TW202127033A - 癌幹細胞之生物標誌 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於分析樣本的方法及套組，所述樣本來自於患有、疑似患有癌症或有患癌症風險之個體所獲得的生物性樣本，藉由量測該樣本中癌症幹細胞，評估表示該個體的癌症預後不良。

Description

癌幹細胞之生物標誌
本發明係關於一種癌症之生物標誌，特別係關於一種癌幹細胞之生物標誌。
肺癌是全球最普遍的致命性惡性腫瘤，非小細胞肺癌(NSCLC)是最常見的肺癌類型。由於驅動基因判斷及專一性標靶治療的成功，許多肺癌患者對治療顯示出良好的初始反應。然而，大多數患者最終在一年內出現抗藥性及癌症復發。
傳統的抗癌治療策略是針對非專一性類型的癌症細胞。然而，例如實體腫瘤，例如肺癌通常具類器官性(organized)、且含具異質性(heterogeneity)的細胞群體。複雜的細胞-細胞相互作用會形成腫瘤微環境(或利基(niche))會涉及與稱為癌症幹細胞(CSCs)的小細胞群體有關，其可能會導致大多數惡性腫瘤。CSCs及腫瘤利基二者在癌症復發、轉移和抗藥性中扮演重要角色。
因此，對於患有癌症(例如肺癌)的個體尤其是預後不良相關的癌症，確認CSC的生物標誌發展出診斷具可靠和可評估預後方法是非常有 意義。該些生物標誌亦將有利於肺癌機制的研究，並有助於發展肺癌新的有效治療方法。
本發明揭露至少部分基於癌症幹細胞(例如：肺癌幹細胞)的新穎生物標誌的鑑定，例如，CD14、或CD14以及CD44的組合。經由轉錄體(cells via transcriptomic)以及蛋白質體的分析，相較於分化的癌症細胞，在與癌相關纖維母細胞(CAF)共同培養的肺癌幹細胞中本發明已發現CD14以及CD44差異性地存在。再者，本發明發現CD14以及CD44與肺癌患者預後不良相關。此外，CD14存在於各種類型的癌細胞，包括肝癌、結腸癌、以及胰腺癌。
因此，本發明揭露的一個態樣提供一種分析樣本的方法，該方法包含：(i)提供一疑似含有癌幹細胞的樣本，以及(ii)測量在該樣本中CD14的含量，以及亦選擇性測量CD44的含量。
在一些實施例中，該方法包含測量CD14蛋白質的含量、CD44蛋白質的含量、或兩者的含量。在一些範例中，測量在該樣本中膜-結合CD14蛋白質的含量以及/或膜-結合CD44蛋白質的含量。在其他實施例中，測量在該樣本中循環的(可溶性的)CD14的含量以及/或循環的(可溶性的)CD44的含量。測量CD14及/或CD44蛋白質的含量可經由免疫組織化學(Immunohistochemistry)分析、免疫墨點法(immunoblotting)分析、ELISA、或流式細胞儀分析。
在一些實施例中，該方法包含測量編碼CD14核酸的含量、編碼CD44核酸的含量、或兩者的含量。在一些實施例中，測量編碼CD14核酸 的含量、編碼CD44核酸的含量、或兩者的含量是經由即時反轉錄PCR(real-time reverse transcription-PCR，RT-PCR)分析或核酸晶片分析。
本文所述的任何分析方法中的樣本可為患有或疑似患有癌症的人類患者之生物性樣本，例如，肺癌(例如：非小細胞肺癌或NSCLC)、肝癌、結腸癌、或胰腺癌。在一些實施例中，該生物性樣本是一組織樣本，其可由如本文所述之人類患者獲得，例如，從腫瘤位置或疑似腫瘤位置。在其他實施例中，該生物性樣本是由如本文所述人類患者的液體樣本(liquid biopsy)。
本文所述的任何分析方法可進一步包含基於CD14的含量、CD44的含量、或CD14以及CD44的組合，以判斷在該樣本中癌幹細胞(例如：肺癌幹細胞、肝癌幹細胞、結腸幹細胞或胰腺幹細胞)的存在。CD14含量的提升、CD44含量的提升、或CD14以及CD44含量的提升是表示癌症幹細胞存在於該樣本內。
本文所述的任何分析方法，或是除此之外，可進一步包含從獲得的生物性樣本來判斷該人類患者的存活率。CD14含量的提升、CD44含量的提升、或CD14以及CD44含量的提升是表示存活率差。在一些實施例中，該方法進一步包含給予該人類患者一癌症治療，例如，肺癌(如：NSCLC)治療、肝癌治療、結腸癌治療、或胰腺癌治療。
在另一態樣中，提供一種檢測關於癌症預後不良的方法，包含：(i)提供一有癌症個體的樣本，(ii)測量在該樣本中CD14的含量，以及亦選擇性CD44的含量，以及(iii)基於在樣本中CD14的含量、或CD14以及CD44兩者的含量，判斷該個體是否癌症預後不良。若在該樣本中CD14的含 量、或CD14以及CD44兩者的含量是高於一預設含量，則判斷該個體為癌症預後不良。在一些範例中，該癌症可為肺癌(如：NSCLC)、肝癌、結腸癌、或胰腺癌。
在另一態樣中，提供一種增加癌幹細胞的方法(如：本文所述)，該方法包含：(i)提供疑似含有癌幹細胞的樣本，以及(ii)從該樣本分離CD14+細胞以及選擇性同時具CD14+/CD44Hi細胞。
本文亦提供一個或多個檢測試劑以測量CD14的含量以及選擇性地CD44的含量用於個體癌症預後之用途，其中該癌症預後是經由本文所述之分析方法進行。
本發明一或多個實施例之詳細內容，將於之後說明。經由本發明之圖式、含有數個實施例之實施方式、以及所附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將為明白易見。
以下附圖形成本說明書的一部分，並且被包括以進一步說明本揭露的某些態樣，通過結合本文提出的具體實施例的詳細描述，通過參考這些附圖中的一個或多個可以更佳地理解。
圖1顯示CD14以及CD44涉及維持肺癌幹細胞(LCSCs)的幹性。A：經由以影像為基礎的高通量分析每個細胞群Nanog-陽性幹細胞。CLS1細胞與CAFs共培養或未與CAFs(N=4)共培養。比例尺為50μm。上圖：照片影像；下圖：定量圖。B：進行脂肪細胞分化，以染色油滴之油紅O染料進行CLS1/CAFs細胞陽性染色(上圖)。在不同時間點進行CLS1/CAFs細胞中的脂肪細胞PPARγ以及LPL標誌的RT Q-PCR分析(下圖)。C：進行成骨細胞分 化，利用鈣沈積的茜素紅S進行CLS1/CAFs細胞陽性染色(上圖)。在不同時間點進行CLS1/CAFs細胞中的造骨細胞(osteoblast)成骨細胞標誌鹼性磷酸酶和骨鈣蛋白的RT Q-PCR分析(下圖)。D：確定分化的CLS1細胞(N≧3小鼠)之不同細胞數(1×104、1×103、1×102 and 10個細胞數)的皮下注射至NSG小鼠之後，從CLS1/CAF共培養的小鼠異種移植腫瘤的發生率(N≧3小鼠)。使用L-calc limiting稀釋分析軟體計算CSCs的腫瘤初始頻率(TIF)。CI：信賴區間。E：癌幹細胞標誌篩選策略的示意圖。CSCs/CAFs以及分化的癌症細胞(CLS1 p.6)進行Affymetrix晶片以及膜蛋白質體分析以確定CSCs/CAF高表現表面蛋白。經由公開對列(published cohort)該候選標誌是與患者存活率有關。F：患者為具有CD44及CD14高或低表現(截止值=中位數風險分數)。結果顯示在高表現或低表現群組之間Kaplan-Meier檢定估計未復發-存活率的顯著差異。經由雙側對數等級檢定(two-sided log-rank tests)獲得P值，該患者分為三個群組：高CD44/高CD14群組、低CD44/低CD14群組以及其他群組。該結果顯示Kaplan-Meier檢定估計整體以及未復發存活率的顯著差異。從雙側對數等級檢定獲得的P值。
圖2顯示第一期NSCLC患者的癌症細胞的CD44及CD14的臨床顯著性。A：從80個從臨床對列(cohort)具有第一期NSCLC手術切除患者收集原發性腫瘤樣本連續切片的癌症細胞的CD44以及CD14的IHC染色。圖像是從在癌症細胞(原始放大倍數，100x)中具有CD44表現低(分數<中位數風險分數)以及高(分數≧中位數風險分數)的不同患者獲得。或者，圖像是從不同患者獲得的癌症細胞(原始放大倍數，100x)中CD14的陰性群組(分數=0)及陽性群組(分數>0)。B及C：患者為具有CD44高或低表現(截止值=中位數風險 分數)；陰性及陽性CD14表現。該結果顯示Kaplan-Meier檢定估計整體(B)以及未復發存活率(C)的顯著差異。從雙側對數等級檢定獲得的P值。經由結合在癌症細胞中CD44及CD14的表現量，該患者分為三個群組：高CD44/陽性CD14群組、低CD44/陰性CD14群組以及其他群組。該結果顯示Kaplan-Meier檢定估計整體以及未復發存活率的顯著差異。從雙側對數等級檢定獲得的P值。
圖3表示與CAFs飼養細胞共培養的癌症細胞其表面CD44及CD14的富集性。A：CD44及CD14的RT Q-PCR驗證。CLS1細胞衍生自CLS1球體，分解成單個細胞且然後在沒有CAF的情況下進行不同傳代次數的繼代培養(p3、p6及p14)。CAF作為飼養細胞對照組。數據表示平均值±S.E.M(N=3)。B：以RT Q-PCR分析在癌症細胞(EKVX)中的CD44、CD14及Nanog，該癌細胞與從患者獲得的CAFs(N=4)共培養或不含CAFs的。該結果顯示在MANOVA測試中不同患者的NFs或CAFs(L2、L5及L8)共培養的癌症細胞有顯著差異。C：經由免疫螢光染色(左圖)及西方墨點法分析(右圖)評估在與(CLS1/CAF)或不含CAFs(CLS1p.6)培養的CLS1細胞中CD44及CD14的蛋白質表現。D：進行RT Q-PCR分析以評估從原發性肺癌細胞(CL152細胞)(N=3)分選的CD14+CD44Hi、CD14-CD44Hi以及CD14-CD44Low群體的幹性標誌Nanog及Oct3/4的表現。E：在含有EGF(20ng/ml)及bFGF(20ng/ml)的MCDB201培養基中培養21天後從原發性肺癌細胞(CL152細胞)分選的CD14+CD44Hi、CD14-CD44Hi以及CD14-CD44Low群體的球形成能力(下圖)及型態(上圖)。比例尺為100μm。F：進行皮下注射不同細胞數(1×102及10個細胞數)至NSG小鼠，檢測從CLS1肺癌細胞(N≧3)分選的CD14+CD44Hi、 CD14-CD44Hi以及CD14-CD44Low群體的異種移植小鼠腫瘤的發生率。使用L-calclimiting稀釋分析計算CSCs的腫瘤初始頻率(TIF)。CI，信賴區間。
