모델에서 2주, 3주, 5주차의 소동물 광학영상(bioluminescence imaging;BLI), 병리조직 검사를 나타낸 도이다.
도 3의 (A)는 골전이암이 BLI에서는 5주차부터 진단이 가능하나, 순환 조골세포는 2-3주차부터 진단이 가능함을 나타낸 그래프이며, (B)는 종양 크기와 순환 조골세포 수(%)는 비례관계임을 나타내는 도이다.
도 4는 마우스 좌심실에 유방암 세포주를 주입하여 실제 골전이 유방암 환자와 가장 유사한 마우스 모델을 구축하고, 일차별 소동물 광학영상(bioluminescence imaging;BLI) 측정 및 osteocalcin+ 순환 조골세포를 유세포 분석을 나타낸 도이다.
도 5는 다른 마우스 종과 그에 따른 유방암 세포주를 이용하여 마우스 모델을 구축하고, 골전이 그룹과 대조군으로 구분하여 osteocalcin+ 순환 조골세포를 유세포 분석을 나타낸 도이다.
도 6은 전이성 유방암 환자 중 골전이 여부에 따른 osteocalcin+ 순환 조골세포 수를 나타낸 도이다.
도 7은 병변 진행이 없는 stable 군과 병변이 지속적으로 진행하는 progressive 군에서 골전이 병변의 활성(active) 또는 비활성(inactive)에 따라 순환 조골세포 분석을 나타낸 도이다.
도 8은 골전이 병변의 진행을 예측할 수 있는 최적 cut-off를 결정하고, 이에 따라 골전이암 환자를 두 그룹으로 나누어 Progression-free survival (PFS) 분석을 나타낸 도이다.
도 9의 (A)는 전이성 갑상선암 환자 중 cOC% 분석 당시 골전이 병변 활성 여부에 따라 비활성군(inactive) 또는 활성군(active)으로 나누어 순환 조골세포 분석을 나타낸 도이다. (B)는 병변 진행이 없는 stable 군과 병변이 지속적으로 진행하는 progressive 군에서 순환 조골세포 분석을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본원에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본원의 목적상, 진단은 암의 골전이의 존재 여부를 확인하거나, 나아가 암의 골전이의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함할 수 있다.
본 발명은 오스테오칼신(Osteocalcin)을 검출하는 물질을 포함하는 암의 골전이 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 암의 골전이의 초기 단계인 미세 골전이 단계에서 조골세포가 혈중으로 유리되어 순환 조골세포가 형성된다는 것을 발견하고, 이를 검출함으로써 암의 골 전이를 초기 단계에서 진단할 수 있다는 것을 발견한 것에 착안하여 본 발명을 완성하였다.
상기 오스테오칼신을 검출하는 물질은 오스테오칼신을 검출할 수 있다면 제한되지 않으나, 예를 들어, 오스테오칼신, 오스테오칼신으로 번역되는 mRNA, 상기 mRNA로 전사되는 DNA 또는 그의 상보적인 서열의 DNA를 표적으로 하는 항체, 압타머, DNA, RNA, 단백질, 폴리펩티드 등일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 물질은 오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 그 세포소기관을 검출하는 것일 수 있다.
상기 오스테오칼신을 발현하는 세포는 그 종류는 제한되지 않으며, 예를 들면 뼈 조직 유래 조골세포 계열의 세포일 수 있다. 구체적으로, 골수, 뼈 조직, 말초혈액, 혈관, 암 조직 또는 기타 칼슘 침착을 보이는 이소성 뼈 형성 연관 조직 등에 분포하는 세포일 수 있다. 보다 구체적으로 뼈 또는 골수의 중간엽 줄기세포 유래 조골세포, 조혈모 줄기세포 유래 조골세포 또는 조혈모세포 등이 이에 해당할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 세포는 말초혈액단핵구일 수 있고, 바람직하게는 조골세포일 수 있다.
상기 오스테오칼신을 발현하는 세포의 소기관은 그 종류는 제한되지 않으며, 예를 들면 핵, 리보솜, 미소관, 방추체, 핵소체, 소포체, 골지체, 분비소포, 리소좀 또는 엑소좀 등 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 또는 이의 소기관은 진단대상으로부터 분리된 시료 내에서 검출된 것일 수 있다. 상기 시료는 조직, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 뼈, 골수, 뇌척수액 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 뼈 및 골수의 추출액, 종양 채취액 또는 말초혈액 등 일 수 있다.
상기 조성물의 경우, 상기 오스테오칼신을 검출하는 물질을 포함하는 경우 암의 골전이 진단 용도로 활용될 수 있으나, 더욱 명확한 암의 골전이 진단 용도로 활용하기 위해 N-캐드헤린(N-cadherin)을 검출하는 물질을 더 포함할 수 있다.
