CN112384806A - 癌症的骨转移诊断用组成物及包括其的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明的组成物及试剂盒能够检测在癌症的微细骨转移阶段中游离的血中循环造骨细胞的生物标志物的骨钙素(Osteocalcin)及N‑钙粘蛋白(N‑cadherin)，从而能够在早期诊断骨转移癌症。并且，通过本发明的为癌症的骨转移早期诊断的信息提供方法能够提高骨转移癌症患者等的生存率。

Description

癌症的骨转移诊断用组成物及包括其的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种癌症的骨转移诊断用组成物及包括其的试剂盒。
背景技术
骨转移癌是恶性肿瘤破坏骨组织，无论是何种癌症一旦被确诊后预后迅速地恶化的情况很多。其形成最大原因是目前在诊断骨转移癌时利用的影像检查时期很长。实际上经常发生骨转移的乳房癌中，为了其预防和早期诊断，在初期治疗结束后通常进行5年荷尔蒙抑制疗法，并以6-12个月的间隔反复拍摄“骨扫描”。但，没有疼痛、骨折、神经压迫等症状的情况下通过骨扫描诊断的时候也大部分是已经发生骨骼破坏，因此，对于治疗的反应不佳。
一般而言，骨转移癌分为休眠期阶段、微细骨转移阶段、临床骨转移阶段。
在休眠期阶段中，癌细胞只生存于骨细胞，在癌细胞与骨细胞之间并不发生相互作用。但，在微细骨转移阶段中癌细胞与破骨细胞发生相互作用，而细胞发生繁殖。在临床骨转移阶段中，癌细胞和破骨细胞将破坏骨组织，而出现疼痛、骨折等症状。
以往利用影像检查的癌症的骨转移诊断只能在临床骨转移阶段中进行，此时，肿瘤已经开始扩散而难以进行有效的治疗，并且，存在只能在发生骨组织的形态学变化后进行诊断的限制。因此，需要一种在微细骨转移阶段中骨组织被破坏之前能够通过早期诊断进行有效治疗的诊断用组成物、试剂盒或用于诊断的信息提供方法。
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的为提供一种能够在初期步骤诊断癌症的骨转移的诊断用组成物及试剂盒。
并且，本发明的目的为提供一种用于癌症的骨转移诊断的信息提供方法。
解决问题的技术方案
1.一种包括用于检测骨钙素(Osteocalcin)的物质的癌症的骨转移诊断用组成物。
2.根据1所述的癌症的骨转移诊断用组成物，还包括：用于检测N-钙粘蛋白(N-cadherin)的物质。
3.根据1所述的癌症的骨转移诊断用组成物，检测所述骨钙素的物质为选自由抗体、适体、DNA、RNA、蛋白质、多肽形成的群中的至少一个。
4.根据2所述的癌症的骨转移诊断用组成物，用于检测所述骨钙素的物质及用于检测所述N-钙粘蛋白的物质为相互独立地选自由抗体、适体、DNA、RNA、蛋白质、多肽形成的群的至少一个。
5.根据1所述的癌症的骨转移诊断用组成物，所述癌症为选自肝癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳房癌、子宫癌、大肠癌、结肠癌、血癌、卵巢癌、前列腺癌、胰子癌、脾脏癌、睾丸癌、胸腺癌、脑癌、食道癌、肾癌、胆管癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌或皮肤癌中的至少一个。
6.根据1所述的癌症的骨转移诊断用组成物，所述癌症为乳房癌或甲状腺癌。
7.一种包括1至6中的任一项的组成物的癌症的骨转移诊断用试剂盒。
8.一种包括检测从诊断对象分离的试料内骨钙素的步骤的用于癌症的骨转移诊断的信息提供方法。
9.根据8所述的用于癌症的骨转移诊断的信息提供方法，还包括：检测所述试料内N-钙粘蛋白的步骤。
10.根据8所述的用于癌症的骨转移诊断的信息提供方法，所述癌症为选自肝癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳房癌、子宫癌、大肠癌、结肠癌、血癌、卵巢癌、前列腺癌、胰子癌、脾脏癌、睾丸癌、胸腺癌、脑癌、食道癌、肾癌、胆管癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌或皮肤癌的至少一个。