圖4顯示從原發性肺癌細胞分選的CD14+CD44Hi群組具有較高腫瘤初始能力。上圖：在不同原發性肺癌細胞中雙重染色CD44及CD14的流式細胞法分析：CL100(A)、CL141(B)、以及CL152(C)。不同原發性肺癌細胞顯示出可變的雙重陽性群體(CL100為5.8%、CL141為0.2%以及CL152為3.5%)。下圖：從原發性肺癌細胞分選的CD14+CD44Hi、CD44HiCD14-以及CD14-CD44Low群組的異種移植小鼠腫瘤的發生率：進行皮下注射不同細胞數(1×104、1×103、以及1×102個細胞數)至SCID小鼠(N-6)，判斷CL100(D)、CL141(E)、以及CL152(F)。使用L-calclimiting稀釋分析計算CSCs的腫瘤初始頻率(TIF)。CI，信賴區間。
圖5顯示與CAFs餵養細胞共培養的癌症細胞其表面的CD44、CD14以及Nanog的富集性。A：與或不與從患者獲得的CAFs共培養之癌症細胞利用雷射擷取群落癌細胞(A549)分析CD44、CD14以及Nanog的表現(N=3個患者)。B：與或不與CAFs餵養細胞培養的CLS1細胞中的CD44及CD14利用流式細胞法分析。
圖6顯示經由流式細胞法分析在癌症細胞表面的CD44及CD14的流式細胞法表現。在不同肺癌細胞株(A549、EKVX、PC9及HCC827)及原發性肺癌細胞(CL25、CL83、CL97、CL100、CL141及CL.152)中分析CD44及CD14雙重染色陽性群組。
癌症幹細胞(CSC)代表腫瘤中之亞群具腫瘤幹細胞樣、及多功能的細胞。CSCs具有能自我更新、分化成特定細胞類型、以及/或發展成癌症之能力。「癌症幹性」的表現型可能是癌發生的推動力。CSCs被認為與化學治療或放射性治療的抗性以及/或轉移相關。越來越多的證據顯示CSCs存在於白血病以及在各種實體腫瘤中，包含肺癌。為維持「幹性」大多數幹細胞依賴於微環境中的直接接觸或與例如纖維母細胞為「餵養細胞」的交互作用模式。在腫瘤微環境中，CSCs可依賴直接接觸與癌相關纖維母細胞(CAF)以維持幹性。該交互作用可創造出利於腫瘤生長及/或轉移的利基(niche)。
本發明揭露至少部分基於標誌的鑑定，經由轉錄體(cells via transcriptomic)以及蛋白質體的分析，包含CD14以及CD44，其在CAF共培養CSC細胞中高度表現。例如，定義CD14為CSCs(如：肺癌、肝癌、結腸癌、或胰腺癌的CSCs)新穎的生物標誌。判斷CSCs顯示細胞表面蛋白質生物標誌(如：CD14以及CD44)的含量高於分化後的癌症細胞。因此，該蛋白質生物標誌的含量(如：CD14以及CD44)與CSCs的存在以及/或的含量有關，且因此該腫瘤樣本來源的癌症患者預後不良。
因此，本發明揭露的一些態樣提供分析樣本的方法，基於CD14的含量以及亦選擇性CD44的含量(膜-結合或循環分子(可溶性的CD14或可溶性CD44))，該樣本例如是一疑似含有癌症幹細胞的樣本。該分析方法可用於臨床目的，如：判斷在樣本中癌幹細胞的存在，其可表示癌症預後不良、基於癌症幹細胞的存在/含量選擇用於治療的候選標誌、監控癌症進展、評估對抗癌症的治療效果、確認治療過程、評估個體是否處於癌症 復發的風險。本文描述的分析分法亦可用於非臨床應用，例如為研究目的，包含如：研究癌症發展以及轉移的機制以及/或與癌症有關的生物路徑/過程，且基於該研究開發新的癌症治療。
確定癌幹細胞(CSC)標誌的分析方法
本文提供分析樣本的方法以確認與癌幹細胞有關的生物標誌的存在以及/或含量。
(i)CSC生物標誌
本文所述「生物標誌」或「生物標誌組」用語代表特定的細胞群(如：CSCs)是指在特定細胞群中的生物分子(如：蛋白質)或該生物分子組存在的含量，抑或其是從不同細胞群組中的相同分子之含量衍生出來。例如，代表CSCs的生物標誌可具有相對於在相同類型或非癌症細胞的分化癌症細胞中相同標誌的含量，在CSCs中具有降低的含量或提升的含量。本文描述CSCs生物標誌可在CSCs具有的含量，其衍生自相同類型或非癌症細胞的分化癌細胞中相同標誌(提升或降低)的含量至少20%(如：30%、30%、50%、80%、100%、2倍、5倍、10倍，20倍、50倍、100倍或更多)。該生物標誌/生物標誌組可用於診斷/預後應用以及非臨床應用(例如，用於研究目的)。
在一些範例中，該生物標誌包含CD14。CD14是一種糖蛋白，其為細菌脂多醣(LPS)的共受體(co-receptor)且在脂多醣結合蛋白(LBP)存在下與LPS結合。CD14有兩種異形體，膜-結合型式(mCD14)以及可溶性型式(sCD14)。兩種型式都可作為癌幹細胞的生物標誌。人類mCD14以及sCD14 的胜肽序列以GenBank accession number NP_001167575.0,PDB：4GLP_A，UniGene：Hs.163867,and GeneCards GCID：GC05M14059提供。
除此之外，該生物標誌可包含CD44。CD44為細胞-表面糖蛋白係牽涉於細胞-細胞之間交互作用、細胞黏附以及遷移。CD44為用於透明質酸的受體且亦可與其他配位體例如是骨橋蛋白、膠原蛋白以及基質金屬蛋白質(MMPs)作用。該人類CD44的胺基酸序列以GenBank accession number ACI46596.1提供。
除CD14及CD44之外，發現在癌症幹細胞中的CP及ABCA8相較於CAFs具有差異性的存在，因此也在本文所述的分析方法中作為標誌。
例示性代表癌症幹細胞的生物標誌(如：肺癌幹細胞、肝癌幹細胞、結腸癌幹細胞、或胰腺癌幹細胞)由表1提供。
Figure 110110084-A0101-12-0010-1
任何本文所述CSC生物標誌，無論是單獨或組合(如：CD14、或CD14以及CD44組合)，可用於本文亦描述疑似含有肺癌幹細胞的樣本分析方法。從該分析方法獲得的結果可用於無論臨床應用或非臨床應用，包含但不限於本文所述。
(ii)生物樣本的分析
任何包含癌幹細胞的樣本(例如，肺癌幹細胞、肝癌幹細胞、結腸癌幹細胞、或胰腺癌幹細胞)可經由本技術領域以及/或本文已知分析方法分析。本文所述方法涉及提供疑似含有肺癌幹細胞的樣本之方法。在一些範例中，該樣本可從活體外(in vitro)分析的樣本，例如，用於研究CSC活體外(in vitro)細胞培養的行為以及/或機制。在一些範例中，經由本文所述的分析方法的樣本可為生物性樣本。本文所述「生物性樣本」是指一含有組織的組合物，如：來自個體的血液、血漿或蛋白質。生物性樣本可為來自個體的初始未處理樣本或後續處理樣本，如：部分純化或保存型式。在一些實施例中，該生物性樣本可為體液樣本，例如，血清、血漿、眼淚、尿液或唾液養品。或者，生物性樣本可為組織樣本，例如，從腫瘤位置或疑似腫瘤位置獲得的組織樣本(疑似含有癌症細胞的組織位置)。在一些實施例中，可隨時間或特定間隔時間從個體收集的多個(如：至少2、3、4、5、或更多)生物性樣本，例如評估疾病進展或評估治療的效果。
生物性樣本指可使用任何本技術領域中已知的方法從個體獲得。例如，從個體經由移除而取得樣本(如：腫瘤組織樣本)，如：經由外科手術(如：胸廓切開術)、經由針抽吸或經由胸腔穿刺術的活組織檢查手術所取得之生物樣本(包括，血液與胸腔或腹腔積液)。
「患者」、「個體」或「個人」用語可相互使用，且係關於需要進行本文所述分析的個體。在一些實施例中，該個體是人類或非人類哺乳動物。在一些實施例中，疑似患有或癌症高風險的人類個體，例如，肺癌、結腸癌、肝癌、或胰腺癌。該個體可表現一個或多個與癌症相關的 症狀。除此之外，該個體可具有一個或多個癌症風險因子，例如，與癌症有關的環境因子或遺傳因子(如：暴露於汙染)。
或者，需要本文所述之分析的個體可為患有癌症的患者，例如肺癌、結腸癌、肝癌、或胰腺癌。該個體目前可能復發，或者可能在過去患有疾病(如：目前未復發)。在一些範例中，該個體可為癌症治療的人類患者，例如，涉及外科手術、化學治療、免疫療法、或放射療法的治療。在一些情況下，該人類患者可能沒有進行治療。
在一些範例中，該癌症是肺癌。肺癌的例示是包括但不限於非小細胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、原位腺癌(AIS)、微浸潤性腺癌(Minimally invasive adenocarcinoma，MIA)、鱗狀細胞癌、大細胞癌、大細胞神經內分泌腫瘤、小細胞肺癌(SCLC)、間皮細胞瘤(mesothelioma)、以及類癌腫瘤(carcinoid tumor)。
使用本文所述的分析方法分析任何本文所述的樣本，其涉及測量本文所述一個或多個CSC生物標誌的含量。在一些範例中，該生物標誌是CD14(膜-結合或可溶性的)、或CD44(膜-結合或可溶性的)。在其他範例中，生物標誌為CD14及CD44的組合。本文揭露生物標誌的含量(如：量)、或該生物標誌含量上的改變，可使用一般性分析或本文所述的方式評估。