상기 N-캐드헤린을 검출하는 물질은 N-캐드헤린을 검출할 수 있다면, 제한되지 않으나, 예를 들어, N-캐드헤린, N-캐드헤린으로 번역되는 mRNA, 상기 mRNA로 전사되는 DNA 또는 그의 상보적인 서열의 DNA를 표적으로 하는 항체, 압타머, DNA, RNA, 단백질, 폴리펩티드 등일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 물질은 N-캐드헤린을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 것일 수 있다.
상기 N-캐드헤린을 발현하는 세포는 그 종류는 제한되지 않으며, 예를 들면 뼈 조직 유래 조골세포 계열의 세포일 수 있다. 구체적으로, 골수, 뼈 조직, 말초혈액, 혈관, 암 조직 또는 기타 칼슘 침착을 보이는 이소성 뼈 형성 연관 조직 등에 분포하는 세포일 수 있다. 보다 구체적으로 뼈 또는 골수의 중간엽 줄기세포 유래 조골세포, 조혈모세포 등이 이에 해당할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 세포는 말초혈액단핵구일 수 있고, 바람직하게는 조골세포일 수 있다.
N-캐드헤린을 발현하는 세포의 소기관은 그 종류는 제한되지 않으며, 예를 들면 핵, 리보솜, 미소관, 방추체, 핵소체, 소포체, 골지체, 분비소포, 리소좀 또는 엑소좀 등 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 또는 이의 소기관은 진단대상으로부터 분리된 시료 내에서 검출된 것일 수 있다. 상기 시료는 조직, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 뼈, 골수, 뇌척수액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 뼈 및 골수의 추출액, 종양 채취액 또는 말초혈액 등 일 수 있다.
본원에서, "항체"란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본원의 목적상, 항체는 상기 마커 단백질인 오스테오칼신 또는 N-캐드헤린에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다.
상기 모노클로날 항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리기술을 이용하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 폴리클로날 항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 것을 포함하는, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
또한, 본원의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다.
상기 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
상기 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 암은 간암, 폐암, 방광암, 위암, 유방암, 자궁암, 대장암, 결장암, 혈액암, 난소암, 전립선암, 이자암, 지라암, 고환암, 흉선암, 뇌암, 식도암, 신장암, 담도암, 난소암, 신장암, 갑상선암 또는 피부암 중 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 유방암, 갑상선암 또는 전립선암 중 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 더 바람직하게는 유방암 또는 갑상선암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암의 골전이 진단용 키트에 관한 것이다.
본원의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 키트는 환자 시료 내 오스테오칼신 또는 N-캐드헤린의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제, 또는 이들을 발현하는 세포를 검출하는 제제뿐만 아니라, 발현 수준 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
구체적인 일례로, 상기 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 이러한 ELISA 키트는 상기 단백질들에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 오스테오칼신 또는 N-캐드헤린 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이 외에도, 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석, 또는 단백질 칩 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 암의 골전이를 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 진단 대상으로부터 분리된 시료 내 오스테오칼신을 검출하는 단계를 포함하는 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
진단 대상은 현재 암을 보유하고 있거나 암을 보유한 이력이 있는 동물로서, 상기 동물은 인간을 포함한 포유류일 수 있다.
시료는 진단 대상으로부터 분리된 것으로서, 그 예로는 조직, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 뼈, 골수, 뇌척수액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 뼈 및 골수의 추출액, 종양 채취액 또는 말초혈액 등 일 수 있다.
상기 검출은 오스테오칼신을 검출하는 것으로, 오스테오칼신을 검출하는 물질을 포함하는 암의 골전이 진단용 조성물을 상기 시료에 처리하여 수행되는 것일 수 있다.
오스테오칼신을 검출하는 물질은 앞서 예시한 범위 내의 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출은 오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 것일 수 있다.
오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 이의 소기관은 앞서 예시한 범위 내의 것일 수 있다.
상기 방법은 검출된 오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 이의 소기관 중에서 N-캐드헤린을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이 경우, 상기 검출은 오스테오칼신을 검출하는 물질 및 N-캐드헤린을 검출하는 물질을 포함하는 암의 골전이 진단용 조성물을 상기 시료에 처리하여 수행되는 것일 수 있다.
N-캐드해린을 발현하는 세포 또는 이의 소기관은 앞서 예시한 범위 내의 것일 수 있다.
오스테오칼신, N-캐드해린, 또는 이들을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 물질은 앞서 예시한 범위 내의 것일 수 있다.
상기 암의 범위는 전술한 바와 같다.
