CN114134116A - 预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用 - Google Patents

预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114134116A
CN114134116A CN202111507436.6A CN202111507436A CN114134116A CN 114134116 A CN114134116 A CN 114134116A CN 202111507436 A CN202111507436 A CN 202111507436A CN 114134116 A CN114134116 A CN 114134116A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
intestinal cancer
solution
organoid
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111507436.6A
Other languages
English (en)
Inventor
陆爱国
徐卓晴
张雨晨
高晗
赵敬坤
宗雅萍
冯雯卿
沈晓卉
许梓枫
苗依鸣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Original Assignee
Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd filed Critical Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority to CN202111507436.6A priority Critical patent/CN114134116A/zh
Publication of CN114134116A publication Critical patent/CN114134116A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用。该试剂盒包括洗涤缓冲液、消化缓冲液、直肠癌化疗药物、干细胞培养液、第一细胞过滤网，第二细胞过滤网；所述洗涤缓冲液为含青霉素‑链霉素溶液的磷酸盐缓冲液；所述消化缓冲液为含Ⅳ型胶原蛋白酶、青霉素‑链霉素溶液的DMEM培养液；所述干细胞培养液为含谷氨酰胺、非必需氨基酸、bFGF、2‑巯基乙醇、血清替代物、青霉素‑链霉素溶液的DMEM/F12培养液；所述第一细胞过滤网的孔径为100‑500μm；所述第二细胞过滤网的孔径为20‑70μm。本发明可准确预测患者的临床化疗效果，为医生提供可靠的模拟结果，进而指导和判断临床治疗方案，实现个体化治疗。