本文使用「測量」或「量測」，或者「檢測」或「偵測」用語表示在樣本中評估物質的存在、缺少、數目或量(其可為有效量)，包含該物質的定性或定量濃度的含量之推導，或其他方式評估一個體的值或分類。
在一些實施例中，經由直接檢測樣本，例如生物性樣本中的蛋白質以評估或測量生物標誌的含量。或除此之外，經由生物性樣本可間 接評估或測量蛋白質的含量，例如經由測量蛋白質活性的含量(如：酵素分析)。
蛋白質的含量(CD14以及/或CD44)可使用免疫分析測量。免疫分析的例示包括但不限於免疫墨點法(immunoblotting)分析(如：西方墨點)、免疫組織化學分析、流式細胞法分析、免疫螢光分析(IF)、酵素免疫分析法(enzymelinked immunosorbent assays，ELSIAs)(如：三明治ELSAs)、放射免疫分析、基於電化學發光的檢測分析、磁性免疫分析、側流測定分析、以及相關技術。對於本領域中熟悉技藝人士而言，用於檢測所提供的生物標誌之其他合適的免疫分析是顯而易知的。
該免疫分析涉及專一性於標靶生物標誌之試劑(如：抗體)的用途，如：CD14或CD44。例如「專一性結合」至標靶生物標誌的抗體的檢測試劑為本技術領域中已理解的用語，且本技術領域中亦已知該專一性結合的方法。若抗體比其他生物標誌更頻繁、更迅速地以更長的持續時間以及/或以更大的親和力與特定的標靶生物標誌作用，則稱其表現出「專一性結合」。經由閱讀該定義也可以理解，例如，與第一目標胜肽專一性結合的抗體可或不可專一性或優先結合第二目標胜肽。因此，「專一性結合」或「優先結合」不一定需要(雖然可包括)專一性結合。一般而言，但不一定，提及結合表示優先結合。在一些實例中，「專一性結合」至標靶胜肽或其抗原決定位(epitope)的抗體不可結合至相同抗原中的其他胜肽或其他抗原決定位。
本文使用「抗體」用語是指包含至少一個免疫球蛋白可變的區域或免疫球蛋白可變的區域序列的蛋白質。例如，抗體可包含重(H)鏈可 變區(在本文中縮寫為VH)，以及輕(L)鏈可變區(在本文中縮寫為VL)。在其他範例中，抗體包含兩個重(H)鏈可變區以及兩個輕(L)鏈可變區。該「抗體」用語包含抗體的抗原-結合片段(如：單一鏈抗體，Fab以及sFab片段、F(ab’)2、Fd片段、Fv片段、scFv、以及區域抗體(dAb)片段(de Wildt et al.,Eur J Immunol.1996；26(3)：629-39.))以及完整的抗體。抗體可具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亞型)的結構特徵。抗體可從任何來源，但較佳為靈長類(人類以及非人類靈長類)以及靈長類化。
在一些實施例中，本文描述抗體能與可檢測標記接合，且檢測試劑與感興趣胜肽的結合能基於從可檢測標記釋放的訊號的強度來確定，或使用可專一性檢測試劑的第二抗體。一種或多種抗體可以偶聯至可檢測標記。在本發明領域中已知的任何合適的標記可用於本文所述的測定方法。在一些實施例中，可檢測標記包含螢光團(fluorophore)。如本文使用「螢光團」用語(亦為「螢光標記」或「螢光染劑」)是指以特定的激發波長吸收光能量並以不同波長發射光能量的官能基。在一些實施例中，被檢測官能基及/或包含酶。在一些實施例中，酶是從無色受質產生有色產物(如：β-半乳糖苷酶)。
在一些範例中，本文所述分析方法應用於測量細胞表面生物標誌的含量，例如，在樣本中含有膜-結合CD14以及/或CD44。該細胞可經由例行性操作收集以及細胞表面生物標誌的含量可經由例行性的方法測量，例如，FACS。
在其他範例中，本文所述分析方法應用於測量循環的生物標誌(可溶性的生物標誌)的含量，例如在樣本中的CD14，其可為血液樣本或 血漿樣本。本技術領域中已知的任何分析，如：免疫分析可使用於測量該生物標誌的含量。
在本技術領域中將明白本發明揭露不限於免疫分析。檢測分析非基於抗體，例如質譜分析法，亦用於本文所提供肺CSC生物標誌的檢測及/或定量。依賴顯色(chromogenic)受質分析亦可用於肺CSC生物標誌的檢測及/或定量。
另一方面，在樣本中可編碼CSC生物標誌的核酸含量可經由例行性的方法測量。在一些實施例中，測量編碼CSC生物標誌的核酸表現量包含測量mRNA。在一些實施例中，編碼CSC生物標誌的mRNA表現量可以即時反轉錄(RT)Q-PCR分析或核酸晶片測量。檢測生物標誌核酸序列的方法包括但不限於，聚合酶鏈鎖反應(PCR)、反轉綠-PCR(RT-PCR)、原位PCR、定量PCR(Q-PCR)、即時定量PCR(RT QPCR)、原位雜交、南方墨點法、北方墨點法、序列分析、晶片分析、報導基因的檢測、或其他DNA/RNA雜交平台。
任何專一性結合至所需生物標誌的結合試劑可使用本文所述的方法與套組以測量在樣本中生物標誌的含量。在一些實施例中，結合試劑為專一性結合至所需蛋白質生物標誌的抗體或適合體(aptamer)。在其他實施例中，該結合試劑可為一個或多個互補於編碼核酸或其蛋白質的寡核苷酸。在一些實施例中，樣本可同時或依序與多於一個不同蛋白質標誌結合的結合試劑接觸(如：多重分析)。
為測量目標生物標誌的含量，樣本可在合適條件下與結合試劑(檢測試劑)接觸。通常，「接觸」用語是指樣本或從其收集細胞暴露於結 合試劑適當的足夠時間，以形成在樣本中該結合試劑與目標生物標誌之間的複合物。在一些實施例中，接觸是經由毛細管作用進行，樣本是橫跨支撐膜表面移動。
在一些實施例中，分析可在低通量平台上進行，包含單一分析形式。例如，低通量平台可用以測量在生物性樣本中(如：生物組織、組織萃取物)蛋白質的存在及量，以用於診斷方法、監控疾病及/或治療進展、及/或預測疾病或病症可得益於特定治療。
在一些實施例中，可能需要將接合試劑固定於支撐構件。固定結合試劑的方法之考慮因素例如結合試劑的性質以及支撐構件的材質，且可能需要特定的緩衝劑。該方法對於本技術領域中熟悉技藝人士是顯而易知的。例如，如本文所述生物性樣本中生物標誌組可使用如本文所述任何套組及/或檢測裝置測量。
用於本文所述癌幹細胞生物標誌的檢測及/或定量之檢測類型，將視特定條件而定(如：臨床或研究應用)，且視待檢測生物標誌的種類及數量、及/或視所用患者樣本的種類及數量而定。
本文所述分析方法可使用於臨床及非臨床之二目的。本文提供一些範例。
診斷以及/或預後應用
經由本文所述的分析方法測量來自個體的生物性樣本中一個或多個CSC生物標誌的含量，可用於各種臨床目的，例如，檢測癌症細胞，特別是來自個體(如：人類患者)的生物性樣本中肺癌幹細胞，基於疾病發展、預後結果以及/或目前治療的效果來判定為患有與癌症預後不良個體、 監控個體癌症發展之進展、評估個體的癌症治療效果、判定適合患者的特定治療、預期個體癌症復發、以及/或調整癌症治療。因此，基於一個或多個本文所述CSC生物標誌，本文所述癌症治療及預後方法，例如，與預後不良有關的癌症，如：CD14或CD14以及CD44的組合。例示性的癌症類型包含肺癌(如：例如本文所述NSCLC)、肝癌、結腸癌、以及胰腺癌。
當需要時，經由本文所述分析方法確認在樣本中生物標誌的含量可以在相同樣本中內部對照組或標準樣本標準化(具有生物標誌的預設量)以獲得標準化值。無論生物標誌的原始值或標準化值然後可相較於參考樣本或對照組樣本的數值。在從個體中獲得的樣本中生物標誌的數值提升，係代表在樣本中CSCs存在。帶有CSCs個體表示個體患有本文所述目標癌症，如：與癌症預後不良或癌症發現風險有關。
在一些實施例中，在從個體獲得樣本中生物標誌的含量相較於該生物標誌的預設閥值，從該值提升可表示帶有CSCs個體，且因此可能患有目標癌症，如：與目標癌症有關癌症發展及/或轉移的預後不良或風險。
對照組樣本或參考樣本可為從健康個人獲得的生物性樣本，其可為使與獲得樣本用於分析個體相同的種族、年齡及/或性別。或者，該對照組樣本或參照樣本包含已知待評估生物標誌的量。在一些實施例中，該對照組樣本或參照樣本為從對照組個體獲得的生物性樣本。
本文所述使用，對照組個體為健康個人，如：在測量蛋白質的含量時明顯不含目標癌症(如：例如為NSCLC之肺癌、肝癌、結腸癌、或胰臟癌)或沒有疾病史的個人。對照組個體亦可表示健康個體的群體，其較佳為與經由本文所述分析方法分析個體吻合的特徵(如：年齡、性別、種族)。
對照組的含量可為一預設的含量或閥值。該預設的含量可表示在不患有目標疾病或不具有目標疾病風險的個體群組中蛋白質的含量(如：健康個體群體的平均的含量)。其也可以表示在患有目標疾病的個體群體中蛋白質的含量。
預設的含量可採取各種形式。例如，單一截止值(cut-offvalue)，例如是中位數或平均值。在一些實施例中，該預設的含量可基於比較群組建立，例如其中一個確定群組為已知患有目標癌症以及另一個確定群組為已知未患有目標癌症。或者，預設的含量可為一範圍，例如，表示在對照組群體中蛋白質含量之範圍。
在一些範例中，預設的含量可為與本文所述目標癌症有關的中位數風險分數。中位數風險分數為已知代表一個或多個生物標誌的含量用於從低風險群體區分高風險群體的參照點，其亦地表示特定病症的高風險對低風險(如：癌症發生、癌症預後、或治療效果)。參見如Chen et al.,N.Engl.J.Med.356(1)：11-20(2007)。其用為本文所述診斷/預後方法中的截止值。在一些範例中，中位數風險分數確認於以下。生物標誌的含量可在健康患者(未患有目標疾病的患者)及患有目標疾病的患者中(如：本文所述例如是癌症)確認。在測試患者中生物標誌含量的頻率分布可繪製成確認每個患者風險分數，其表示與目標疾病有關的測試患者的風險概況(risk profile)。然後使用風險分數將患者分類為高風險或低風險組群。為避免極值的影響以及在訓練數據組相等於在兩個族群中(高對低風險族群)設定患者的數量，在50th百分位(中位數風險分數)可用作為截止值，其可為本文使用的方法的預設值。
