CN102656456B - 恶性肿瘤的诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对恶性肿瘤的存在、严重程度、治疗方法的选择或者效果判定、复发的危险性或者是否复发进行判定的方法及诊断用试剂盒。对恶性肿瘤的存在、严重程度、治疗方法的选择或者效果判定、复发的危险性或者是否复发进行判定的方法包括下述工序,1)对来自被检验体试样中的可溶性LR11浓度和/或量进行测定、2)将该测定值与健康人群的可溶性LR11测定值进行比较。

Description

恶性肿瘤的诊断方法

技术领域

[0001] 本发明涉及恶性肿瘤的存在、严重程度、治疗方法的选择或者效果判定、复发的危 险性或者是否复发的判定方法以及诊断试剂盒。

背景技术

[0002] 近年来,在世界上被诊断为恶性肿瘤的人达到1000万人/年以上,恶性肿瘤为死 因的人也超过700万人/年,均存在增加趋势。作为与恶性肿瘤患者的生存有关的重要因 素,认为是正确的诊断、适当的治疗及其效果判定、复发的预知•防止等。为了获得在这些 之中有用的信息,单独或者组合地采用组织病理诊断、基因检查、图像诊断、利用了血液的 临床检查等。其中,血液中的肿瘤标记的测定简便性良好,是比较廉价的检查。

[0003] 恶性肿瘤大致被划分为上皮性恶性肿瘤(carc inoma )和非上皮性恶性肿瘤 (sarcoma)。属于非上皮性恶性肿瘤的一种的造血器官肿瘤在新WHO分类中大体上被划分 为白血病和恶性淋巴瘤。白血病分为发展快的急性白血病和发展比较慢的慢性白血病,急 性白血病进一步分为急性淋巴性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)。ALL根据白血病 细胞的起源进一步分为T细胞性和B细胞性。

[0004] 另一方面,在骨髓中确认20%以上的原始细胞(芽球)时分类为AML,低于20%的情 况被分类为骨髓增生异常综合症(MDS)。

[0005] 急性白血病(AL)时,由于病情发展快,因此重要的是立刻开始治疗。在怀疑是AL 时、怀疑有复发的可能性时进行骨髓穿刺检查并分析骨髓细胞来进行诊断,但该检查对于 患者的侵袭性非常高而无法频繁实施。

[0006] 另外,对于与AL不同、保持着分化•成熟能力的慢性白血病(CL),慢性骨髓性白 血病(CML)被列入骨髓增殖性疾病(MPD ),慢性淋巴性白血病(CLL)被列入恶性淋巴瘤。CL 时,缺乏症状,病情的进展缓慢,长期来说有时会引起AL化(急性转化),因而在治疗中或者 结束后也要进行定期的过程观察。

[0007] 另一方面,恶性淋巴瘤大致划分为霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。

[0008] 在日本,约90%的恶性淋巴瘤被列入NHL,缓慢发展的低恶性程度的滤泡性淋巴 瘤、发展更快的中恶性程度的弥漫性大B细胞性淋巴瘤的病例很多。NHL的治疗根据阶段分 类、恶性程度的不同而异,尤其是低恶性程度的淋巴瘤具有发展慢治疗难以起效的特征,也 会呈现恶性程度发展、向白血病转移,因此必需对病情的过程注意。

[0009] 另外,由于成为恶性淋巴瘤病灶的淋巴结遍布全身,因此与白血病相比难以特定 具体的病灶部位。尤其在已复发时,实际情况是难以发现具体的病灶部位。所以,知悉疾病 在身体的何处、蔓延多广是非常重要的,从而需要进行CT、MRI、PET等昂贵的图像诊断、侵 袭性大的骨髓穿刺检查。

[0010] 另外,作为反映疾病的范围、趋势、治疗效果的检查,可进行乳酸脱氢酶(LDH)、C 反应性蛋白(CRP)、β 2-微球蛋白、铁蛋白、可溶性白细胞介素-2受体(SIL-2R)等血液检 查。但是,已知这些血液检查项目在肝功能障碍、肾功能障碍、细菌感染、类风湿性关节炎或 SLE等胶原病等中也为高值。因此,在造血器官肿瘤诊断中应用这些血液检查项目时,必需 注意如上所述的高值化因素。