11.根据8所述的用于癌症的骨转移诊断的信息提供方法，所述癌症为乳房癌或甲状腺癌。
发明的效果
本发明可通过非骨扫描的更加简单的方法诊断癌症的骨转移，极大地提前了骨转移癌的诊断时间，而能够大幅提高患者的生存率。
附图说明
图1为表示本发明的用于癌症的骨转移早期诊断的信息提供方法的一示例的附图，通过乳汁细胞分析将癌症患者血液中骨钙蛋白+或骨钙蛋白+N-钙粘蛋白+循环造骨细胞定量的附图。
图2为表示在骨转移乳房癌白鼠模型构建及相应模型中第2周、第3周、第5周的生物发光成像(bioluminescence imaging；BLI)、病理组织检查的附图。
图3的(A)为表示骨转移癌在基础标记指数(BLI)中是从第5周开始能诊断，但，循环造骨细胞是从第2-3周开始能诊断的图表；(B)为表示肿瘤大小与循环造骨细胞数(％)是正比关系的附图。
图4是向白鼠左心室注入乳房癌细胞株而构建与实际骨转移乳房癌患者最相似的白鼠模型，并进行各个日期生物发光成像(bioluminescence imaging；BLI)测定及骨钙蛋白+循环造骨细胞的乳汁细胞分析的附图。
图5为表示利用其它白鼠种类和其乳房癌细胞株构建白鼠模型，并区分为骨转移群和对照群进行骨钙蛋白+循环造骨细胞的乳汁细胞分析的附图。
图6为表示根据转移性乳房癌患者中是否发生骨转移的骨钙蛋白+循环造骨细胞数的附图。
图7为在未发生病变的稳定(stable)群和正在持续性地发生病变的渐进(progressive)群中，根据骨转移病变的活性(active)或非活跃(inactive)进行循环造骨细胞分析的附图。
图8为决定可预测骨转移病变的发生的最佳截止点(cut-off)，并根据其将骨转移癌患者分为两个组，进行无进展生存期(Progression-free survival，PFS)分析的附图。
图9的(A)为在转移性甲状腺癌患者中根据cOC％分析当时骨转移病变活性与否而分为非活性群(inactive)或活性群(active)进行循环造骨细胞分析的附图；(B)表示未发生病变的稳定群和持续性地发生病变的渐进群中进行循环造骨细胞分析的附图。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明中术语"诊断"是指确认病理状态的存在或特征。从本发明的目的上看，诊断是指确认癌症的骨转移的存在与否，或进一步确认癌症的骨转移的发生与否或深化与否。
本发明中术语“诊断”可包括判定对于特定疾病或疾患的一个客体的感受性(susceptibility)、判定一个客体目前是否有特定疾病或疾患、有特定疾病或疾患的一个客体的预后(prognosis)、或治疗测定(therametrics)(例如，为了提供对于治疗效果的信息而监测客体的状态)。
本发明涉及一种包括检测骨钙素(Osteocalcin)的物质的癌症的骨转移诊断用组成物。
本发明人发现了在癌症的骨转移的初期阶段-微细骨转移阶段中造骨细胞向血液中游离而形成循环造骨细胞，并发现对其进行检测而能够在初期步骤诊断癌症的骨转移，由此，完成了本发明。
用于检测所述骨钙素的物质只要是能够检测骨钙素并非限制，例如，骨钙素、翻译成骨钙素的mRNA、转录成所述mRNA的DNA或其互补性的序列的DNA为标志的抗体、适体、DNA、RNA、蛋白质、多肽等。
所述组成物如果包括用于检测所述骨钙素的物质，可作为癌症的骨转移诊断用途，但，为了以更加明确的癌症的骨转移诊断用途适用，还可包括检测N-钙粘蛋白(N-cadherin)的物质。
检测所述N-钙粘蛋白的物质是如果能够检测N-钙粘蛋白并非限定，例如，N-钙粘蛋白、翻译成N-钙粘蛋白的mRNA、转录成所述mRNA的DNA或其互补性的序列的DNA为标志的抗体、适体、DNA、RNA、蛋白质、多肽等。