經由例行性技術確認本文所述的對照組含量。在一些範例中，在本文所述對照組樣本中，對照組含量經由一般方法(如：本文所述獲得測試樣本蛋白質含量的相同分析)獲得對照組含量。在其他範例中，蛋白質含量可從對照組群組的成員獲得，並以計算程序分析結果而獲得表示在對照組群組中蛋白質含量的對照組含量(預設的含量)。
由候選個體獲得樣本中的生物標誌的含量與本文所述的參考數值進行比較，可確認候選個體是否患有或與預後不良有關的目標癌症風險。例如，如果在候選個體樣本中生物標誌的含量相較於參考數值增加，候選個體可判定患有與預後不良有關的目標癌症或風險。當參考數值所代表個體群體中生物標誌含量的數值範圍係為帶有癌幹細胞及/或有癌症預後不良時，候選者的樣本中生物標誌的數值落入該範圍內表示候選個體患有與預後不良相關的目標癌症或風險。
本文使用「含量的提升」或「高於參考數值的含量」表示生物標誌含量高於參考數值，例如在對照組樣本中生物標誌的含量的預先確定的閥值。本文所述的對照組的含量。提升的生物標誌含量包含生物標誌含量為，例如，1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更高於參考數值。在一些實施例中，在測試樣本中生物標誌含量至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、300、400、500、1000、10000-倍或更高於參照樣本中生物標誌含量。
在一些範例中，該生物標誌包含CD14。相較於對照組個體相同類型的樣本，在例如人類患者的候選個體所獲得的樣本有CD14之存在(膜-結合及/或可溶性的CD14)或在該樣本中提升CD14的含量，表示在候選個體中癌症幹細胞的存在，亦表示癌症預後不良。
在一些範例中，生物標誌可進一步包含CD44。從候選個體所獲得的樣本有CD14的高表現量，選擇性地結合本文所述的CD14的含量提升，表示在候選個體中有癌症幹細包的存在，其亦表示其癌症預後不良。在一些範例中，CD44高表現量是指高於預設預設的含量的表現量，例如，不少於相對應目標癌症的中位數風險分數。
在一些實施例中，候選個體是患有目標癌症(如：例如是NSCLC的肺癌、肝癌、結腸癌、或胰腺癌)的症狀的患者。例如，患有疲勞、咳嗽、氣短、胸痛、食慾不振、體重減少、聲音嘶啞、咳血、慢性支氣管炎、慢性肺炎、喘息、或其組合。在其他實施例中，該個體在收集樣本時未患有目標癌症症狀、未患有目標癌症症狀的歷史、或未有目標癌症歷史。在其他實施例中，該個體對化學治療、放射線治療、免疫治療、或其組合具有抵抗性。
在本文所述的方法中所判斷的個體因帶有目標癌症的癌症幹細胞或患有目標癌症(如：與預後不良有關的肺癌)可給予合適的治療，例如本文所述的化學治療。
本文所述的分析方法及套組可應用於評估例如是本文所述目標癌症治療效果，考慮生物標誌含量及該癌症之間的相關性。例如，可從進行治療之前及之後或治療過程中的個體收集多種生物性樣本(如：組織 樣本或體液樣本)。經由任何本文所述的分析方法測量生物標誌的含量，且因此檢測生物標誌的數值(如：量)。例如，如果提升的生物標誌含量表示患有肺癌的個體，且生物標誌含量在治療後或治療過中降低(後來收集的樣本中生物標誌含量相較於較早收集的樣本中生物標誌含量)，其表示治療的效果。在一些範例中，該治療涉及治療試劑的有效量，例如化學治療試劑。該化學治療試劑的範例包括但不限於，卡鉑(carboplatin)(Paraplatin)或順鉑(Platinol)、多西他賽(Docefrez，Taxotere)、吉西他濱(Gemzar)、白蛋白結合型紫杉醇(Abraxane)、紫杉醇(Taxol)、培美曲塞(Alimta)、以及長春瑞濱(Navelbine)。
如果該個體判斷為對治療沒有反應，則將治療試劑的更高劑量及/或頻率劑量給予判斷的個體。在一些實施例中，治療試劑的劑量或頻率劑量為維持、降低或停止。或者，不同治療可應用於發現對第一治療沒有反應的個體。
在其他實施例中，生物標誌或生物標誌組的數值亦可依賴於判斷可治療的本文所述那些目標癌症，例如是化學治療試劑。為進行該方法，經由合適的方法在從患有目標癌症個體收集的樣本中(如：組織樣本或體液樣本)測量生物標誌含量，如：本文所述那些例如是西方墨點或RT Q-PCR分析。如果生物標誌含量相較於參考數值為提升，其表示化學治療試劑可能有效治療疾病。如果疾病被判斷為敏感於(可治療)化學治療試劑，該方法可進一步包含給予患有該疾病個體有效劑量的化學治療試劑，例如卡鉑(carboplatin)(Paraplatin)或順鉑(Platinol)、多西他賽(Docefrez， Taxotere)、吉西他濱(Gemzar)、白蛋白結合型紫杉醇(Abraxane)、紫杉醇(Taxol)、培美曲塞(Alimta)、以及長春瑞濱(Navelbine)。
同樣地，在本發明揭露的範圍內評估如本文所述目標癌症嚴重性的方法。例如，如本文所述，目標癌症可處於靜止狀態(緩解)，在期間該個體不會經歷疾病的症狀。例如，肺癌復發通常是復發性的發作，其中該個體可經歷肺癌症狀包括但不限於，疲勞、咳嗽、氣短、胸痛、食慾不振、體重減少、聲音嘶啞、咳血、慢性支氣管炎、慢性肺炎、喘息、或其組合。在其他實施例中，一個或多個生物標誌含量是標示該個體是否將經歷、或很快經歷目標癌症的復發(如：肺癌復發)。在一些實施例中，該方法涉及與從患有目標癌症的個體獲得的樣本中的生物標誌含量比較來自相同個體的樣本中的生物標誌含量，例如在緩解時獲自相同個體的樣本或復發期間時獲自相同個體的樣本。
非臨床應用
再者，本文所述任何CSC生物標誌的含量可應用於非臨床用途，例如為研究目的。在一些實施例中，本文所述的方法可應用於癌幹細胞的行為及/或機制(如：涉及癌症發展及/或轉移的癌幹細胞之新穎生物途徑或過程的發現)。
在一些實施例中，如本文所述生物標誌組的含量可用於肺癌新治療的發展。例如，測量從給予新治療(如：臨床試驗)個體中獲得的樣本之生物標誌的含量。在一些實施例中，生物標誌組的含量可表示新治療之前、之中或之後個體的癌症新治療或發展的效果。
再者，本文所述一個或多個CSC生物標誌可使用於增加癌幹細胞，其可用於各種目的，包含癌症生物學研究以及專一性於目標癌幹細胞的新型抗癌症試劑開發。本文使用「增加肺癌幹細胞」用語表示從生物性樣本分離或分開的肺癌幹細胞，使得在生物性樣本中肺癌幹細胞完全不含其他物質。在一些實施例中，增加癌幹細胞包含從非幹細胞中分開肺癌幹細胞。
測量蛋白質生物標誌的套組及檢測裝置
本文亦提供用於測量本文所述一個或多個生物標誌含量的套組及檢測裝置。該套組或檢測裝置可包含一個或多個專一性結合至目標生物標誌的結合試劑，如表1所列。例如該套組或檢測裝置可包含至少一個選自於表1專一性於一個蛋白質生物標誌的結合試劑。在一些範例中，該套組或檢測裝置包含專一性於二個或多個本文所述的蛋白質生物標誌成員的結合試劑。
在一些實施例中，一個或多個結合試劑(如：檢測試劑)可為專一性結合於蛋白質生物標誌組的抗體。在一些實施例中，一個或多個結合試劑為適合體(aptamer)，例如專一性蛋白質結合生物標誌組的胜肽適合體或寡核苷酸適合體。
在一些實施例中，套組進一步包含用於檢測結合於蛋白質生物標誌組試劑之檢測試劑(如：結合至結合試劑的抗體)。檢測試劑可結合於標記。在一些實施例中，該檢測試劑為專一性結合於至少一個結合試劑的抗體。在一些實施例中，該結合試劑包含判斷為標籤(tag)，並且直接或間接地被檢測試劑結合。
在套組或檢測裝置中，一個或多個結合試劑可固定於支撐構件上，如：膜、珠、玻片、或多孔盤上。選擇適當用於分析的支撐構件將依照各種因素考慮例如樣本數目與接合於試劑的標記釋放信號的偵測方法。
在一些實施例中，支撐構件為膜，例如硝化纖維膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或乙酸纖維膜。在一些範例中，該分析可為一西方墨點分析形式或一核酸晶片分析形式。
在一些實施例中，支撐構件為多孔盤，例如是ELISA盤。在一些實施例中，本文所述免疫分析可於高通量平台進行。在一些實施例中，可使用於高通量免疫分析的多孔盤，如：24-、48-、96-、384-或更多孔盤。每個免疫分析可在每個孔洞中並行進行。因此，通常所需使用盤式讀取器以測量增加分析通量並行地的多孔。在一些實施例中，盤式讀取器能用於平台的並行地多孔(如：4、16、24、48、96、384、或更多孔洞)成像。例如，商業上可獲得之盤式讀取器(如：可從Perkin Elmer可獲得盤式視覺系統，Waltham，MA)。該盤式讀取器可為以動力為基礎螢光分析。該盤式視覺系統具有光學高收集效率，並具有用於並行96孔分析的特別光學。其他合適的並行盤式讀取器包含半不限於SAFIRE(Tecan，San Jose，CA)、FLIPRTETRA®(Molecular Devices，Union City，CA)，FDSS7000(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)以及CellLux(Perkin Elmer，Waltham，MA)。
該套組亦可包含一個或多個如本文所述的緩衝液但不限於塗佈緩衝液、封閉緩衝液、洗滌緩衝液、及/或終止緩衝液。