[0011] 作为以肝癌、胰腺癌、大肠癌等为代表的上皮性恶性肿瘤所涉及的肿瘤标记,在临 床检查中利用α -胎球蛋白、CEA、CA19-9等,但单独利用时经常会脏器特异性、恶性肿瘤检 测灵敏度不足,将多个肿瘤标记组合来进行测定的病例也屡见不鲜。因此,希望开发出能够 成为新的肿瘤标记的测定项目。

[0012] LR11(LDL receptor relative with 11 ligand-binding repeats)是作为在 LDL 受体家族中具有特征性的结构的新型LDL受体类似蛋白质被鉴定了的物质(专利文献1,非 专利文献1)。报道了该LRll在由平滑肌细胞游离和增殖而引起的血管内膜肥厚部位表达 特异性地亢进(非专利文献2)。另外,已知在哺乳动物的血液中存在着可溶性LR11、以及动 脉硬化性疾病患者中的可溶性LRll浓度与健康的正常人相比有意义地高值化(专利文献 2)、成为对颈动脉内膜中层厚度(MT)进行规定的独立的说明要素(非专利文献3)等。另 夕卜,也已知简单正确地测定血液、脑脊髓液中的可溶性LRll的方法(专利文献3、非专利文 献4)。

[0013] 现有技术文献

[0014] 专利文献

[0015] 专利文献1 :日本特开平9-163988号公报

[0016] 专利文献 2:W〇2〇〇8/l5589l

[0017] 专利文献 3 :W02009/116268

[0018] 非专利文献

[0019] 非专利文献 I J. Biol. Chem. 1996; 271,24761-24768

[0020] 非专利文献 2 =Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999; 19, 2687-2695

[0021] 非专利文献 3 J. Clin. Invest. 2008; 118, 2733-2746

[0022] 非专利文献 4 :Clin. Chem. 2009; 55, 1801-1808

发明内容

[0023] 本发明提供对恶性肿瘤的存在、严重程度、治疗方法的选择或者效果判定、复发的 危险性或者是否复发进行判定的方法以及诊断用试剂或试剂盒。

[0024] 于是,本发明人为了找到新型的恶性肿瘤标记进行了各种研究,结果也是完全意 外地发现了在恶性肿瘤患者的体液样品中以远远高于健康的正常人的浓度存在着可溶性 LR11。然后,获得了该可溶性LRll浓度由于治疗而正常化、在复发时会再次升高等的见解, 发现了作为用于对恶性肿瘤的存在、严重程度、治疗方法的选择或者效果判定、复发的危险 性或者是否复发进行判定的肿瘤标记是有用的。本发明是基于该见解而完成的技术方案。

[0025] 即,本发明提供一种对恶性肿瘤的存在、严重程度、治疗方法的选择或者效果判 定、复发的危险性或者是否复发进行判定的方法,其特征在于,包括下述工序,

[0026] 1)对来自被检验体试样中的可溶性LRll浓度和/或量进行测定,

[0027] 2)将该测定值与健康人群的可溶性LRll测定值进行比较。

[0028] 另外,本发明还提供一种试剂或者试剂盒,含有能够对来自被检验体试样中的可 溶性LRll浓度和/或量进行测定的试剂,用于通过将该测定值与健康人群的可溶性LRll 测定值进行比较来对恶性肿瘤的存在、严重程度、治疗方法的选择或者效果判定、复发的危 险性或者是否复发进行判定。

[0029] 另外,本发明还提供一种恶性肿瘤的存在、严重程度、治疗方法的选择或者效果判 定、复发的危险性或者是否复发的诊断用试剂盒,其特征在于,含有能够对可溶性LRll浓 度和/或量进行测定的试剂。

[0030] 根据本发明的方法,对来自怀疑存在恶性肿瘤的患者的试样中的可溶性LRll浓 度进行测定,与健康的正常人的LRll浓度进行比较,由此能够提供在对恶性肿瘤的存在、 严重程度、治疗方法的选择或者效果判定进行评价上有用的信息。另外,即使在治疗了恶性 肿瘤之后,也能够通过继续测定可溶性LRll来预知复发的危险性或者是否复发。