본 발명은 진단 대상으로부터 분리된 시료 내 오스테오칼신을 검출하거나, 오스테오칼신 및 N-캐드헤린, 오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 이의 소기관, 또는 오스테오칼신 및 N-캐드해린을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 것으로서, 이는 예를 들면 오스테오칼신 또는 N-캐드헤린에 특이적인 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 단백질을 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
그 구체적인 방법의 예를 들자면 오스테오칼신 또는 N-캐드헤린에 특이적인 항체를 이용하여 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법(flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 및 단백질 칩으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
추가적인 방법으로 두 종류의 형광물질이 가까운 거리에 있을 때. 공명에 의해 에너지를 전달하여 새로운 발색이 일어나는 Fluorescence Resonance Energy Transfer 기술을 활용하여 두 물질을 하나의 형광 파장으로 감지하는 기법을 사용할 수 있다. 또한, 유세포분석 이외 검사의 객관성과 재현성을 높이기 위해 항체 라벨링 후 10㎛ 이하의 세포를 메쉬(mesh)로 걸러내고 슬라이드에 도말하여 자동 스캔, 인공지능에 의한 양성 세포수 정량 기법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 오스테오칼신의 검출 수준을 정상 대조군의 검출 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
오스테오칼신의 검출 수준이 정상 대조군의 검출 수준보다 높은 경우에 암이 골로 전이되었다고 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 이의 소기관의 수를 측정하여 암이 골로 전이되었는지 여부를 판단할 수 있다. 이 경우, 측정된 값이 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 암이 골로 전이되었다고 판단할 수 있다.
전술한 바와 같이, 암의 골전이의 초기 단계인 미세 골전이 단계에서 조골세포가 혈중으로 유리되어 순환 조골세포가 형성되는 것이므로, 진단 대상의 시료에서 오스테오칼신을 발현하는 세포가 정상 대조군 대비 높게 검출되는 경우 암이 골 전이되었다는 정보를 제공할 수 있고, 그 차이가 증가할수록 암의 골 전이 단계가 더 진행되었다는 정보를 제공할 수 있다.
본 발명은 오스테오칼신을 발현하는 세포의 수(%)를 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로는 CD15, CD34를 발현하지 않으면서, 오스테오칼신을 발현하는 세포를 검출할 수 있다. 림프구 등의 면역세포는 CD15 또는 CD34를 발현하므로, 이는, 면역세포가 아닌 세포 중 오스테오칼신을 발현하는 세포를 검출하는 것을 의미한다.
상기 세포의 수는 예를 들면 하기 수학식 1에 따라 계산될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[수학식 1]
순환조골세포(%) = {(CD15-/CD34-/osteocalcin+ 세포수)/ (CD15- 세포 수)} X 100(%)
(식 중, CD15-/CD34-/osteocalcin+ 세포는 CD15 및 CD34는 발현하지 않고, 오스테오칼신을 발현하는 세포이고, CD15-세포는 CD15를 발현하지 않는 세포임).
얻어지는 세포의 수가 정상 대조군의 것보다 많은 경우에 암이 골 전이되었다고 판단할 수 있고, 또한, 세포의 수가 일정 수준 이상인 경우에 암이 골전이되었다고 판단할 수도 있다. 예를 들면 수학식 1의 값이 0.45% 이상이면 암이 골로 전이되었다고 판단할 수 있다.
본 발명의 방법이 검출된 오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 이의 소기관 중에서 N-캐드헤린을 발현하는 세포 또는 이의 소기관을 검출하는 단계를 더 포함하는 경우에, 상기 중에서 N-캐드헤린을 발현하는 세포 또는 이의 소기관이 검출되는 경우 보다 높은 정확도로 암이 골로 전이되었다고 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 오스테오칼신을 발현하는 세포 또는 이의 소기관 중에서 N-캐드헤린을 발현하는 세포 또는 이의 소기관의 수를 측정하여 암이 골로 전이되었는지 여부를 판단할 수 있다. 이 경우, 측정된 값이 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 암이 골로 전이되었다고 판단할 수 있다.
본 발명의 방법은 오스테오칼신을 발현하는 세포 중에서 N-캐드헤린을 발현하는 세포의 수(%)를 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로는 CD15, CD34를 발현하지 않으면서, 오스테오칼신 및 N-캐드헤린을 발현하는 세포를 검출할 수 있다. 림프구 등의 면역세포는 CD15 또는 CD34를 발현하므로, 이는, 면역세포가 아닌 세포 중 오스테오칼신 및 N-캐드헤린을 발현하는 세포를 검출하는 것을 의미한다.
상기 세포의 수는 예를 들면 하기 수학식 2에 따라 계산될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[수학식 2]
순환조골세포(%) = {(CD15-/CD34-/osteocalcin+/N-cadherin+ 세포수)/ (CD15- 세포 수)} X 100(%)
(식 중, CD15-/CD34-/osteocalcin+/N-cadherin+ 세포는 CD15 및 CD34는 발현하지 않고, 오스테오칼신 및 N-캐드헤린을 발현하는 세포이고, CD15-세포는 CD15를 발현하지 않는 세포임).