在一些實施例中，該套組可包含依據本文所述任何方法使用操作手冊。所包括的操作手冊可包含關於如何使用套組中的成分，以測量例如是人類患者的個體生物性樣本中其生物標誌組(如蛋白質或核酸)。
關於套組使用方式的操作手冊通常包含進行本文所述分析方法關於每種組分的量及合適條件之資訊。在套組中的組分可以單位劑量、散裝包裝(如：多劑量包裝)、或亞-單位劑量。本文揭露的套組中提供的操作手冊通常為在標記或包裝說明(如：包含在套組中紙張)的書面操作手冊，但可讀取的機器操作手冊(如：在磁性或光學儲存光碟)亦為可接受的。
該套組的標記或包裝說明皆顯示其用於評估生物標誌組的含量，可提供操作手冊進行任何本文所述的方法。
本發明之套組係具有合適的包裝。合適的包裝包含，但不限於，樣本瓶(vials)、大瓶(bottles)、罐(jars)、有彈性的包裝(如：密封的Mylar或塑膠袋)以及類似物。同時亦考慮到用於例如是PCR機器、核酸分析、或流式細胞法系統的特定裝置可結合的包裝。
套組通常可提供其他組件例如解釋性的資訊、對照組及/或標準或參照樣本。通常，套組包含容器及與容器上或有關的標記或包裝說明。在一些實施例中，本發明提供包含本文所述套組內容的文獻。
癌症治療
使用如本文所述方法判斷，處於高風險或患有本文所述肺癌(如：其與預後不良有關的肺癌、肝癌、結腸癌、或胰腺癌)的個體，可用任何合適的治療試劑治療。在一些實施例中，所提供的方法包含個體基於所述方法所產生的結果如：測量生物標誌組的含量所選出的治療。
在一些實施例中，該方法包含基於分析結果如：生物標誌檢測給予個體選擇一種或兩種的治療試劑，如：化學治療、放射線治療、外科手術治療及/或免疫治療。
在一些實施例中，給予個體一次或多次治療試劑。治療試劑可與其他治療一起給予，作為用於治療肺癌組合治療的一部分，如：化學治療、放射線治療、外科手術治療及/或免疫治療。如化學治療及放射線治療的組合治療可以多種不同態樣提供。第一治療可在給予其他治療之前或後給予。在一些情況下，第一治療或其他治療(如：治療試劑)同時、或時間上接近(如：治療之間的短時間間隔，例如相同治療療程期間)給予。第一試劑及其他治療亦可於更長的時間間隔給予。
在一些實施例中，給予個體化學治療。例如化學治療試劑範例包括但不限於，卡鉑或順鉑、多西他賽、吉西他濱、白蛋白結合型紫杉醇、紫杉醇、培美曲塞、以及長春瑞濱。
在一些實施例中，給予個體放射線治療。放射線治療包括但不限於，電離輻射、γ-輻射、中子束放射療法、電子束放射療法、質子療法、近距離放射療法、全身放射線同位素和放射增敏劑。
在一些實施例中，給予個體外科手術治療。外科手術治療包括但不限於，肺葉切除術、楔形切除術、肺段切除術和全肺切除術。
在一些實施例中，給予個體一免疫治療試劑。在一些實施例中，該免疫治療試劑為PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑。在一些實施例中，免疫治療試劑為保疾伏(Nivolumab)。在一些實施例中，免疫治療試劑為Pembrolizumab。
其他化學治療的範例包括但不限於，鉬酸化試劑，例如卡鉑(Carboplatin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、順鉑(Cisplatin)、奈達鉑(Nedaplatin)、沙鉑(Satraplatin)、洛匹鉑(Lobaplatin)、三磷酸腺苷(Triplatin)、四硝酸酯(Tetranitrate)、吡鉑(Picoplatin)、普羅林酸(Prolindac)、阿樸素(Aroplatin)以及其他衍生物；拓撲異構酶I抑製劑(Topoisomerase I inhibitors)，例如喜樹鹼(Camptothecin)、拓撲替康(Topotecan)、伊立替康(irinotecan)/SN38、魯替康(rubitecan)、貝洛替康(Belotecan)以及其他衍生物；拓撲異構酶II抑製劑(Topoisomerase II inhibitors)，例如：依托泊苷(Etoposide)(VP-16)、柔紅黴素(Daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)試劑(如：脂質體中多柔比星、多柔比星HCl、阿黴素類似物、或多柔比星及其鹽或類似物在)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、阿柔比星(Aclarubicin)、表柔比星(Epirubicin)、伊達比星(Idarubicin)、氨柔比星(Amrubicin)、安吖啶(Amsacrine)、吡柔比星(Pirarubicin)、戊蘆比星(Valrubicin)、柔紅黴素(Zorubicin)、替尼泊苷(Teniposide)及其他衍生物；抗代謝藥(Antimetabolites)，例如葉酸類(Folic family)(甲氨蝶呤(Methotrexate)、培美曲塞(Pemetrexed)、雷替曲塞(Raltitrexed)、氨基喋呤(Aminopterin)以及關係物)；嘌呤拮抗劑(硫鳥嘌呤(Thioguanine)、氟達拉濱(Fludarabine)、克拉屈濱(Cladribine)、6-巰基嘌呤(6-Mercaptopurine)、噴司他丁(Pentostatin)、氯法拉濱(clofarabine)以及關係物)以及嘧啶拮抗劑(阿糖胞苷(Cytarabine)、氟尿苷(Floxuridine)、阿扎胞苷(Azacitidine)、替加氟(Tegafur)、卡莫福(Carmofur)、卡那黴素(Capacitabine)、吉西他濱(Gemcitabine)、羥基脲(hydroxyurea)、5-氟尿嘧啶(5FU)以及關係物)；烷化試劑，例如是氮芥類物質(例如環磷酰胺(Cyclophosphamide)、美 法崙(Melphalan)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、氮芥(mechlorethamine)、異環磷酰胺(Ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、三氟乙酰胺(Trofosfamide)、Prednimustine、苯達莫司汀(Bendamustine)、烏司他汀(Uramustine)、雌莫司汀(Estramustine)以及關係物)；三氮烯(Triazenes)(例如是達卡巴嗪(Dacarbazine)、阿曲他明(Altretamine)、替莫唑胺(Temozolomide)以及關係物)；烷基磺酸鹽(Alkyl sulphonates)(例如是白消安(Busulfan)、甘露聚醣(Mannosulfan)、Treosulfan以及關係物)；甲基芐肼(Procarbazine)；(Mitobronitol)以及氮丙啶(Aziridines)(例如是Carboquone、Triaziquone、ThioTEPA、三亞乙基胺(triethylenemalamine)以及關係物)；抗生素，例如羥基脲(Hydroxyurea)、蒽環類抗生素(Anthracyclines)(例如是多柔比星、柔紅黴素、表柔比星和其他衍生物)；蒽二酮(Anthracenediones)(例如是米托蒽醌(Mitoxantrone)以及關係物)；鏈黴菌家族(例如是博來黴素(Bleomycin)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、放線菌素(Actinomycin)、普卡黴素(Plicamycin))；和紫外線。
在未有進一步說明的情況下，本發明領域中具有通常知識者能夠基於上述說明，以最大程度地實現本發明。以下為特定實施例，因此僅為例示，不能以任何方式限制本發明之其餘部分。本說明書引述的所有已公開文獻，皆以參考用途或作為本說明書參考標的之方式併入本說明書。
實施例
實施例1：確認相較於原發性肺癌細胞肺癌幹細胞(CSCs)蛋白質差異性地存在
材料與方法
肺癌細胞珠
人類非小細胞肺癌細胞株NCI-A549,EKVX,PC9及HCC827，取自國家癌症研究所(國家衛生研究院，Bethesda，MD，USA)或美國菌種保存中心(簡稱ATCC，Manassas，VA，USA)。人類肺癌細胞株(CLS1,CL100,CL141 and CL152)係自具有腺癌之肺癌患者的初代培養所建立。細胞培養於添加10%胎牛血清RPMI 1640培養基，並於37℃加濕環境、維持20% O2與5% CO2中培養。
培養CSCs以及CAFs的共培養系統
從肺癌患者新鮮切除的肺腫瘤組織中建立人肺CSCs以及CAFs。在切除後30分鐘內收穫腫瘤以及配對的正常組織，以使用修飾步驟分離原發性肺CSC、CAF以及NF培養物。肺CSCs是從NSCLC患者的切除組織的癌症相關區域中分離且與飼養細胞培養及維持，即：基質纖維母細胞。樣本依據核可的人類受試者研究之IRB協議採購並實行。所有患者均獲得書面知情同意書。非癌症相關間質經由病理學家採樣，係在病理切除後30分鐘內，距離腫瘤性病變(在無菌條件下)至少5cm處採樣，在外科手術切除及隨後的組織分析時以肉眼檢查。