附图说明

[0031] [图1]表示对急性骨髓性白血病患者缓解治疗前后血清中的可溶性LRll的浓度 变化进行监测的结果。

[0032] [图2]是表示可溶性LRll蛋白质浓度低(< 20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者 与可溶性LRll蛋白质浓度高(> 20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者的缓解率的图。

[0033] [图3]是表示可溶性LRll蛋白质浓度低(< 20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者 与可溶性LRll蛋白质浓度高(> 20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者的总生存率的图。

具体实施方式

[0034] 下面,对本发明进行详细说明。

[0035] 本发明以使用可溶性LRll作为恶性肿瘤标记为特征。

[0036] 在本发明中作为对象的恶性肿瘤被划分为上皮性恶性肿瘤、以及属于非上皮性恶 性肿瘤的一种的造血器官肿瘤。进一步详细而言,上皮性恶性肿瘤包括胃癌、肝癌、胰腺癌、 肺癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、大肠癌、胆囊癌等,造 血器官肿瘤包括急性白血病、慢性白血病、以非霍奇金淋巴瘤为代表的恶性淋巴瘤,但不限 定于此。

[0037] 本发明的判定方法包括下述工序:(1)对来自被检验体试样中的可溶性LRl 1浓度 和/或量进行测定,(2)将该测定值与健康人群的可溶性LRll测定值进行比较。

[0038] 作为本发明中的被检验体,只要是能出现恶性肿瘤症状的被检验体,则没有特别 限定,例如可以举出人、小鼠、大鼠、兔子、猪、狗、猫等哺乳动物。

[0039] 另外,作为来自被检验体的试样,可以举出血液(血清、血浆)、脑脊髓液、淋巴液、 尿、组织、细胞等,但从试样制备的容易性考虑,优选血液,特别优选血清。

[0040] 另外,对于来自被检验体的试样而言,优选来自怀疑有恶性肿瘤的动物(尤其是 人)的试样,特别优选来自利用其它肿瘤标记怀疑有恶性肿瘤的人的试样。

[0041] 来自被检验体的试样中可溶性LRll的浓度或量的测定可采用对可溶性LRll有亲 和性的物质进行。该亲和性物质只要是对可溶性LRll具有结合能力的物质,则没有特别限 制,可以举出对可溶性LRll特异性结合的蛋白质,例如可以举出脱辅基脂蛋白E (apo E)、 apo E 富集的 VLDL(i3 _VLDL)、RAP(The 39_40kDa receptor-associated protein,受体相 关蛋白)、uPA(urokinase-type plasminogen activator,尿激酶型纤溶酶原激活物)、PAI_1 (type-1 plasminogen activator inhibitor,纤溶酶原激活物抑制因子-I )、uPA_PAI_l 复 合体等蛋白质、以及抗可溶性LRll抗体等。其中,更优选RAP和抗可溶性LRll抗体,特别 优选抗可溶性LRll抗体。

[0042] 作为抗可溶性LRll抗体,只要是与从血清精制而得的可溶性LRll进行反应的抗 体,则单克隆抗体、多克隆抗体均可,但优选使用单克隆抗体。该抗体的制作能够采用众所 周知的方法进行制作。例如,在多克隆抗体的制作中,使用小鼠、大鼠、金黄地鼠、兔子、山 羊、绵羊、鸡等作为免疫的动物。抗血清是将抗原对动物的皮下、皮内、腹腔等一次或者多次 给药后从血清中获得的。使用蛋白质、肽作为抗原时,更优选与具有免疫激活效果的补液的 混合物的免疫。

[0043] 另外,在单克隆抗体的制作中,能够按照公知的单克隆抗体制作方法来制作,例如 长宗香明、寺田弘共著,"单克隆抗体"广川书店(1990年)Jame W. Golding, "Monoclonal Antibody",3rd edition, Academic Press, 1996 年。另外,也能米用 DNA 免疫法来制作 单克隆抗体,可以将 Nature 1992 Mar 12 ;356 152-154、J. Immunol Mehtods Mar 1; 249147-154作为参考进行制作。