在本发明中，“抗体”是指对抗原性部位特异性的蛋白质分子。从本发明的目的上，抗体是指与所述标志蛋白质的骨钙素或N-钙粘蛋白特异性地结合的抗体，可全部包括单克隆抗体、多克隆抗体及再组合抗体。
所述单克隆抗体可利用相应领域公知的杂交瘤方法，或噬菌体抗体库制造，但，并非限定于此。
所述多克隆抗体可通过包括将上述的蛋白质抗原给动物注射并对该动物抽血而获得包括抗体的血清的相应技术领域公知的方法制造。上述的多克隆抗体可从山羊、兔子、羊、猴子、马、猪、牛、狗等任意的动物中宿主制造，但，并非限定于此。
并且，本发明的抗体中还可包括嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体等特殊抗体。
所述“钛”具有对于标记物质的结合力较高的优点，即使在热/化学处理时也不发生变性。并且，分子大小较小，因此，可与其他蛋白质粘合而以融合蛋白质利用。更详细地，可粘合在高分子蛋白质链利用，因此，可作为诊断试剂盒及药物传送物质使用。
所述“适体(aptamer)”是指其自身具有稳定的三级结构，并由具有与靶分子以极高的亲和力和特异性结合的特征的特别的种类的寡核苷酸(DNA、RNA或变形核酸)构成的多核苷酸的一种。如上述地，适体与抗体相同地与抗原性物质特异性地结合，并且，由相比蛋白质稳定性高、结构简单、容易合成的多核苷酸构成，因此，可替代抗体使用。
并且，所述癌症为选自肝癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳房癌、子宫癌、大肠癌、结肠癌、血癌、卵巢癌、前列腺癌、胰子癌、脾脏癌、睾丸癌、胸腺癌、脑癌、食道癌、肾癌、胆管癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌或皮肤癌中的至少一个，优选地，为选自乳房癌、甲状腺癌或前列腺癌中的至少一个，更优选地，为乳房癌或甲状腺癌，但，并非限定于此。
并且，本发明涉及一种包括所述组成物的癌症的骨转移诊断用试剂盒。
本发明的试剂盒可包括与标志物成分特异性地结合的抗体；粘合通过与基质的反应而发色的标志物的2次抗体缀合物(conjugate)；所述将要与标志物发色反应的发色基质溶液、洗涤液及酵素反应停止溶液等，并且，可由包括使用的试剂成分的多个单独封装或隔室制造，但，并非限定于此。
本发明的试剂盒不仅包括能够测定患者试料内骨钙素或N-钙粘蛋白的显现水准的制剂，并且，还可包括对于显现水准分析适宜的一个种类以上的组成物、溶液或装置。例如，所述试剂盒为了抗体的免疫学检测可包括基质、适当的缓冲溶液、以检测标签标示的2次抗体及发色基质等，但，并非限定于此。
作为更详细的一例，所述试剂盒可为酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、为了进行夹心酶联免疫吸附试验等各种ELISA方法而包括执行ELISA所需的必要因素的试剂盒。上述的ELISA试剂盒包括对于所述蛋白质特异性的抗体。抗体是对于骨钙素或N-钙粘蛋白蛋白质的特异性及亲和力较高且与其他蛋白质几乎没有交叉反应性的抗体，可为单克隆抗体、多克隆抗体或再组合抗体。并且，ELISA试剂盒可包括对于对照群蛋白质特异性的抗体。此外，ELISA试剂盒可包括能够检测结合的抗体的试剂，例如，标记的2次抗体、发色团(chromopores)、酵素及与其基质或抗体结合的其他物质等，但，并非限定于此。
除此之外，所述试剂盒可为进行蛋白印迹法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、乳汁细胞分析，或蛋白质芯片等的试剂盒，并且，还可包括对于各个分析方法适合的附加性的构成。通过上述分析方法将抗原-抗体复合体形成量进行比较，而诊断癌症的骨转移。
并且，本发明涉及一种用于包括检测从诊断对象分离的试料内骨钙素的步骤的癌症的骨转移诊断的信息提供方法。
诊断对象为目前患有癌症或有患癌症的经历的动物，所述动物可为包括人类的哺乳类。