該組織以先前研究所述參數操作並有些許修飾。簡短地說，將該組織絞碎並在脫氧核糖核酸1(deoxyribonuclease 1；1mg/ml；Bioshop)以及蛋白酶(1mg/ml；Sigma)的存在下在S-MEM培養基(GIBCO)中以4℃培養6~12小時。在消化之後，細胞團塊經過40-μm的細胞過濾器(Falcon)過篩，以得到單一細胞的懸浮物。收集到的細胞以不同的細胞密度(5×105)在24孔培養盤培養，培養基為修改培養條件之添加10%胎牛血清的RPMI1640 中，並培養於37℃含有20% O2與5% CO2之加濕空氣中。在30天的培養之後，可在間質細胞周圍辨識出類似球形的群落。將該些類似球形的細胞，以前述經修改的方式續行培養。7~10天後，以溫和地離心(58g)收集該些球體，並以酶分解(10分鐘0.05%胰蛋白酶、0.53mM EDTA；Invitrogen)，再利用機械性地破壞。收集通過100-μm篩網的肺CSCs，並以顯微分析單一細胞的狀態。該單一細胞，密度為5,000個存活的細胞/ml，置入有預先植入CAF作為餵養者的培養盤內(5×105細胞/孔)。對於單一細胞/孔的繁殖實驗(clone experiments)來說，該些細胞利用一細胞分選器(FACS Ariel)培養於96孔盤中，且孔內已預先植入餵養細胞(2,000個細胞/孔)。肺癌幹細胞之續培養如先前研究所述並有些許修改的方式實行。簡短地說，經由溫和地離心(800rpm)收集球體、酶消化(10分鐘的0.25%胰蛋白酶、1mM EDTA；Invitrogen)，以及機械性破壞。從通過100-μm過濾器分離得肺癌幹細胞，篩過的細胞以顯微鏡分析。該些單一細胞以5,000個存活細胞/ml的密度培養於10-cm的培養盤中，該培養盤有預先植入癌相關纖維母細胞餵養細胞(5×105個細胞/孔)。
以影像為基礎的高通量分析
將肺CSC或癌症細胞(200個細胞/孔)加入至預先植入CAFs(2,000個細胞/孔)的96孔盤中並且使其附著於盤中過夜。在不同處理之後，針對Nanog(ReproCELL；1：300)之一級抗體(作為癌幹細胞標誌)以及小鼠抗人類CD90 FITC-結合(5E10；BD Pharmingen；1：100)抗體(作為CAF標誌)在4℃過夜。接者，該一級抗體與TRITC-結合二級抗體[山羊抗-兔子IgG(H+L)結合物；Invitrogen]在室溫下培養2小時。使用赫斯特(Hoechst) 33342染料進行細胞核複染。為確定二級抗體的背景螢光程度，每盤包含僅含有二級抗體的對照孔洞(使用Hoechst 33342染料染色)。使用自動熒光顯微鏡平台獲得染色細胞的圖像。
圖像採集及分析
有染色的細胞利用設有4x物鏡之高通量分析平台擷取。每孔12個視野，每個波長的影像皆擷取並結合(montaged)以供進一步的影像分析。利用MetaXpress®軟體(Molecular Devices)分析影像。首先，以多重波長細胞分選器判定癌細胞核(未有FITC染色的細胞，CD90-)。將影像中癌細胞核的部分利用形態過濾器(Morphology Filters)擴大(dilated)並平滑化，以創造一個細胞簇遮罩。將TexRed染色的陽性細胞確定為Nanog-陽性細胞。
即時反轉錄(RT)Q-PCR
與幹性相關基因之表現程度，以及CAF、CLS1/CAF及CLS1之Affymetrix晶片數據的驗證，係利用ABI Prism 7900定序儀(Applied Biosystems)經由RT Q-PCR實行。利用Primer Express 3.0(Applied Biosystems)所設計的引子(表2)。使用β-肌動蛋白作為內部控制。以β-肌動蛋白標準化表現量且定義為-△CT=-[CTtarget-CTβ-actin]。計算相對表現量比率為相對內部控制(2-△△CT)的改變倍數。實驗以三重複進行。
Figure 110110084-A0101-12-0031-2
Figure 110110084-A0101-12-0032-3
脂肪細胞的分化
為檢測癌幹細胞是否能分化為脂肪細胞譜系，CLS1細胞與CAFs共培養，以及間充質幹細胞作為陽性對照組，以脂肪生成分析(Millipore，Cat.#SCR020)的步驟進行檢查。簡而言之，在24-孔盤中以添加10% FBS、100U/ml青黴素以及100μg/ml鏈黴素的RPMI 1640培養基中接種6×104個細胞/孔細胞密度之細胞。在達到細胞緻密之後，用於脂肪生成細胞培養在添加1μM地塞米松(dexamethasone)、10μg/ml胰島素、以及0.5mM異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine，IBMX)的脂肪生成的基本生長培養基組成的脂肪誘導培養基(Millipore，Cat.#SCR020)。培養基每3天換一次。在培養21天後，使用4%PFA固定細胞評估脂肪細胞的形成，使用在室溫下油紅O染料染色50分鐘。使用Axiovert 200顯微鏡拍攝照片。經由脂肪細胞分化時分析基因表現，從在脂肪細胞收集總mRNA。如本文所述的樣本針對過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)以及脂蛋白脂肪酶(LPL)進行即時RT-PCR。
成骨細胞的分化
為測試癌幹細胞是否能分化為成骨生成系，CLS1細胞與CAFs共培養，以及間充質幹細胞作為陽性對照組，使用添加有0.1μM地塞 米松、0.2mM抗壞血酸2-磷酸以及10mM甘油2-磷酸的基本成長培養基培養14天以成骨細胞分析(Millipore，Cat.#SCR028)的步驟進行檢查。簡而言之，在塗覆玻連蛋白/膠原蛋白24-孔盤中以添加10% FBS、100U/ml青黴素以及100μg/ml鏈黴素的RPMI 1640培養基中接種6×104個細胞/孔細胞密度脂細胞。每3天換一個次培養基。在14天後，細胞以PBS清洗兩次以及在室溫下以冰冷70%乙醇固定1小時。在室溫下經由茜素紅S(Mippipore，Cat.#2003999)染色30分鐘進行分析。為在成骨細胞分析過程中的基因表現，在成骨細胞分化培養基中生長的細胞獲得的總mRNA經過0、3、或7天的分化過程中。該些樣本針對AP以及骨鈣蛋白(OC)進行即時RT-PCR。
膜蛋白質組分析
膜蛋白質樣本係萃取自CLS1細胞有或無與CAFs共培養而得，並將樣本給予內部標準品、凝膠-輔助分解、以及LC-MS/MS三重覆分析。經由中央研究院化學所陳玉如博士實驗室發展的IDEAL-Q軟體對細胞株進行三重覆LC-MS/MS無標記定量。經由標準化胜肽比率加權平均值確定胜肽的比率。
基因表現圖譜
依據製造商的步驟從AffymetrixGeneChip系統(Affymerix,Inc.，Santa Clara，Ca，USA)獲得CLS1/CAF以及CLS1的基因表現圖譜。依據製造商的步驟使用AffymetrixGeneChip系統(Affymerix，Inc.，Santa Clara，Ca，USA)進行基因表現圖譜。
晶片數據係經由國立臺灣大學基因醫學微陣列核心設備(National Taiwan University Microarray Core Facility for Genomic Medicine)處 理。簡而言之，使用從CAFs、肺CSCs以及癌症細胞分離總RNA以利用T7-(dT)24引子產生cDNA(SuperscriptChoice System，Gibco BRL Life Technologies)。使用BioArray高產量RNA轉錄標記套組(EnzoDiagnostic,Inc.)合成生物素-標記核糖核苷酸並雜交至人類基因體U133 Plus 2.0晶片(Affymetrix)上。
結果
當與CAF飼養細胞共培養時肺CSCs維持癌症幹性以及高致瘤性
相較於原發性肺癌細胞，在肺癌幹細胞中(CSCs)中判斷蛋白質差異性地存在。CAF-共培養CLS1細胞(CLS1/CAF)維持Nanog+細胞(圖1(A))的高群體，具有分化為脂肪細胞及成骨細胞的能力(圖1(B)以及(C))，以及當注射較低細胞數(<100細胞數)時在異種移植小鼠中具有產生腫瘤的能力(圖1(D))。然而，當在傳代的過程中移除CAFs時，該細胞幹性特性喪失，在Nanog陽性群體明顯地減少(圖1(A))以及腫瘤初始頻率1/11至1/1774減少(圖1(D))。因此，CSCs/CAFs共培養模組提供用於培養癌幹細胞及維持癌症細胞幹性的平台。
相較於原發性肺癌細胞在CSCs中存在CD14及CD44高含量
為確認CSCs的細胞表面蛋白與周圍CAFs作用，我們經由CSC標誌篩選策略進行CSCs/CAFs及分化癌症細胞的轉錄體(transcriptomic)及膜蛋白質體圖譜(圖1(E))。該分析表現出在CSCs/CAFs中CD14及CD44細胞表面蛋白質為向上調節。後續分析著重於在CSCs/CAF中圖譜數據最相關的CD14及CD44蛋白質(上述表1)。
為研究候選CSC標誌，CD14及CD44表現與從公開日本對列(published Japan cohort)的152個第一期肺癌患者的臨床風險比值有關。該結果顯示與CD14低表現量的患者比較，在腫瘤細胞中CD14高表現量的患者表現出顯著較差的未復發存活率(P<0.05，Kaplan-Meier檢定；圖1(F))。患者預後的CD14及CD44分析顯示與在腫瘤細胞中CD14及CD44低表現量的患者比較，在腫瘤細胞中CD14及CD44的高表現量的患者表現出差的未復發存活率(CD14+CD44，P<0.05，Kaplan-Meier檢定；圖1(F))。
實施例2：CD14與CD44預後不良的相關性
材料與方法
患者以及腫瘤樣本