[0044] 作为用于抗体制作的抗原,可以使用LRll蛋白质、或其部分片段(肽)、或者组合了 编码LRll蛋白质的cDNA的载体。为了获得识别LRll的高级结构的单克隆抗体,作为载有 人类LRll全长基因的构建物的全长LRll载体成为最适合的免疫用抗原基因,除此之外,插 入了 LRll序列的部分区域的构建物也能作为免疫用抗原基因使用。DNA免疫法可以通过对 免疫动物采用各种基因导入法(例如肌肉注射、电穿孔、基因枪等)中的任一种方法将上述 基因构建物单独或者混合地注射到动物(小鼠或者大鼠等)的皮下并使其摄入至细胞内来 实施。

[0045] 该单克隆抗体可以采用对依照常法制成的杂交瘤细胞进行培养并从培养上清中 分离的方法、将该杂交瘤细胞投与到与其具有适合性的哺乳类动物并作为腹水回收的方法 来制造。

[0046] 抗体可以根据需要地将其更加精制地使用。作为精制•分离抗体的方法,有以往 公知的方法,例如硫酸铵沉淀法等盐析、利用Sephadex等的凝胶过滤法、离子交换色谱法、 利用蛋白A色谱柱等的亲和性精制法等。

[0047] 来自被检验体的试样中的可溶性LRll的测定方法没有特别限定,但优选通过使 用了抗可溶性LRll抗体的免疫学方法、利用了 RAP等的亲和性的方法、以及将它们组合的 方法进行测定。作为免疫学方法,例如可采用免疫染色(蛋白免疫印迹,Western blot)、 酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫比浊法(TIA、LTIA)、酶免疫测定法、化学发光免疫测定 法、荧光免疫测定法等,除此以外,还能采用使用了抗体和RAP等对LRll具有亲和性的物质 的夹心ELISA。另外,如果将使试样中的可溶性LRll吸附在预先载带有RAP等亲和性物质 的不溶性担载体后用合适的缓冲液进行洗涤、以及将该可溶性LRll洗脱这样的前处理进 行组合,则能够除去试样中含有的混杂蛋白质,能够高精度地测定可溶性LR11,因此优选。

[0048] 另外,本发明人等建立的、采用了介由表面活性剂进行的前处理的ELISA法 (Clin. Chem. 2009; 55, 1801-1808)非常简便并且能够高精度地测定,因此特别优选。

[0049] 应予说明,在可溶性LRl 1的测定中,为了获得定量值、或者半定量值,优选与成为 基准的LRll量/浓度进行比较。这种情况下,作为成为基准的LRll量/浓度,优选使用已 知浓度的血清可溶性LR11,由平滑肌细胞、神经母细胞瘤细胞系的培养细胞或培养上清中 回收而得的LRl 1,重组LRl 1,或者在抗体制作时用作免疫原的合成肽等。

[0050] 接着,将所得的测定值与健康人群的可溶性LRll测定值进行比较。

[0051] 健康人群的可溶性LRll测定值优选采用与上述来自被检验体的试样的情况相同 的方法预先进行测定。比较来说,优选使用将健康人群的可溶性LRll测定值进行统计学处 理而求出的基准值。该基准值优选对每个对象疾病都以统计学的方式求出。

[0052] 如同在后述实施例中的记载,可判定:在存在恶性肿瘤时、在严重化时、在具有复 发的危险性时,来自被检验体的试样的可溶性LRll的浓度或者量比健康人群的上述基准 值有意义地高。因此,通过来自被检验体的试样的可溶性LRll的浓度或量与该基准值的对 t匕,能够对恶性肿瘤的存在、严重程度、治疗方法的选择或者效果判定、复发的危险性或者 是否复发进行判定。