상기 수학식 2의 값이 정상 대조군과 비교하여 더 높은 경우 더 정확하게 암이 골로 전이되었다고 판단할 수 있다.
필요에 따라, 본 발명의 방법은 진단대상으로부터 분리된 시료에 비타민 K를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
비타민 K는 비타민 K1 또는 비타민 K2일 수 있다.
비타민 K의 처리에 의해 오스테오칼신을 r-카복실화시켜 오스테오칼신의 발현을 증가시키고 안정화시킬 수 있어, 오스테오칼신을 보다 용이하게 검출할 수 있다.
비타민 K의 처리 농도는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 10-5M 내지 10-7M일 수 있고, 구체적으로는 비타민 K1 및 비타민 K2의 처리농도가 각각 10-5M 내지 10-7M 일 수 있다. 상기 처리농도에서 순환 조골세포의 오스테오칼신의 발현 효과가 가장 향상될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. 말초혈액 단핵구 확보 및 유세포 분석
(1) 실험 방법
암환자의 혈액 샘플에서 순환 조골세포의 유세포 분석을 위해, 액체 생검을 통한 샘플 확보 및 해당 샘플에서 말초혈액 단핵구를 확보하였다. 진단 대상 환자의 채취된 혈액 샘플 4cc를 Ficoll(Pharmacia)이 담긴 헤파린 튜브에 담아, 4℃의 온도에서 1800 rpm 속도로 20 분간 원심 분리를 통해 혈장, 단핵구층, ficoll, RBC 층으로 분리된 혈액 층을 유도하였다. 이 때 분리된 혈장과 ficoll 사이 interface (2번째 층)인 단핵구 층만을 조심스럽게 분리하여 새 튜브로 옮긴다. 이 후, PBS 용액을 추가하여 단핵구 세포를 washing 하고, 다시 4℃의 온도에서 2000 rpm 속도로 5 분간 원심 분리하여 깨끗하게 세척된 단핵구 세포만을 얻었다.
세척한 단핵구 세포 106 개를 500 ㎕의 FBS가 포함된 완충액에 담고, 항 CD15-FITC(5 ㎕), 항 CD34-PE-Cy7(5 ㎕), 항 osteocalcin-APC(3 ㎕), 항 N-cadherin-PE(5 ㎕) 항체를 첨가하여 상온에서 30 분간 방치하여 염색을 시행하였다. (사용한 항체 정보: a-CD15 FITC (#555401,BD), a-CD34 PE-Cy7 (#34881, BD), a-osteocalcin APC (#SC-365797-AF647, Santa cruz), a-N-cadherin PE (#561554, BD)를 구입하여 사용하였음.)
염색 종료 후, 4 ml의 FBS가 포함된 완충액을 추가하여 비특이적 결합 및 결합하지 못한 항체를 washing 하여 탈락시키고, 4℃의 온도에서 1500 rpm 속도로 5 분간 원심 분리하여 항체를 표지한 단핵구 세포를 얻었다. 상기 명시한 암환자의 혈액 샘플은 본 발명의 임상연구를 위해 서울대병원 임상연구센터의 IRB 승인 하에 규정에 의한 경로를 통해 분양 받았다.
염색된 단핵구 세포는 유세포 분석기 (BD FACSCanto Ⅱ)를 통해 분석을 수행하였다. 상기에서 나열한 항체로 염색된 단핵구 세포를 단일 세포 수준으로 분석, 가장 먼저 CD15- 세포 군집으로 분류하고 여기에서 CD34-, osteocalcin+ 세포 군집으로 재분류하여 포함하는 세포의 개수를 정량하고 osteocalcin+ 순환조골세포를 분석하였다. 이에 추가적으로 해당 군집에서 N-cadherin+ 세포의 개수를 분석하여 최종적으로 골 전이암 특이 CD15-/CD34-/osteocalcin+/N-cadherin+ 순환 조골세포를 하기 수학식 2와 같이 정량하였다. 유방암 환자 98명, 갑상선암 환자 10명, 총 108 명의 암환자의 검체에서 순환 조골세포의 분석을 완료하였고, 대표 분석 결과를 도 1에 나타내었다.
[수학식 2]
순환조골세포(%) = {(CD15-/CD34-/osteocalcin+/N-cadherin+ 세포수)/ (CD15- 세포 수)} X 100(%)
(식 중, CD15-/CD34-/osteocalcin+/N-cadherin+ 세포는 CD15 및 CD34는 발현하지 않고, 오스테오칼신 및 N-캐드헤린을 발현하는 세포이고, CD15-세포는 CD15를 발현하지 않는 세포임).