试料是从诊断对象分离出来的，其一例为组织、细胞、全血、血浆、血清、血液或脑脊液等，但，并非限定于此。更详细地，可为血液、血浆、血清等，更详细地，可为外周血单球。
所述检测是检测骨钙素，将包括用于检测骨钙素的物质的癌症的骨转移诊断用组成物在所述试料中进行处理。
所述方法还可包括检测所述试料内的N-钙粘蛋白的步骤。此时，所述检测是将包括用于检测骨钙素的物质及检测N-钙粘蛋白的物质的癌症的骨转移诊断用组成物在所述试料中进行处理。
如需更加提高正确度，可全部检测骨钙素及N-钙粘蛋白，但，并非限定于此。
用于检测所述骨钙素的物质或检测N-钙粘蛋白的物质的范围如上述的说明。
所述癌症的范围如上述的说明。
本发明是检测从诊断对象分离的试料内骨钙素，或检测骨钙素及N-钙粘蛋白，例如可利用对于骨钙素或N-钙粘蛋白特异性的抗体、钛、适体或蛋白质而执行，但，并非限定于此。
举例其详细的方法，利用对于骨钙素或N-钙粘蛋白特异性的抗体，通过选自由酵素免疫分析法(ELISA)、放射免疫分析法(radioimmno assay，RIA)、夹心测定法(sandwichassay)、免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组织化学着色法(immnohistochemical staining)、流式细胞术(flowcytometry)、荧光活化细胞分选方法(FACS)、酵素基质显色法、抗原-抗体凝集法及蛋白质芯片形成的群的方法执行，但，并非限定于此。
作为附加性的方法，可适用当两个种类的荧光物质位于较近的距离时，通过共振传送能量发生新的显色的荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer)技术，而通过一个荧光波长感知两个物质的方法。并且，除了乳汁细胞分析之外，为了提高检测的客观性和再现性，在抗体贴标签后，用网眼(mesh)过滤10μm以下的细胞，在载片上涂膜后，借助于自动扫描、人工智能执行培养细胞数定量方法。
并且，本发明的方法还可包括如果检测到骨钙素时判断为癌症转移至骨头的步骤。
在诊断对象的试料中检测到骨钙素时，可判断为癌症发生了骨转移，并且，检测量越增加，可判断为癌症的骨转移步骤发生了更进一步的发展。
本发明的方法包括检测N-钙粘蛋白的步骤时，如果还检测到N-钙粘蛋白时，可以更高的准确度判断为癌症发生了骨转移。
根据需要，本发明的方法还可包括在从诊断对象分离的试料进行维他命K处理的步骤。
所述维他命K可为维他命K1或维他命K2。
通过维他命K的处理，将骨钙素γ-羟基化而增加骨钙素的显现并使其稳定化，从而，能够更加容易地检测骨钙素。
维他命K的处理浓度并非特别限定，例如，可为10-5M至10-7M，更详细地，维他命K1及维他命K2的处理浓度可分别为10-5M至10-7M。在所述处理浓度下，可使得循环造骨细胞的骨钙素的显现效果最佳。
并且，本发明涉及一种检测从诊断对象分离的试料内骨钙素而诊断癌症的骨转移的方法。
试料可为上述的范围内的试料。
所述检测是在所述试料处理用于检测骨钙素的物质而执行。
用于检测骨钙素的物质可为上述的范围内的。
如果检测到骨钙素时，可判断癌症发生了骨转移，更详细地，例如，测定试料内显现骨钙素循环造骨细胞数(％)而诊断癌症的骨转移。详细地，以未发生骨转移的癌症患者的显现骨钙素循环造骨细胞数为基准，比较发生了骨转移的癌症患者的骨钙素显现循环造骨细胞数而进行诊断，但，并非限定于此。
并且，本发明的方法还可变包括检测所述试料内N-钙粘蛋白的步骤。
其可在试料中处理用于检测N-钙粘蛋白的物质而执行，该物质可为上述的范围内的。
如果检测到N-钙粘蛋白，能够以更高的准确度诊断为癌症发生了骨转移，详细地，检测试料内显现骨钙素循环造骨细胞后，顺次地检测N-钙粘蛋白显现循环造骨细胞，但，并非限定于此。
并且，本发明涉及一种癌症的骨转移诊断用组成物及试剂盒的制造中检测骨钙素的物质的用途。