[0053] 所谓恶性肿瘤的严重程度是指癌发展到何种程度的指标。在本发明中,所谓"对恶 性肿瘤的存在、严重程度进行判定"是指,例如对于造血器官肿瘤的情况而言,由于在WHO分 类中被详细地划分成白血病、恶性淋巴瘤,也评价了恶性程度,所以包括划分成这些分类。 另外,对于非霍奇金淋巴瘤的情况而言,在WHO分类中根据细胞增殖的速度划分为"高恶性 程度"、"中恶性程度"及"低恶性程度",包括划分成这些分类。应予说明,作为各自代表性 的肿瘤,可以举出滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞性淋巴瘤、T细胞淋巴母细胞性淋巴瘤。

[0054] 另外,关于上皮性恶性肿瘤,可使用根据肿瘤的大小与发展程度、向所属淋巴结的 转移情况、以及是否远程转移进行的™m分类这种国际性疾病阶段分类有关的指标,进一 步以该分类为基础可使用能够一次地表现癌的发展程度和扩散程度的阶段分类,包括划分 成这些分类。

[0055] 采用例如缓解期导入疗法进入缓解期时,实现了希望的治疗目的。在此,所谓缓 解,例如对于造血器官肿瘤的情况而言,是指从血液、骨髓中未检测出白血病细胞、恶性淋 巴瘤的状态。

[0056] 治疗方法的选择或者效果判定能够通过对出现了症状的肿瘤的大小变化进行观 察来评价。另外,对于复发的危险性,经过治疗没有将LRll的浓度降低到正常区域时可判 断为复发的危险性高,进而对于是否复发,在间歇期、由治疗带来的缓解之后,可溶性LRll 的浓度开始升高时,可评价为肿瘤再次复发的可能性高。进而,利用本发明方法,能够进行 以后的预测,例如能够预测2〜3年生存率。

[0057] 另外,在判定上述的恶性肿瘤的存在等时,不仅是可溶性LRll的测定值,还优选 与其它公知的肿瘤标记进行组合来判断。作为公知的肿瘤标记,可以举出α-胎球蛋白、 CEA、CA19-9、CA125、PIVKAII、SCC、SLX、弹性蛋白酶I、细胞角质蛋白19片段、DUPAN2等。

[0058] 本发明的试剂盒以含有能够对可溶性LRll进行测定的试剂为特征。作为能够对 可溶性LRl 1进行测定的试剂,可优选地举出含有对可溶性LRl 1具有亲和性的物质的试剂, 例如含有抗可溶性LRll抗体、RAP等上述蛋白质的试剂,但不限定于此,该试剂盒可以包含 可溶性LRll的检测所必需的其它构成要素,例如反应缓冲液、反应容器。在本发明的试剂 盒中,可进一步包含上述健康人群的可溶性LRll测定值数据、用于与该数据进行比较的协 议。

[0059] 实施例

[0060] 下面,通过实施例对本发明具体地进行说明。但是,本发明不限定于这些实施例。

[0061] 参考例1基于DNA免疫法的抗可溶性LRll单克隆抗体的制作

[0062] ( 1)表达载体的构建

[0063] 将构成LRll的全长基因(Q92673)的部分氨基序列(1000-1550)(序列号码1)的 基因片段插入到带有FLAG标签的哺乳动物表达载体(pcDNA3.1,Invitrogen公司)。表达 载体含有对由来自人类碱性磷酸酶的GPI锚定序列形成的肽进行编码的DNA。将其作为 LRll [1000-1550]载体。