(2) 실험 결과
분석결과, 암환자의 혈액 샘플 유세포 분석 결과, 총 1,000,000 개 세포를 분석, 이 중 죽은 세포 등을 제외한 932,559 개의 세포를 분류하였다. 순차적으로 CD15- 세포 881,302 개를 다시 분류하고, 여기서 osteocalcin+ 이면서 CD34- 인 세포 1,252 개를 정량 하였다. 추가적으로 1,252 개 중, N-cadherin+ 인 세포를 869 개 정량한 결과를 나타내었다(도 1).
2. 골전이암 마우스 모델 구축
(1) 실험 방법
전임상 연구에서 순환 조골세포 분석을 위해 골전이 암환자의 골수 환경 및 순환 조골세포 분석에 용이한 마우스 모델을 구축하였다. 모든 동물 실험은 서울대학교 동물실험윤리위원회(SNU-170607-6-2)의 승인 후, 철저한 규정 준수 아래 실시하였다. 사람 유래 유방암 세포주를 면역결핍 마우스 (balb/c nude mouse)의 정강이뼈에 직접 주사함으로써 골 전이암 환자와 유사한 이상적인 동물 모델을 확보하였다. 구체적으로, 사람 유래 유방암 세포주 MDA-MB-231을 1x105/20 ㎕/mouse 양으로 마우스 체내 주입 가능한 완충액인 PBS에 준비하여, nude 마우스 오른쪽 정강이뼈 내에 주사하였다. 암세포 주사 후 2주차, 3주차, 5주차에 in vivo imaging (Xenogen IVIS, PerkinElmer)을 통해 정강이뼈 내 종양 형성 및 성장을 관찰하였다. 각 주차별 실질적인 종양 형성을 확인하기 위해 마우스 안락사 후, 종양이 형성된 정강이뼈를 분리, 조직학적 분석을 위한 샘플 준비과정을 실시하였다. 4% 파라포름알데하이드 용액에 분리한 조직을 3일간 냉장 보관하여 조직을 고정한 후, 뼈에 붙은 근육 부분을 제거하여 0.5 M EDTA 용액에서 탈칼슘화 (Decalcification) 과정을 약 2 주간 진행하였다. (탈칼슘화 과정 또한 냉장 보관, 3일에 한번 0.5 M EDTA 용액을 바꿔주면서 진행하였음.) 이 후 파라핀 블록 및 파라핀 절편으로 슬라이드를 제작하고 H&E 조직 염색을 실시하였다. In vivo imaging 및 조직염색 분석 결과는 도 2에 나타내었다.
(2) 실험 결과
골전이 유방암 마우스 모델을 구축하여 매주 BLI 영상을 확인한 결과, 5주차 되서야 종양 형성 및 성장 부위를 진단할 수 있었으며, 병리조직 검사는 이와 상통한 결과로 확인할 수 있었다. 3주차에 정강이뼈 내에 아주 작은 종양이 형성되어 있음을 관찰하였으며, 5주차엔 정강이뼈 내에 종양이 크게 형성됨을 확인할 수 있었다. 이는, 영상진단으로는 미세한 종양은 어려우며, 5주 이상 종양이 크게 성장하였을 때 진단 가능함을 시사하는 결과이다(도 2).
3. 종양 성장에 따른 순환 조골세포 변화 분석
(1) 실험 방법
상기 실시예 2에서 구축한 골전이암 마우스 모델에서 종양 크기에 따른 순환 조골세포의 변화를 분석하기 위해 채혈을 실시하였다. 구체적으로, 마우스를 마취하고 심장 천자를 통해 1 ㎖ 가량 마우스의 전혈 채취하였다. 채혈 시 혈액 응고를 방지하기 위해 채혈 전 주사기 내부를 헤파린 용액으로 코팅하여 사용하고, 채혈 즉시 적혈구 lysis 용액에 넣어 적혈구 용혈 과정을 진행하였다. 상온에서 15 분 방치 후, 1500 rpm으로 5분 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 해당 과정은 적혈구가 완전히 없어질 때까지 반복 수행하며, 완전히 깨끗해진 세포는 FBS가 포함된 완충액에 담았다. 이 후, 항 CD45-PE (#561087, BD)와 상기 실시예 1에서 명시한 항 osteocalcin 항체를 이용하여 염색하고, 유세포 분석을 통해 CD45+/osteocalcin+ 순환 조골세포를 분석하였다. 종양 성장에 따른 in vivo imaging 의 발광세기 (bioluminescence intensity, ph/s)와 하기 수학식 1에 따른 osteocalcin+ 순환 조골세포(circulating Osteocalcin+ cell, cOC)수(%)를 비교하였다. 이와 관련한 결과를 도 3에 나타내었다.