肺腫瘤組織樣本自以組織學確認1995年12月28日與2005年12月26日之間在臺灣大學附設醫院(臺北，臺灣)經完整手術切除之NSCLC的患者(N=80)取得。本研究經由臺灣大學機構審查委員會(201103028RC)允許。參與的患者係分類於第I期，且其先前並未以新輔助化學治療(neoadjuvant chemotherapy)或是放射線治療。所有患者提供知情的同意書。所有的樣本以福馬林固定、切片、以H&E染色並以顯微鏡檢測。術後的病理分期係依據肺癌的國際分期系統。
肺癌患者腫瘤樣本之免疫化學分析
依據標準步驟及本文所述的修飾步驟進行腫瘤樣本之免疫化學分析。把CD14(clone EPR3653；Epitomics；稀釋1：400)以及CD44(clone DF1485；BioGenex；稀釋1：200)的雙重免疫化學染色。脫蠟及脫水後，使用1mM Tris-EDTA緩衝液進行5μm厚度的切片的熱媒介抗原恢復 (heat-mediated antigen retrieval)，每個切片10分鐘。使用過氧化氫及Ultra V Block阻斷之後，樣本在室溫下與第一抗體培養2小時。以TBST緩衝液(含有0.1% Tween 20的Trist緩衝液[TBS：50mM，pH 7.6])進行沖洗步驟。經由使用兔子抗-人類抗體(CD14)HRP-結合聚合物以及用於小鼠抗-人類抗體(CD44)鹼性磷酸酶-結合聚合物利用多景像(multivision)聚合物檢測系統(Thermo scientific，TL-012-MARH)進行雙重染色。用於Nanog蛋白質表現之IHC分析的切片，首先於抗原修復AR-10溶液(Biogenex)或抗原修復Citra溶液(Biogenex)中，以121℃高壓滅菌10分鐘。然後樣本以3% H2O2-甲醇處理並隨後與Ultra V Block(Lab Vision Corporation)培養10分鐘並與兔子單株抗-Nanog(D73G4，Cell signaling；1：300)於室溫下培養2小時。利用超靈敏非生物素聚合物HRP偵測系統(BioGenex)偵測免疫染色，依據原廠操作手冊進行。
結果
為確認在腫瘤發生的早期階段CD14以及CD44的臨床意義及重要性，從80個具有第一期NSCLC患者收集腫瘤樣本，每一樣本切片並經由IHC以抗CD14以及CD44抗體染色。在圖2(A)中顯示代表性組織切片。這些患者的臨床特徵整理於下表3以及表4。
Figure 110110084-A0101-12-0036-4
Figure 110110084-A0101-12-0037-5
Figure 110110084-A0101-12-0037-7
在腫瘤細胞中CD14的表現量進行評分，並將其二分為CD14蛋白質陽性及陰性表現量的分類。將CD44的表現量進行評分，並將其二分為高(分數≧平均值風險分數)或低(分數<平均值風險分數)CD44蛋白質表現分類。Cox比例風險回歸分析評估患者存活率相關的獨立預後因子(表5)。
Figure 110110084-A0101-12-0037-8
Figure 110110084-A0101-12-0038-10
結果顯示獨立預後因子包括CD14表現(風險比值(HR)=2.79，95%CI=1.29至6.03；P=0.009，Cox比例風險迴歸分析)以及CD44表現(風險比值(HR)=9.25，95% CI=3.78至22.64；P<0.0001，Cox比例風險迴歸分析)。與轉移相關的獨立預後因子為CD14表現(風險比值(HR)=2.63，95% CI=1.09至6.35；P=0.032，Cox比例風險迴歸分析)以及CD44表現(風險比值(HR)=5.89，95% CI=2.17至16.01；P<0.0001，Cox比例風險迴歸分析，表6)。
Figure 110110084-A0101-12-0038-11
Figure 110110084-A0101-12-0039-12
患者預後之CD44與CD14表現量合併及個別效果的分析顯示，與在腫瘤細胞中CD44及CD14低表現量患者相較，腫瘤細胞中CD44及CD14高表現量患者顯示最差整體(CD44+CD14，P<0.0001，Kaplan-Meier分析；圖2(B)；HR=3.33，95% CI=2.12至5.24；P<0.0001，Cox比例風險回歸分析；表5)及未復發存活率(CD14+CD44，P<0.05，Kaplan-Meier分析；圖2(C)；HR=2.88，95% CI=1.68至4.94；P=0.0001，Cox比例風險回歸分析；表6)。該些結果進一步顯示在早期NSCLC患者中CD44及/或CD14提供預測轉移的新穎預後指數(P=0.0001、Cox比例風險回歸分析)，以及整體存活率(P<0.0001、Cox比例風險回歸分析)，見表5及表6。
該些結果顯示相較於具有CD14及/或CD44低表現量的患者，在腫瘤組織中具有CD14及/或CD44高表現量的患者顯著地表示較差整體存活率以及未復發存活率。
實施例3：與CAFs共培養導致肺癌幹細胞CD44 + CD14 + 的富集性
材料及方法
免疫螢光顯微鏡
細胞在室溫以4%多聚甲醛(paraformaldehyde)磷酸鹽緩衝溶液(PBS)固定。依據標準免疫螢光步驟進行。在3%(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA)之PBS中做阻擾及雜交。使用針對Nanog(ReproCELL；1：300)之單株抗體(mAbs)、CD90 FITC-結合(5E10；BD Pharmingen；1：100)、CD44 FITC-結合(G44-26；BD Pharmingen；1：10)；以及CD14 PE-結合(HCD14；Biolegend；1：20)抗體皆有使用。利用Axiovert 200顯微鏡(Carl Zeiss，Göttingen，Germany)、共焦雷射掃描顯微鏡(C1si，Nikon，日本)搭配MetaXpress®(Molecular Devices)檢驗已染色的細胞。
西方墨點法分析
詳細的方法依標準步驟進行。Nanog(D73G4；1：1000)之一級抗體購自Cell Signaling Technology公司，CD44(MAB4073；1：1000)之一級抗體購自Cell marque以及CD14(EPR3653；1：1000)之一級抗體購自Cell marque。單株鼠抗β-肌動蛋白(Chemicon，Millipore；1：5000)用於作為負載控制。該膜以TBST沖洗三次，接著與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，簡稱HRP)結合的二級抗體(1：5,000)培養於含有2%脫脂牛奶之TBST。結合的抗體利用Enhanced Chemiluminescence System(Santa Cruz，CA)偵測。以Fujifilm LAS 3000系統(Fujifilm，Tokyo，Japan)擷取化學發光訊號。所有的實驗皆以至少三重複試驗實行。
超低球形成(Ultra-low sphere-forming)分析
依據標準步驟及本文所述的修飾步驟進行超低球形成分析。培養於添加20ng/ml EGF(Sigma)及20ng/ml bFGF(Invitrogen)之MCDB201無血清培養液(Invitrogen)肺CSCs之單一細胞懸浮液，植入超低附 著24孔培養盤內(Corning，Corning，NY，USA；200個存活細胞/孔)。每週二次於培養液內添加新鮮生長因子。三週後，利用Axiovert 200顯微鏡觀察所形成的球體。
結果
為驗證相對於分化的癌症細胞CSCs/CAD共培養膜組中增加的CD14及CD44表現，比較經由不同繼代培養與不含飼養細胞培養的CLS1-分化癌症細胞的基因表現圖譜之CLS1/CAF的基因表現圖譜。該比較顯示相較於不含CAFs的繼代培養，具有CLS1細胞的CAFs共培養會誘導CD14及CD44表現(圖3(A))。
進一步評估與各種來源腫瘤的CAFs共培養的肺癌細胞中CD14及CD44是否會增加，CAFs是從不同肺癌患者分離出來。來自不同癌症細胞株(A549及EKVX細胞)的雷射擷取群落細胞顯示CD14及CD44的較高表現量(圖3(B)及圖5(A))。從患者分離的12個CAF樣本的特性顯示於表7。
Figure 110110084-A0101-12-0041-13
免疫螢光染色及西方墨點法確認CD14及CD44主要在肺CSCs(CLS1/CAFs)中表現，而不是分化的CLS1細胞(圖3(C))。流式細胞法分析顯示在肺CSCs(CLS1/CAFs)中CD14及CD44高度表現(CD14：55%； CD44：98.1%)以及分化後CD44及CD14的表現量減少(CD14：11%；CD44：30.3%)(圖5(B))。確認在不同肺癌細胞株(A549、EKVX、PC9以及HCC827)以及原發性肺癌細胞株(CL25、CL83、CL97、CL100、CL141及CL152)中CD44陽性群體以及CD14/CD44雙重陽性群組百分比，結果顯示在不同肺癌細胞中CD44陽性群組是豐富的(79.6±29.7%)。圖6，CD14/CD44雙重陽性群組百分比在該些癌症細胞中顯著減少(19.0±23.9%)。該分析顯示CD44及CD14顯著代表在腫瘤利基(niche)中癌幹細胞標誌。
實施例4：CD44 Hi CD14 + 癌症細胞具有較高的腫瘤初始頻率
材料及方法
流式細胞法