[0064] (2) CHO表达物的确认

[0065] 对于目标基因产物是否如设计地利用构建的LRll [1000-1550]载体在细胞膜表 面表达,在免疫前通过使用了 CHO细胞(来自中国仓鼠卵巢)的瞬间导入表达实验进行了 确认。即,在前一天对6孔板的每个孔铺入IX IO6个细胞。在5%C02、37°C的条件下培养 一晚。转染当日,在聚苯乙烯圆管内将质粒稀释液(3yg plasmid DNA+500yL D-MEM)与 lipofectamine2000 稀释液(9 μ L 的 lipofectamine2000+500 μ L 的 D-MEM)充分混合,在室 温孵育20分钟后,除去在前一天铺板形成的培养上清,以不剥离细胞的方式轻轻地添加到 细胞中。在5%C0 2、37°C的条件下孵育5小时后,取出上清,添加含有5%FCS的D-MEM培养基 后在5%C02、37°C的条件下进行培养。第二天,通过解离缓冲液(Invitrogen公司)从板上剥 离细胞,并用于流式细胞仪(FCM)解析。FCM解析以如下方式实施。即,在第一抗体反应中, 在含有3%FCS的磷酸缓冲液、pH7. 2 (PBS)中使得ANTI-FLAG (注册商标)M2抗体(SIGMA) 于4°C与细胞进行反应30分钟。在第二抗体中,用含有3%FCS的磷酸缓冲液洗涤细胞后, 在含有3%FCS的PBS中使得PE标记的抗小鼠 IgG抗体(Beckman)于4°C进行30分钟反应。 用含有3%FCS的PBS洗涤细胞后,悬浮于适量的含有3%FCS的PBS中,提供给流式细胞仪。 其结果,确认了目标基因产物通过构建的LRll [1000-1550]载体在细胞表面表达。

[0066] (3)基于DNA免疫法的抗体的制作

[0067] DNA免疫法是将上述(1)的LRll [1000-1550]载体单独或者混合地对金粒子敏化 的载体通过基因枪对免疫动物的皮下进行,导入细胞内。具体而言,用Helios (注册商标) Gene Gun Optimization Kit (Bio-Rad,美国),依照该试剂盒的使用说明书每25mg的金粒 子给予200 μ g的上述LRll [1000-1550]载体。免疫每隔2周实施4次。在第4次免疫时, 对少量的抗血清取样,将用含有3%FCS的PBS稀释1000倍而得的抗血清作为第一抗体进 行FCM解析。此时,使用使上述(2)的目的基因产物瞬间表达的CHO细胞(以下,也称为强 制表达细胞)进行FCM解析,确认了抗体价升高。另外,单克隆抗体的制作采用一般的细胞 融合法实施。即,进行2次末次加强免疫(final boost)后,对已免疫的动物进行解剖,依照 规定方法分离产生抗体的细胞并与小鼠骨髓瘤细胞细胞融合,从而制成产生抗体的杂交瘤 株。培养这些杂交瘤株后,取培养上清的一部分,通过利用了强制表达细胞的酶免疫测定法 和FCM,选择出与抗原蛋白质反应、与非抗原蛋白质不反应的试样。应予说明,利用了强制表 达细胞的酶免疫测定法以如下的方式进行。将强制表达细胞涂在96孔板上,使杂交瘤培养 上清作为第一抗体进行反应,第一抗体反应后,洗涤板并添加第二抗体。在此,所谓第二抗 体是能够识别小鼠免疫球蛋白或者大鼠免疫球蛋白的抗体,是用辣根过氧化物酶(HRP)进 行了标记的抗体。反应后,添加与标记了第二抗体的酶相对应的荧光基质,用荧光酶标仪进 行解析。

[0068] 接着,采用有限稀释法进行克隆,选择稳定且发现高抗体价的杂交瘤株作为产生 单克隆抗体的杂交瘤株。

[0069] 接着,以如下的方式实施来自腹水的单克隆抗体的大量制备。对用0.5mL姥鲛 烷(Pristane)进行了前处理的裸鼠腹腔注射0. 5mL的磷酸缓冲生理盐水、pH7. 4中的 IX IO6〜3X IO6克隆化杂交瘤细胞。在大约2周后,收集腹水,用蛋白A亲和精制单克隆 抗体。

[0070] 可确认2种这样利用DNA免疫法而得的代表性的抗可溶性LRl 1单克隆抗体(来自 小鼠:M3,来自大鼠:R14)与来自人类和兔子的血清的可溶性LRll进行反应。