[수학식 1]
순환조골세포(%) = {(CD15-/CD34-/osteocalcin+ 세포수)/ (CD15- 세포 수)} X 100(%)
(식 중, CD15-/CD34-/osteocalcin+ 세포는 CD15 및 CD34는 발현하지 않고, 오스테오칼신을 발현하는 세포이고, CD15-세포는 CD15를 발현하지 않는 세포임).
(2) 실험 결과
유방암 세포를 이용한 마우스 골전이암 모델에서 순환조골세포(cOC)는 영상 기법에서 진단이 되기 이전에 증가하며, 조직 병리 분석에서 확인 시 종양세포가 골 표면에 미세 군집화를 시작하는 시기과 일치하는 것을 알 수 있었고(도 2 참조), 기존의 이미징 BLI 검사에서 5주째 진단이 가능하였으나, 본 발명에 따르면 2-3주에 이미 진단이 가능함을 확인할 수 있었다(도 3(A)).
더불어, 유방암 세포를 이용한 마우스 골전이암 모델에서 순환조골세포(cOC)는 gold standard로 생각할 수 있는 병리학적 분석으로 측정한 종양의 크기와 좋은 상관 관계를 보였다(도 3(B)).
4. 미세 골전이 유방암 마우스 모델 구축 및 순환 조골세포 분석
(1) 실험 방법
상기 실시예에서 구축한 정강이뼈 주사 골전이 마우스 모델 구축과 다른 마우스 모델로, 실제 골전이 유방암 환자와 가장 유사한 환경에서 전임상 연구를 진행하기 위해 마우스 좌심실에 유방암 세포를 직접 주입한 마우스 모델을 구축하였다. 사람 유래 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포를 면역 결핍 마우스 (Balb/c nude mice)의 좌심실에 직접 주사하여 온몸 순환을 거친 후 정강이뼈 또는 대퇴뼈로 전이된 마우스 모델을 확립하였다.
구체적으로, 사람 유래 유방암 세포주 MDA-MB-231을 1x105/100 ㎕/mouse 양으로 마우스 체내 주입 가능한 완충액인 PBS에 준비하여, nude 마우스 좌심실에 직접 주사하였다. 암세포 주사 후 3일, 7일, 14일, 22일에 in vivo imaging (Xenogen IVIS, PerkinElmer)을 통해 마우스 뼈로 전이된 종양의 형성 및 성장을 관찰하였다. 추가로 ROI (region of interast)를 설정 및 분석하여 마우스 뼈로 전이된 종양 성장을 수치적으로 분석하였다. 해당 일차별 마우스를 희생하여 전혈을 채혈하고 PBMC를 분리하여 수학식 1에 따른 osteocalcin+ 순환 조골세포를 분석하였다. 채혈 및 PBMC 분리 과정, 유세포 분석을 위한 항체 염색은 상기 실시예 3. 항목에서 기술한 바와 상동하다.
In vivo imaging 및 순환조골세포 분석 결과는 도 4에 나타내었다.
(2) 실험 결과
미세 골전이 유방암 마우스 모델을 구축하여 뼈전이 초기 일차별 BLI 영상을 확인한 결과, 암세포 주입 후 14일차에 뼈전이 여부를 진단할 수 있었으며, ROI 수치는 22일차가 되서야 유의미한 분석 결과를 확인할 수 있었다. 반면, osteocalcin+ 순환조골세포 분석 결과는 BLI 영상에서는 뼈전이를 확인할 수 없는 시기인 7일차에 이미 유의미하게 증가되어 있음을 확인하였다. 이는 정강이뼈 직접 주사 모델에서의 결과와 상통한 결과로서, 영상진단으로 미세 골전이 종양측정은 어려우나, osteocalcin+ 순환조골세포 분석으로는 조기 진단이 가능함을 시사한 결과이다 (도 4).
5. 골전이 여부에 따른 순환 조골세포 분석
(1) 실험 방법
골전이 여부에 따른 순환 조골세포 분석을 위해, 상기 실시예 4와 동일한 좌심실 주사 미세 골전이 유방암 마우스 모델을 구축하였다. 해당 모델은 순환 조골세포의 양적 증가가 마우스 종 특이적 또는 특정 유방암 세포주 반응이 아님을 증명하기 위해, 다른 마우스 종에서 해당 마우스 종 유래 유방암 세포주를 이용하였다. 구체적으로, Balb/c 마우스 유래 유방암 세포주인 4T1을 1x104/100 ㎕/mouse 양으로 마우스 체내 주입 가능한 완충액인 PBS에 준비하여, Balb/c 마우스 좌심실에 직접 주사하였다. 암세포 주사 후 7일차에 BLI 영상을 통해 골전이 된 그룹과 그렇지 않은 대조군 그룹으로 분류하였고, ROI 분석을 통해 골전이군과 대조군 간 발광세기를 수치화 하였다. 이후 마우스를 희생하여 전혈을 채혈, 상기 실시예에서 기술한 방법과 동일하게 준비하여 수학식 1에 따른 osteocalcin+ 순환조골세포를 분석하였다. 추가적으로 BLI 수치분석 결과와 순환조골세포 분석 결과의 상관관계를 분석하였다.