如上述地，本发明的癌症的骨转移诊断用组成物及包括其的试剂盒包括用于检测骨钙素的物质，如果在试料中检测到骨钙素，可诊断为癌症发生了骨转移，所述物质可用于癌症的骨转移诊断用组成物及试剂盒的制造。
并且，在所述制造中使用的物质还可包括检测N-钙粘蛋白的物质。
并且，本发明涉及一种治疗发生骨转移的癌症的方法。
本发明的治疗方法包括：从诊断对象分离的试料中进行用于检测骨钙素的物质的步骤；检测骨钙素而判断癌症是否发生了骨转移的步骤；及如果癌症发生了骨转移，向诊断对象给予骨转移癌治疗剂的步骤。
试料及所述物质可为上述的范围内的，可通过上述的范围内的方法检测骨钙素。
本发明的方法还可包括如下步骤：所述试料中处理用于检测N-钙粘蛋白的物质，并检测N-钙粘蛋白而诊断癌症是否发生了骨转移。
根据需要，本发明的方法还可包括如下步骤：在从诊断对象分离的试料进行维他命K处理。
所述维他命K可为维他命K1或维他命K2。
通过维他命K的处理，将骨钙素γ-羟基化而增加骨钙素的显现，使其稳定化，而能够更加容易地检测骨钙素。
维他命K的处理浓度并非特别地限定，例如，可为10-5M至10-7M，详细地，维他命K1及维他命K2的处理浓度可分别为10-5M至10-7M。在所述处理浓度中循环造骨细胞的骨钙素的显现效果最佳。
给予所述骨转移癌治疗剂的步骤包括：诊断癌症的骨转移并判断为阳性时，给予骨转移癌治疗剂进行治疗。
所述给予包括非口服给药或口服给药，上述的给予的方法是本发明的技术人员公知的。
所述骨转移癌治疗剂可无限制地使用在本发明的技术领域中公知的，可使用唑来磷酸(zolendronate)、地诺单抗(denosumab)等。
以下，为了详细地说明本发明，以实施例为例进行详细的说明。
实施例
1.获取外周血单球及乳汁细胞分析
(1)实验方法
在癌症患者的血液样本中，为了循环造骨细胞的乳汁细胞分析，获取了通过液体活检的样本及相应样本中获取了外周血单球。将诊断对象患者的采集的血液样本4㏄置入在容纳有聚蔗糖(Ficoll)(Pharmacia)的肝素管中，并在4℃的温度下以1800rpm速度进行20分钟的圆心分离，由此，诱导了以血浆、单球层、ficoll、红血球(RBC)层分离的血液层。此时，只将分离的血浆与ficoll之间接口层(第2层)即单球层小心地分离后移动至新管。然后，添加PBS溶液并将单球细胞清洗后，再次在4℃的温度下，以2000rpm速度进行5分钟圆心分离，而只获取了清洗干净的单球细胞。
将洗涤的单球细胞106个置入含有500μl的FBS的缓冲溶液中，并添加了抗CD15-FITC(5μl)、抗CD34-PE-Cy7(5μl)、抗骨钙蛋白-APC(3μl)、抗N-钙粘蛋白-PE(5μl)抗体后，在常温下放置30分钟而进行了染色(使用的抗体信息：购买了a-CD15FITC(#555401,BD)、a-CD34PE-Cy7(#34881,BD)、a-骨钙蛋白APC(#SC-365797-AF647,Santacruz)、a-N-钙粘蛋白PE(#561554,BD)使用)。
染色结束后，添加了含有4ml的FBS的缓冲溶液，而将非特异性结合及未结合的抗体进行清洗淘汰，并在4℃的温度下，以1500rpm速度进行5分钟圆心分离，而获取了标识抗体的单球细胞。所述明示的癌症患者的血液样本是为了本发明的临床研究，首尔大学医院临床研究中心的IRB认证下通过规定的路径购买。
染色的单球细胞是通过乳汁细胞分析仪(BD FACSCantoⅡ)进行了分析。将以上述中排列的抗体染色的单球细胞以单一细胞水准进行分析，最先以CD15-细胞群集分类，在此以CD34-、骨钙蛋白+细胞群集进行再分类，而将含有的细胞的个数定量，并分析了骨钙蛋白+循环造骨细胞。在此，附加地分析了相应群集中N-钙粘蛋白+细胞的个数后，最终地将骨转移癌特异CD15-/CD34-/骨钙蛋白+/N-钙粘蛋白+循环造骨细胞如下面数学式1定量。乳房癌患者98名、甲状腺癌患者10名，总108名癌症患者的试料中完成了循环造骨细胞的分析，并将代表分析结果显示在图1中。
[数学式1]