[0071] 参考例2来自兔子血清的可溶性LRll的制备

[0072] 对利用插入了人类RAP基因的pGEX2T (GE Healthcare Bioscience公司制造) 载体转化了的大肠杆菌DH5ci进行培养,通过离心分离回收菌体。将从3L的培养液中回 收到的菌体悬浮于含有〇. 2%溶菌酶和0. 5%TritonX-100的PBS (pH7. 2)中,通过超声波 处理来破碎菌体。使该破碎液的离心上清中的RAP/GST融合蛋白质通过IOmL的谷胱甘肽 琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharose) 4FF (GE Healthcare Bioscience 公司制造)并使 其吸附后,用PBS (pH7. 2,以下无特别记载时为相同pH)洗涤,制成RAP-琼脂糖凝胶树脂。 将IOmL的该RAP-琼脂糖凝胶树脂与IL的兔子血清进行混合,边于4°C缓慢地搅拌边使其 反应一夜后,回收RAP-琼脂糖凝胶树脂并用PBS洗涤。然后用柠檬酸缓冲液(pH5. 0)洗 脱兔子可溶性LRll并浓缩后,用PBS透析。进一步将该液体与化学键合了抗可溶性LRll 单克隆抗体(M3)的琼脂糖凝胶树脂混合,边于4°C缓慢地搅拌边使其反应一夜后,用柠檬 酸缓冲液(PH3.0)中洗脱兔子可溶性LR11。将该洗脱液进行浓缩后,通过凝胶过滤色谱 (Supedex200;GE Healthcare Bioscience公司制造)用PBS进行分离精制。将收集了可溶 性LRll的溶出流份并浓缩而得的浓缩物作为精制兔子可溶性LR11。对于该蛋白质含量,利 用SDS聚丙烯酰胺电泳进行分离后,通过银染色检测可溶性LRl 1的蛋白质。同时基于含量 已知的牛血清白蛋白(BSA)的染色带的发色强度,计算出精制兔子可溶性LRll的浓度,作 为在下面的参考例3中记载的ELISA法中的校准值使用。

[0073] 参考例3基于ELISA法的血清中的可溶性LRll的检测

[0074] 将抗可溶性LRll单克隆抗体(M3)用PBS稀释成10 μ g/mL,在微孔板(NUNC公司 制造)中每1孔添加 100 μ L,在室温固化2小时。用含有0. 05%Tween20的PBS (PBST)洗 涤后,每1孔添加 200 μ L含有1%BSA的PBST (BSA-PBST),在室温封闭1小时。用以3:1 的比例混合了 7%MEGA_9 (同仁化学公司制造)和HBR (Scantibodies Laboratory公司制 造)的样品处理液将人血清稀释成11倍。另外,参考例2中精制的来自兔子的可溶性LRll 也用上述样品处理液梯度稀释,作为校准值。每1孔添加100 μ L的这些稀释样品,在室温 使其反应一夜后,将标记了生物素的抗可溶性LRll单克隆抗体(R14)用BSA-PBST稀释为 0. 4 μ g/mL,每1孔添加 100 μ L,在室温使其反应4小时。用PBST洗涤后,将过氧化物酶标 记链霉抗生素蛋白(PIERCE公司制造)用BSA-PBST稀释为0. 2 μ g/mL,每1孔添加 100 μ L, 在室温使其反应1小时。用PBST洗涤后,接着每1孔添加 100 μ L的TMB基质液,在室温使 其发色30分钟,每1孔添加 100 μ L的I. 5Ν硫酸使发色停止后,用酶标仪(Abs. 450nm)进 行测定。利用由校准值作出的标准曲线,计算出试样中的可溶性LRll浓度,乘以稀释倍率, 即为人血清中的可溶性LRll浓度。

[0075] 实施例1作为造血器官肿瘤疾病的标记的可溶性LRll

[0076] 对于从经初次诊断被诊断为造血器官肿瘤的81名个体中采取的血清,求出可溶 性LRll浓度,与从87名并无脂质异常的健康的正常人另采取的血清中的可溶性LRll浓度 进行比较。

[0077] 81名被诊断为造血器官肿瘤的疾病分类的详细内容是急性淋巴性白血病6名、急 性骨髓性白血病11名、慢性淋巴性白血病5名、慢性骨髓性白血病7名、霍奇金淋巴瘤5名、 非霍奇金淋巴瘤26名、骨髓增生异常综合症4名、多发性骨髓瘤8名、以及POEMS综合症9 名。血清中的可溶性LRll浓度采用参考例2所示的ELISA法进行测定。对于各个的疾病 分类,考虑健康的正常人的浓度水平,将暂定的临界值设定为20ng/mL时的病例数以及其 平均值不于表1。由表1,可判断出与健康的正常人相比,尤其在白血病、非霍奇金淋巴瘤中 高频率地确认了远超过临界值的病例。