해당 결과는 도 5에 나타내었다.
(2) 실험 결과
골전이군과 대조군에서 순환 조골세포를 분석한 결과, 대조군에 비해 골전이군에서 osteocalcin+ 순환 조골세포의 유의미한 양적 증가를 확인할 수 있었다. 또한, BLI 수치분석 결과와 순환 조골세포 양적 증가에 대한 상관관계를 분석한 결과, 골전이 여부에 따른 순환 조골세포의 양적 증가가 상당한 상관관계를 보임을 증명하였다. 이는, osteocalcin+ 순환 조골세포가 미세 골전이 유방암의 조기 진단 가능성뿐만 아니라, 골전이 여부를 판단할 수 있는 마커로서 가능성을 검증한 결과이다 (도 5).
6. 전이성 유방암 환자 임상 연구
(1) 실험 방법
실제 골전이암 환자의 혈액에 존재하는 순환 조골세포를 분석하여 임상적으로 진단적 가치가 있는지 평가하기 위해 골전이암을 가진 유방암 환자 96명을 대상으로 수학식 1에 따른 osteocalcin+ 순환 조골세포 수(%)를 측정하였다. 환자의 혈액 샘플 채취, 단핵구 분리 및 세포 염색 과정은 상기 실시예 1에서 명시한 방법과 동일 방법으로 실시하였으며, 분석 방법 역시 동일하게 수행되었다. 이에 해당하는 결과를 도 6에 나타내었다.
추가적인 임상적 가치를 평가하기 위해 다양한 방법의 분석을 실시하였다. cOC% 분석 당시와 그 이후 지속적인 추적 관찰을 통해 골전이 병변 활성군(active) 또는 비활성군(inactive)으로 나누어 분석하였다. 해당 결과는 도 7에 나타내었다. 또한 상기 분석 결과를 기반으로 골전이 병변의 진행을 예측할 수 있는 최적의 cut-off를 결정하고, 이를 토대로 Progression-free Survival (PFS Probability)를 분석하였다. 이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.
(2) 실험 결과
1. 96명의 전이성 유방암 환자중에서 골전이가 있었던 63명은 골전이가 없었던 33명에 비해 cOC% 가 유의하게 높았다 (도 6).
2. cOC% 분석 당시 골전이 병변이 활성을 가지고 있는지에 따라서 비활성군(inactive) 26명과 활성군(active) 37명으로 나누어 보았을 때 cOC%는 차이가 없었다. 그러나 15개월 추적 관찰 후 골전이 병변을 현재 진행이 없는 stable 군과 병이 지속적으로 진행하는 progressive 군으로 나누어 보았을 때, 비활성/활성군 모두에서 progressive 군의 기저 cOC% 가 유의하게 높음을 확인할 수 있었다 (도 7).
3. cOC%가 골전이 병변의 progression을 예측할 수 있는 최적의 cut-off는 0.45%로 제시할 수 있었다 (도 8(A)). 0.45%를 기준으로 골전이암 환자를 두 군으로 나누어 보면, progression-free survival에 유의한 차이가 있음을 확인할 수 있다 (도 8(B)).
7. 전이성 갑상선암 환자 임상 연구
(1) 실험 방법
실제 골전이암 환자의 혈액에 존재하는 순환 조골세포를 분석하여 임상적으로 진단적 가치가 있는지 평가하기 위해 골전이암을 가진 갑상선암 환자 14명을 대상으로 수학식 1에 따른 osteocalcin+ 순환 조골세포 수(%)를 측정하였다. 환자의 혈액 샘플 채취, 단핵구 분리 및 세포 염색 과정은 상기 실시예 1에서 명시한 방법과 동일 방법으로 실시하였으며, cOC% 분석 당시와 그 이후 지속적인 추적 관찰을 통해 골전이 병변 활성군(active) 또는 비활성군(inactive)으로 나누어 분석하였다. 해당 결과는 도 9에 나타내었다.
(2) 실험 결과
1. 14명의 전이성 갑상선암 환자중에서 골전이가 있었던 12명을 cOC% 분석 당시 골전이 병변이 활성을 가지고 있는지에 따라서 비활성군(inactive) 5명과 활성군(active) 7명으로 나누어 보았을 때 활성군의 cOC% 가 비활성군에 비해 유의하게 높았다 (도 9 (A)).