循环造骨细胞(％)＝{(CD15-/CD34-/骨钙蛋白+/N-钙粘蛋白+细胞数)/(CD15-细胞数)}X100(％)
(2)实验结果
分析结果，癌症患者的血液样本乳汁细胞分析结果，分析了总1000000个细胞，其中除了死亡的细胞等的932559个细胞进行了分类。顺次地，将CD15-细胞881302个再次分类，在此，定量了骨钙蛋白+且CD34-的细胞1252个。附加地1252个中，显示了将N-钙粘蛋白+的细胞定量为869个的结果(图1)。
2.骨转移癌白鼠模型构建
(1)实验方法
在临床前研究中为了循环造骨细胞分析，构建了容易进行骨转移癌症患者的骨髓环境及循环造骨细胞分析的白鼠模型。所有的动物实验是获得首尔大学动物实验伦理委员会(SNU-170607-6-2)的承认后在严格遵守规定的前提下实施。人乳房癌细胞株直接向免疫缺乏白鼠(balb/c nude小鼠)的胫骨注射而获取了与骨转移癌患者类似的理想型的动物模型。更详细地，在可向白鼠体内注入的缓冲溶液即PBS中准备1x105/20μl/白鼠量的人乳房癌细胞株MDA-MB-231，并向裸白鼠右侧胫骨内注射。癌细胞注射后第2周、第3周、第5周通过活体成像(Xenogen IVIS，PerkinElmer)观察了胫骨内肿瘤形成及成长。为了在各个周的实质性的肿瘤形成，在对于白鼠实施安乐死后将形成肿瘤的胫骨分离,并进行了为组织学分析的样本准备过程。在4％多聚甲醛溶液中将分离的组织冷藏保管3日而固定组织后，去除在骨粘附的肌肉部分，在0.5MEDTA溶液中将脱钙化(Decalcification)过程进行了大约两周(脱钙化过程也冷藏保管，执行时3日一次更换0.5MEDTA溶液)。然后，由石蜡块及石蜡切片制造载片并实施了H&E组织染色。活体成像及组织染色分析结果如图2表示。
(2)实验结果
构建骨转移乳房癌白鼠模型后每周确认基础标记指数(BLI)影像的结果，到了第五周才能够诊断肿瘤形成及成长部位，并且，病理组织检查确认与其一致的结果。第三周时观察到在胫骨内形成了很小的肿瘤，第五周时确认在胫骨内的肿瘤较大地形成。该结果表明只是通过影像诊断难以观察微细的肿瘤，到了第五周以上肿瘤较大地成长时才能够进行诊断(图2)。
3.根据肿瘤成长的循环造骨细胞变化分析
(1)实验方法
为了分析在所述实施例2中构建的骨转移癌白鼠模型中，根据肿瘤大小的循环造骨细胞的变化进行了采血。更详细地，将白鼠麻醉后通过心脏穿刺采取了约1ml的白鼠的全血。采血时为了防止血液凝固，采血前将注射器内部涂覆肝素溶液后使用，并且，采血后立即放入红细胞溶解(lysis)溶液而进行了红细胞溶血过程。在常温下放置15分钟后，以1500rpm进行5分钟圆心分离而去除了上层液。该过程反复进行直到红细胞完全消除，并将完全清洁的细胞容纳在含有FBS的缓冲溶液中。然后，利用抗CD45-PE(#561087，BD)和在所述实施例1中明示的抗骨钙蛋白抗体进行染色，并通过乳汁细胞分析将CD45+/骨钙蛋白+循环造骨细胞进行分析。将根据肿瘤成长的活体成像的生物发光强度(bioluminescenceintensity，ph/s)与骨钙蛋白+循环造骨细胞(循环骨钙蛋白+cell，cOC)数(％)进行了比较。与其有关的结果显示在图3中。
(2)实验结果
利用乳房癌细胞的白鼠骨转移癌模型中，循环造骨细胞(cOC)是通过影像技法诊断之前已增加，在组织病理分析中确认时可知晓与肿瘤细胞在骨表面进行微细群集化的时期一致(参照图2)，并且，在以往的成像基础标记指数(BLI)检查中第5周时可诊断，但，根据本发明第2-3周时已经能够诊断(图3(A))。
并且，利用乳房癌细胞的白鼠骨转移癌模型中循环造骨细胞(cOC)与通过可考虑为金本位(gold standard)的病理学的分析测定的肿瘤的大小形成较好的相关关系(图3(B))。
4.微细骨转移乳房癌白鼠模型构建及循环造骨细胞分析
(1)实验方法