通過流式細胞法分析及篩選癌幹細胞標誌的群體。用於人類抗體CD44 FITC-結合(G44-26；BD Pharmingen；1：10)以及CD14 PE-結合(HCD14；Biolegend；1：20)的抗體是商業上購買的。在室溫下PBS中肺癌細胞株及原發性肺癌細胞以CD14及CD44雙重染色30分鐘。30分鐘之後，染色的細胞洗滌過多的未結合抗體，並在篩選緩衝液(在PBS中1mM EDTA及2%FBS)中再懸浮。使用BD FACS AriaIII細胞分選儀(BectonDickinson)進行流動分選，並在FACSC(BectonDickinson)進行分析。為篩選樣品細胞以確認單一細胞篩選，經由前散射高度對前向散射寬度(FSC-H對FSC-W)以及側向散色面積對側向散色寬度(SSC-A對SSC-W)評估細胞團。經由碘化丙錠(PI，死亡細胞染色，Molecular Probes)細胞排除死亡細胞，其增加用於單一細胞實驗大量篩選、活性細胞的效果。
結果
測量在肺癌細胞株及原發性肺癌細胞中的CD44Hi及CD14+的腫瘤初始能力，其表示癌幹細胞操作上的定義。將有限的稀釋(1x104、1x103、以及1x102個細胞數/小鼠)篩選的肺癌細胞皮下注射至NOD/SCID/IL2Rγ_(NSG)小鼠。相較於CD44HiCD14-群組(1/278)，從肺癌細胞株中篩選的CD44HiCD14+群組會顯示較高的腫瘤-初始頻率(1/10)。CD44lowCD14+群組未確認。
測量在肺癌細胞株(CLS1以及A549細胞)及原發性肺癌細胞(CL100、CL141以及CL152)中篩選的CD44Hi及CD14+群組的腫瘤初始頻率。將有限的稀釋(1x104、1x103、以及1x102個細胞數/小鼠)細胞群組皮下注射至SCID小鼠。相較於CD44HiCD14-以及CD44LowCD14-群組的癌症細胞，在異種移植細胞中的CD44HiCD14+群組顯示較高的腫瘤-初始頻率(表8以及圖4(A)至(F))。該些結果建議肺癌細胞的CD44HiCD14+群組可為具腫瘤生成之腫瘤幹細胞。
Figure 110110084-A0101-12-0043-14
Figure 110110084-A0101-12-0044-15
本文所述的轉錄體(transcriptomic)及蛋白質體的分析判斷出相較於CAF培養，在CSC/CAF共培養中CD14及/或CD44以較高表現存在。本文所判斷的任何蛋白質，可使用作為用於肺癌幹細胞的生物標誌(個別或組合)，例如用於檢測在樣本中肺癌幹細胞的存在、判斷患有與預後不良有關的肺癌患者、選擇治療的候選標誌、監測肺癌進展、評估對抗癌症的治療效果、確認治療過程、評估個體是否處於癌症復發的風險、及/或為研究目的，包含如：基於新的癌症治療開發而研究肺癌的機制及/或與肺癌有關的生物路徑/過程。
實施例5：各種類型癌幹細胞的CD14表現
依據廠商的操作手冊，包含肝癌細胞、結腸癌細胞、以及胰腺癌細胞之各種癌症類型的細胞係利用PE-結合抗-CD14抗體(HCD14；Biolegend；在PBS中1：20)在室溫下染色30分鐘。使用同位素抗體作為用於未專一性結合的陰性對照組。然後使用PBS清洗該細胞以移除未結合的抗體，在篩選緩衝液PBS(在PBS中1mM EDTA及2%FBS)中再懸浮。利用螢 光活化細胞分選(FACS)系統使用BD FACSAsiaTM Fusion細胞分選儀(Becton Dickinson)進行流動分選。
如表9所示，在各種類型的癌症細胞中觀察CD14的表現。
Figure 110110084-A0101-12-0045-16
該研究結果表示CD14可使用作為各種類型的癌症細胞的生物標誌，如：癌幹細胞。
其他實施例
本說明書所揭露之所有特徵可以任何方式結合。本說明書中所揭露之每一特徵可以替代為相同、相等或是近似用途之另一個特徵。因此，除非明確聲明，所揭露的每一特徵僅為相等或近似特徵的廣泛系列中的一個例子。由上所述，本發明領域中具有通常知識者可輕易地確定本發明之必要技術特徵，且在不超過本發明之精神與範疇下，可多方改變與修飾本發明以供不同的用法與條件。因此，其他的實施方式亦包含於申請專利範圍內。
等同物及範圍
本發明領域中具有通常知識者將理解，或僅僅使用常規實驗所能確認本文所述的本揭露之具體實施例的很多等同物。本公開的範圍非受限上述揭露，而是如所附申請專利範圍所定義。
申請專利範圍中例如「一(a、an)」以及「該(the)」的用語可以表示一個或一個以上，除非上下文中指示相反情形或另有說明。如果一個、多於一個或所有的組成存在於、用於或以其他方式與給予的物或方法的相關物，則包含一個或多個組成之間的「或」申請專利範圍或揭露被認為是適合表述該情形的，除非上下文中指示相反情形或另有說明。本發明揭露包括該群組中的一個組成存在於、用於或以其他方式與給予的物或方法的相關實施例。本發明揭露包括其中多於一個或全部組成存在於、用於或以其他方式與給予的物或方法的實施例。
此外，應瞭解除非另有說明或除非對熟習此項技術者而言矛盾或不一致係顯而易見的，否則本發明揭露包含其中將一或多項所列申請專利範圍(之一或多種限制、要素、條款、說明性用語等引入附屬於相同基礎申請專利範圍(或任一其他相關申請專利範圍)之另一技術方案中的所有變化、組合及置換。如果以列表形式(例如，以馬庫西群組(Markush group)或類似格式)提出要素，則應瞭解，本發明亦揭示每個要素的亞組並且可自該群組中移除任何要素。應瞭解，通常，如果稱本揭露或本揭露之態樣包含特定要素、特徵等，則本發明之某些實施例或本發明之態樣由該等要素、特徵等組成或主要由其組成。為簡潔起見，在本文中未以過多語言具體陳述該等實施例之每一情形。應注意，「包括」及「包含」用語意圖開放及允許其他的要素或步驟內含物。當給定範圍的情況下，包含端點。此外，除非上下文中指示相反情形或另有說明以及本發明領域中具有通常知識者將理解，作為範圍表示的數值可以採用本揭露的不同實施方式中的所述範 圍內的任何具體數值或子範圍，除非上下文中另有指示，否則為該範圍的下限單位的十分之一。
本申請涉及各種已發表的專利，已公開的專利申請、期刊文章和其他出版物，所有這些文獻引用納入本文內。如果任何合併的參考文獻和本說明書之間有衝突，說明書應予以定義。另外，屬於現有技術的本公開的任何特定實施例可以明確地從任何一個或多個申請專利範圍中排除。因為這樣的實施例被認為是本發明領域中具有通常知識者已知的，所以即使排除沒有在本文中明確闡述，亦可以排除它們。無論是否涉及現有技術的存在，本公開的任何特定實施例都可以從任何申請專利範圍中排除。
本發明領域中具有通常知識者將認識到或能夠僅僅使用常規實驗來確定本文描述的特定實施例的許多等同物。前述之實施例係為了描述及說明本發明之技術特徵及其具體實施方式，使熟悉本發明領域中具有通常知識者可據以實施，而非意圖限定本發明之保護範圍。熟悉本發明技術領域者雖可輕易的據此對本發明作出些許的改變或潤飾，但此些改變將不脫離本發明申請專利範圍所界定之範疇。據此，本發明所請求之保護範圍係由申請專利範圍定義，而非經由實施說明及實施例之揭露內容所界定。
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Claims (9)

  1. 一種分析樣本的方法，該方法包含：
    (i)提供一疑似含有癌幹細胞的樣本，
    (ii)測量在該樣本中CD14的含量；以及
    (iii)測量在該樣本中CD44的含量；
    其中該樣本是有或疑似患有癌症之人類患者的一生物性樣本，該生物性樣本是體液樣本或組織樣本，該組織樣本是從一腫瘤位置或一疑似腫瘤位置所得到；基於CD14以及CD44的含量判斷在該樣本中癌幹細胞的存在，其中CD14以及CD44含量的提升是表示癌幹細胞存在於該樣本中；該癌症為肝癌或胰腺癌；該步驟(ii)及該步驟(iii)包含測量可溶式的或表現於細胞表面CD14及CD44的含量。
  2. 如請求項1的方法，其中該步驟(ii)包含測量CD14蛋白質的含量。
  3. 如請求項1或2的方法，其中該CD14蛋白質的含量是經由免疫組織化學(Immunohistochemistry)分析、免疫墨點法(immunoblotting)分析、或流式細胞儀分析所測量。
  4. 如請求項1的方法，其中該步驟(ii)包含測量編碼CD14核酸的含量。
  5. 如請求項4的方法，其中編碼CD14之核酸含量可經由一即時反轉錄PCR(real-time reverse transcription-PCR，RT-PCR)分析或一核酸晶片分析所測量。
  6. 如請求項1的方法，進一步包含判斷該人類患者的存活率，其中CD14含量的提升、或CD14以及CD44含量的提升是表示存活率差。
  7. 如請求項1或6的方法，進一步包含給予該人類患者一癌症治療。
  8. 一種檢測關於癌症預後不良的方法，包含：
    (i)提供一有癌症個體的樣本，
    (ii)測量在該樣本中CD14的含量，
    (iii)測量在該樣本中CD44的含量，以及
    (iv)判斷該個體是否為癌症預後不良，其中若在該樣本中CD14的含量以及CD44的含量兩者是高於一預設預設含量，則判斷該個體為癌症預後不良；該個體是有肝癌或胰腺癌的一人類患者；該步驟(ii)及該步驟(iii)包含測量可溶式的或表現於細胞表面CD14及CD44的含量。
  9. 一種增加癌幹細胞的方法，該方法包含：
    (i)提供一疑似含有癌幹細胞的樣本，以及
    (ii)從該樣本分離CD14+細胞或CD14+/CD44Hi細胞；
    其中該癌幹細胞是胰腺癌幹細胞；CD14及CD44是可溶式的或表現於細胞表面。
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