2. 6개월 추적 관찰 후 골전이 병변을 현재 진행이 없는 stable 군과 병이 지속적으로 진행하는 progressive 군으로 나누어 보았을 때, progressive 군의 기저 cOC% 가 높았으나 통계적인 차이를 보이지는 않았다 (도 9 (B)).

Claims (24)

  1. 오스테오칼신(Osteocalcin)을 발현하는 혈액 유래 세포를 검출하는 물질을 포함하는 암의 골전이 진단용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 오스테오칼신을 발현하는 혈액 유래 세포를 검출하는 물질은 항체, 압타머, DNA, RNA, 단백질, 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 암의 골전이 진단용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 검출은 오스테오칼신을 발현하는 혈중 순환세포 또는 이의 소기관을 검출하는 것인, 암의 골전이 진단용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 말초혈액단핵구인, 암의 골전이 진단용 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포 유래 조골세포, 조혈모 줄기세포 유래 조골세포 또는 조혈모세포인, 암의 골전이 진단용 조성물.
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서, N-캐드헤린(N-cadherin)을 발현하는 혈액 유래 세포를 검출하는 물질을 더 포함하는 암의 골전이 진단용 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 검출은 N-캐드헤린을 발현하는 혈중 순환세포 또는 이의 소기관을 검출하는 것인, 암의 골전이 진단용 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 세포는 말초혈액단핵구인, 암의 골전이 진단용 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포 유래 조골세포, 조혈모 줄기세포 유래 조골세포 또는 조혈모세포인, 암의 골전이 진단용 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 방광암, 위암, 유방암, 자궁암, 대장암, 결장암, 혈액암, 난소암, 전립선암, 이자암, 지라암, 고환암, 흉선암, 뇌암, 식도암, 신장암, 담도암, 난소암, 신장암, 갑상선암 또는 피부암 중 선택되는 적어도 하나인, 암의 골전이 진단용 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 갑상선암인, 암의 골전이 진단용 조성물.
  13. 청구항 1 내지 5 및 7 내지 12 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 암의 골전이 진단용 키트.
  14. 진단 대상으로부터 분리된 시료 내 오스테오칼신을 발현하는 혈액 유래 세포를 검출하는 단계를 포함하는 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 검출은 오스테오칼신을 발현하는 혈중 순환세포 또는 이의 소기관을 검출하는 것인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 검출된 오스테오칼신을 발현하는 혈액 유래 세포 중에서 N-캐드헤린을 발현하는 혈액 유래 세포를 검출하는 단계를 더 포함하는, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
  17. 청구항 14 또는 16에 있어서, 상기 세포는 말초혈액 단핵구인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
  18. 청구항 14 또는 16에 있어서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포 유래 조골세포, 조혈모 줄기세포 유래 조골세포 또는 조혈모세포인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
  19. 청구항 14에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 방광암, 위암, 유방암, 자궁암, 대장암, 결장암, 혈액암, 난소암, 전립선암, 이자암, 지라암, 고환암, 흉선암, 뇌암, 식도암, 신장암, 담도암, 난소암, 신장암, 갑상선암 또는 피부암 중 선택되는 적어도 하나인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
  20. 청구항 14에 있어서, 상기 암은 유방암 또는 갑상선암인, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
  21. 청구항 14에 있어서, 상기 세포는 순환조골세포이고, 하기 수학식 1에 따른 세포의 수(%)를 계산하는 단계를 더 포함하는, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법
    [수학식 1]
    순환조골세포(%) = {(CD15-/CD34-/osteocalcin+ 세포수)/ (CD15- 세포 수)} X 100(%)
    (식 중, CD15-/CD34-/osteocalcin+ 세포는 CD15 및 CD34는 발현하지 않고, 오스테오칼신을 발현하는 세포이고, CD15-세포는 CD15를 발현하지 않는 세포임).
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 수학식 1의 값이 0.45% 이상인 경우 암이 골로 전이되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법.
  23. 청구항 16에 있어서, 상기 세포는 순환조골세포이고, 하기 수학식 2에 따른 세포의 수(%)를 계산하는 단계를 더 포함하는, 암의 골전이 진단을 위한 정보제공 방법
    [수학식 2]
    순환조골세포(%) = {(CD15-/CD34-/osteocalcin+/N-cadherin+ 세포수)/ (CD15- 세포 수)} X 100(%)
    (식 중, CD15-/CD34-/osteocalcin+/N-cadherin+ 세포는 CD15 및 CD34는 발현하지 않고, 오스테오칼신 및 N-캐드헤린을 발현하는 세포이고, CD15-세포는 CD15를 발현하지 않는 세포임).
  24. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 CD15-/CD34-/osteocalcin+인 순환조골세포인, 조성물.
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