为了以不同于所述实施例中构建的胫骨注射骨转移白鼠模型构建的白鼠模型，与实际骨转移乳房癌患者最相似的环境下进行临床前研究，构建了在白鼠左心室直接注入乳房癌细胞的白鼠模型。获取了将人乳房癌细胞株即MDA-MB-231细胞直接向免疫缺乏白鼠(Balb/c nude mice)的左心室注射，经过全身循环后，向胫骨或大腿骨转移的白鼠模型。
更详细地，可向白鼠体内注入的缓冲溶液即PBS中以1x105/100μl/小鼠量准备了人乳房癌细胞株MDA-MB-231，并直接向裸白鼠左心室注射。癌细胞注射后，第3日、第7日、第14日、第22日通过活体成像(Xenogen IVIS，PerkinElmer)观察了向白鼠骨转移的肿瘤的形成及成长。附加地，设定并分析了感兴趣区域(ROI，region of interast)，而以数值分析了向白鼠骨转移的肿瘤成长。将该日期白鼠安乐死后采取全血，并分离外周血单核细胞(PBMC)后分析了骨钙蛋白+循环造骨细胞。采血及PBMC分离过程、为乳汁细胞分析的抗体染色与在所述实施例3.项目中说明的相同。
活体成像及循环造骨细胞分析结果如图4显示。
(2)实验结果
构建微细骨转移乳房癌白鼠模型并确认骨转移初期各日期基础标记指数(BLI)影像的结果，在注入癌细胞后第14日时可诊断是否发生骨转移，ROI数值到了第22日时才能够确认有意义的分析结果。相反，骨钙蛋白+循环造骨细胞分析结果是在基础标记指数(BLI)影像中无法确认骨转移的时期即第7日时已经确认有意义地增加。其是与胫骨直接注射模型的结果一致的结果，表示通过影像诊断难以测定微细骨转移肿瘤，但，通过骨钙蛋白+循环造骨细胞分析可进行早期诊断(图4)。
5.是否骨转移的循环造骨细胞分析
(1)实验方法
为了根据是否发生骨转移的循环造骨细胞分析，构建了与所述实施例4相同的左心室注射微细骨转移乳房癌白鼠模型。该模型为了证明循环造骨细胞的量增加并非是白鼠种特异性或特定乳房癌细胞株反应，在其他白鼠种利用了该白鼠种由来乳房癌细胞株。更详细地，在可向白鼠体内注入的缓冲溶液即PBS中准备了1x104/100μL/白鼠量的Balb/c白鼠由来乳房癌细胞株的4T1，并向Balb/c白鼠左心室直接注射。癌细胞注后第7日时通过基础标记指数(BLI)影像分类为骨转移的组和非骨转移的对照群组，并通过ROI分析将骨转移组合对照群之间生物发光强度形成数值化。然后，对死亡白鼠进行全血采血，与所述实施例中说明的方法相同地准备后，分析了骨钙蛋白+循环造骨细胞。附加地，分析了基础标记指数(BLI)数值分析结果与循环造骨细胞分析结果的相关关系。
相应结果显示在图5中。
(2)实验结果
骨转移群与对照群中分析循环造骨细胞的结果，能够确认相比对照群骨转移群中骨钙蛋白+循环造骨细胞的有意义的量增加。并且，分析关于基础标记指数(BLI)数值分析结果与循环造骨细胞量增加的相关关系的结果，证明根据是否发生骨转移的循环造骨细胞的量增加显示极大的相关关系。该结果验证骨钙蛋白+循环造骨细胞不仅能够早期诊断微细骨转移乳房癌，并且，可作为判断是否发生骨转移的标志物的可能性(图5)。
6.转移性乳房癌患者临床研究
(1)实验方法
为了分析实际骨转移癌患者的血液中存在的循环造骨细胞，而评价在临床上是否存在诊断性价值，将患有骨转移癌的乳房癌患者96名为对象测定了骨钙蛋白+循环造骨细胞数(％)。患者的血液样本采取、单球分离及细胞染色过程与在所述实施例1中说明的方法相同的方法进行，分析方法也相同地进行。与其相应的结果显示在图6中。
为了评价附加性的临床价值，进行了各种方法的分析。通过cOC％分析当时和之后持续的追踪观察，分为骨转移病变活性群(active)或非活性群(inactive)进行了分析。该结果显示在图7中。并且，以所述分析结果为基础决定能够预测骨转移病变的进行的最佳的cut-off，并以此为基础，分析了无进展生存期(Progression-free Survival)(PFSProbability)。该结果显示在图8中。
(2)实验结果
1.96名转移性乳房癌患者中有过骨转移的63名相比未有过骨转移的33名cOC％显著地高(图6)。