[0078] [表 1]

[0079]

Figure CN102656456BD00101

[0080] 实施例2在治疗的效果判定中的应用

[0081] 实施例1中,在被诊断为急性骨髓性白血病、并且可溶性LRll浓度为高值的5个 病例中,将对缓解治疗前后血清中可溶性LRll的浓度变化进行监测的结果示于图1。通过 治疗,可溶性LRll的浓度水平降低到正常区域(低于20ng/mL)。这启示肿瘤的存在或者其 严重程度与造血器官肿瘤患者血液中的可溶性LRll的升高紧密相关。

[0082] 实施例3复发的危险性的预测

[0083] 在9名被诊断为造血器官肿瘤、虽然接受治疗得以缓解但复发的患者中,复发时 可溶性LRll浓度水平超过正常区域(20ng/mL)的病例为急性淋巴性白血病1名、急性骨髓 性白血病2名(5名中)、慢性淋巴性白血病1名、非霍奇金淋巴瘤1名(2名中)的总计5名, 超过50%。由此判断,通过对造血器官肿瘤的可溶性LRl 1浓度水平进行监测,存在能够对造 血器官肿瘤复发的危险性进行预测/对复发的可能性进行评价的可能性。

[0084] 实施例4作为上皮性恶性肿瘤中的生物标记的可溶性LRll

[0085] 对于各种上皮性恶性肿瘤,分别测定从随机地抽取的5名患者中采取的血清中的 可溶性LRll浓度。与实施例1同样地,将暂定的临界值设定为20ng/mL时,在各种上皮性 恶性肿瘤中高频率地确认了远超过临界值的病例(表2)。

[0086] [表 2]

[0087]

Figure CN102656456BD00111

[0088] 实施例5缓解率的预测

[0089] 在41名被诊断为急性骨髓性白血病、接受治疗的患者中,对于血清可溶性LRll浓 度水平为正常区域(低于20ng/mL)组,通过治疗达到缓解(完全缓解complete remission, CR)的病例显示为21名中的20名,是高缓解率(95%),与之相对,对于可溶性LRll浓度水 平为20ng/mL以上的组,通过治疗达到缓解的病例为20名中的13名,缓解率有意义地低 (65%)(图2)。由此,通过对造血器官肿瘤的可溶性LRll浓度水平进行测定,能够预测通过 治疗造血器官肿瘤疾病而达到缓解的可能性。

[0090] 实施例6与生存率的关系

[0091] 将血清中可溶性LRll浓度低(< 20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者(21名)与高 (彡20ng/mL)的急性骨髓性白血病患者(22名)的总生存率(Overall survival,OS)示于 图3。由该结果可知,可溶性LRll浓度尤其在短期(2-3年)是重要的预后因子。

Claims (3)

1. 能够对来自被检验体的试样中的可溶性LR11浓度和/或量进行测定的试剂在制造 用于通过将该测定值与健康人群的可溶性LR11测定值进行比较来对恶性肿瘤的存在、严 重程度、治疗方法的选择或者效果判定、复发的危险性或者是否复发进行判定,恶性肿瘤患 者的血清中的LR11水平相对于作为正常对照的血清中的LR11水平为上升时判定恶性肿瘤 的存在的试剂盒中的应用, 所述来自被检验体的试样是来自人的血液、血清、血浆、脑脊髓液及尿中的任一种, 所述恶性肿瘤是急性白血病、慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、大肠癌或胆 囊癌。
2. 根据权利要求1所述的应用,其中,测定采用与可溶性LR11特异性结合的蛋白质进 行。
3. 根据权利要求2所述的应用,其中,蛋白质选自抗可溶性LR11抗体、apo E、P-VLDL、 RAP、uPA、PAI-l、uPA-PAI-l 复合体。
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