2.根据cOC％分析当时骨转移病变是否具有活性，分为非活性群(inactive)26名和活性群(active)37名时，cOC％没有差异。但，追踪观察15个月后，将骨转移病变分为目前没有发展的稳定群和病情持续发展的渐进群时，确认在非活性/活性群中都是渐进(progressive)群的基底cOC％显著地高(图7)。
3.cOC％能够预测骨转移病变的发展的最佳的cut-off可提示0.45％(图8(A))。以0.45％为基准将骨转移癌患者分为两个群时，能够确认无进展生存期(progression-freesurvival)有显著的差异(图8(B))。
7.转移性甲状腺癌患者临床研究
(1)实验方法
为了分析实际骨转移癌患者的血液中存在的循环造骨细胞，评价是否有临床上诊断性价值，以患有骨转移癌的甲状腺癌患者14名为对象，测定了骨钙蛋白+循环造骨细胞数(％)。患者的血液样本采取、单球分离及细胞染色过程通过与所述实施例1中说明的方法相同的方法进行，通过cOC％分析当时和之后持续的观察，分为骨转移病变活性群(active)或非活性群(inactive)进行了分析。相应结果显示在图9中。
(2)实验结果
1.将14名转移性甲状腺癌患者中有过骨转移的12名根据cOC％分析当时骨转移病变是否具有活性分为非活性群(inactive)5名和活性群(active)7名时，活性群的cOC％相比非活性群显著地高(图9(A))。
2.6个月追踪观察后，将骨转移病变分为目前无发展的稳定群和疾病持续地发展的渐进群时，渐进群的基底cOC％较高，但，未显示统计性的差异(图9(B))。

Claims (11)

1.一种包括用于检测骨钙素的物质的癌症的骨转移诊断用组成物。
2.根据权利要求1所述的癌症的骨转移诊断用组成物，其特征在于，
还包括：用于检测N-钙粘蛋白的物质。
3.根据权利要求1所述的癌症的骨转移诊断用组成物，其特征在于，
检测所述骨钙素的物质为选自由抗体、适体、DNA、RNA、蛋白质、多肽形成的群中的至少一个。
4.根据权利要求2所述的癌症的骨转移诊断用组成物，其特征在于，
用于检测所述骨钙素的物质及用于检测所述N-钙粘蛋白的物质为相互独立地选自由抗体、适体、DNA、RNA、蛋白质、多肽形成的群的至少一个。
5.根据权利要求1所述的癌症的骨转移诊断用组成物，其特征在于，
所述癌症为选自肝癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳房癌、子宫癌、大肠癌、结肠癌、血癌、卵巢癌、前列腺癌、胰子癌、脾脏癌、睾丸癌、胸腺癌、脑癌、食道癌、肾癌、胆管癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌或皮肤癌中的至少一个。
6.根据权利要求1所述的癌症的骨转移诊断用组成物，其特征在于，
所述癌症为乳房癌或甲状腺癌。
7.一种包括权利要求1至6中的任一项的组成物的癌症的骨转移诊断用试剂盒。
8.一种包括检测从诊断对象分离的试料内骨钙素的步骤的用于癌症的骨转移诊断的信息提供方法。
9.根据权利要求8所述的用于癌症的骨转移诊断的信息提供方法，其特征在于，
还包括：检测所述试料内N-钙粘蛋白的步骤。
10.根据权利要求8所述的用于癌症的骨转移诊断的信息提供方法，其特征在于，
所述癌症为选自肝癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、乳房癌、子宫癌、大肠癌、结肠癌、血癌、卵巢癌、前列腺癌、胰子癌、脾脏癌、睾丸癌、胸腺癌、脑癌、食道癌、肾癌、胆管癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌或皮肤癌的至少一个。
11.根据权利要求8所述的用于癌症的骨转移诊断的信息提供方法，其特征在于，
所述癌症为乳房癌或甲状腺癌。
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