Description

预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用，在应用方面体现为用于构建肠癌类器官等。
背景技术
目前恶性肿瘤的经典治疗方法包括：化学疗法，放射线和手术切除。当患者无法接受根治性手术治疗时，包括化学疗法在内的药物治疗将直接决定肿瘤患者的预后和转归。但个体对于药物的反应是存在一定的异质性的，这将直接导致同一标准化治疗的差异性和个体化治疗的复杂性。既往的研究大多将肿瘤患者列为一个整体进行研究，而忽略了个体间的差异。目前越来越多的研究者开始关注癌症个体化研究和个性化治疗，在这一研究领域，临床前肿瘤模型是非常重要的，它类似于真正的恶性肿瘤并能够预测体内药物反应。
结直肠癌是第三大常见癌症，临床治疗中只有一小部分的结直肠癌对化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)，伊立替康或奥沙利铂有反应，但同时化疗所带来的副作用反应，对治疗时机的延误和金钱的消耗都是目前临床医生在选择治疗方案时所需要考虑的问题。因此，如果能在患者接受化疗之前预测该患者对化疗的效果，进而制定个性化的治疗方案，这将对临床医患双方提供巨大的便利和好处。
药物敏感性测试是指在实验室环境下，运用肿瘤模型在体外检测某一药物对肿瘤生长的抑制作用，具有不依赖体内环境，较高的可重复性和可操作性的优点。在这一检测手段中，起着核心作用的就是肿瘤模型。目前常用的肿瘤模型包括动物模型、肿瘤细胞系、原发性患者衍生的肿瘤异种移植物(PDX)和原发性肿瘤类器官(PDO)，基于这些模型开发出了多种药物敏感性测试方案，但大多受限于成功率低、操作难度大、检验时间长而费用过高、对临床疗效预测的一致性弱、缺少统一指标等原因，极少被正式运用于临床或商业用途上。
目前的研究认为，具有三维结构的细胞培养模型具有更高的仿生活性，相比于传统二维培养能够更好的模拟体内的生长环境，因此特别适用于药物敏感性测试。类器官是体内的干细胞在体外特殊培养条件下形成的具有三维组织结构的微器官，它们在许多方面重现了体内对应器官的结构和功能。常用的三维细胞培养方式包括基质胶法、水凝胶法、悬浮法、悬滴培养法以及非黏附性基质法等。基于此项技术，目前已经从各种癌中建立了肿瘤类器官，包括胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌。此外，为了解决部分肿瘤组织临床样本的不易获得和需要反复取样的问题，研究者们致力于通过优化培养条件,简化操作步骤等方式，从小样本甚至穿刺活检、内窥镜活检组织中建立类器官模型。
目前体外构建类器官的主流方法为Matrigel法，但是由于Matrigel法构建的类器官完全来源于肿瘤干细胞，在进行体外药物敏感性测定的时候，无可避免的会产生耐药性，无法准确预测癌症患者对于化疗药物的敏感性。Matrigel是一种商品化的基质胶，是得到广泛认可和应用的培养类器官的细胞外基质成分。
对于预测药物疗效这一目标，目前仍需要更为成熟的原代细胞提取技术和更为稳定的类器官培养体系，同时寻找更为贴合临床实际的预测指标。通过此种手段，临床医生可以快速判断某一药物对于一特定个体是否具有疗效，从而指导临床治疗方案，减少患者的不良反应和治疗费用，寻找患者的最佳治疗方案，提高临床指导的效果和疾病预后。
发明内容
为了有利于准确预测结直肠癌患者的临床化疗效果，解决上述技术问题中的至少一个，本发明一方面公开了一种预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒，包括洗涤缓冲液、消化缓冲液、直肠癌化疗药物、干细胞培养液、第一细胞过滤网，第二细胞过滤网；
所述洗涤缓冲液为含青霉素-链霉素溶液的磷酸盐缓冲液；所述消化缓冲液为含Ⅳ型胶原蛋白酶、青霉素-链霉素溶液的DMEM培养液；所述干细胞培养液为含谷氨酰胺、非必需氨基酸、bFGF、2-巯基乙醇、血清替代物、青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养液；所述第一细胞过滤网的孔径为100-500μm；所述第二细胞过滤网的孔径为20-70μm。
进一步地，所述第一细胞过滤网的孔径为100μm；所述第二细胞过滤网的孔径为40μm。
在一些实施方案中，所述直肠癌化疗药物选自奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康和卡培他滨中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述洗涤缓冲液为含1X青霉素-链霉素溶液的磷酸盐缓冲液；所述1X青霉素-链霉素溶液由2-100X青霉素-链霉素溶液稀释而成；其中，100X青霉素-链霉素溶液中青霉素的含量为5-20kU/ml，链霉素的含量为5-20mg/ml，用0.9％氯化钠配制。优选地，100X青霉素-链霉素溶液中青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml，用0.9％氯化钠配制。
在一些实施方案中，所述消化缓冲液为含0.5-5mg/mlⅣ型胶原蛋白酶、1X青霉素-链霉素溶液的DMEM培养液；所述干细胞培养液为含2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1-50ng/mL bFGF、0.1mM 2-巯基乙醇、1-10％血清替代物、1X青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养液。
进一步地，所述消化缓冲液为含0.5mg/mlⅣ型胶原蛋白酶、1X青霉素-链霉素溶液的DMEM培养液；所述干细胞培养液为含2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、8ng/mL bFGF、0.1mM 2-巯基乙醇、5％血清替代物、1X青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养液。
在一些实施方案中，还包括XELOX方案的疗效标准；所述XELOX方案的疗效标准为：采用所述预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒用悬浮法构建肠癌类器官，根据所述肠癌类器官在XELOX方案下的药物剂量-反应曲线，计算不同结直肠癌患者来源的所述肠癌类器官的生长半抑制浓度(IC50)；若IC50值<4μM，则所述肠癌类器官属于敏感组，若IC50值>10μM，则所述肠癌类器官属于耐药组；若4≤IC50≤10μM，则所述肠癌类器官属于中等组。
另一方面，本发明还提供如上所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒在构建用于预测结直肠癌患者化疗药物疗效的肠癌类器官中的应用。
第三方面，本发明提供一种肠癌类器官的构建方法，包括以下步骤：
S1、采用如上所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒将结直肠癌组织裂解为单个细胞或细胞团；
S2、采用如上所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒将所述步骤S1得到的单个细胞或细胞团进行结直肠癌细胞的干性诱导和类器官形成。
在一些实施方案中，所述步骤S1包括以下步骤：
S1.1、取患者结直肠癌组织，使用所述洗涤缓冲液清洗；
S1.2、将所述步骤S1.1清洗后的组织切割成肉糜状；
S1.3、将所述步骤S1.2切碎的组织转移至离心管中，加入所述消化缓冲液，在37℃环境中震荡消化，得到裂解后的细胞/组织悬液；
S1.4、将所述步骤S1.3裂解后的细胞/组织悬液用所述第一细胞过滤网过滤，去除残余组织，保留过滤液；
S1.5、将所述步骤S1.4得到的过滤液离心，弃上清液，得到的沉淀即所述单个细胞或细胞团。
在一些实施方案中，所述步骤S1.1中的结直肠癌组织的来源包括：
1)在实施新辅助化疗前，通过内窥镜(肠镜)活检的方式获得，用于预测患者新辅助化疗的效果。
2)在患者接受手术治疗后，通过收集手术标本获得组织，用于预测患者术后辅助性化疗的效果。
3)对于结直肠癌肝转移患者，通过穿刺的方式获得肝转移病灶的活检组织，用于预测患者化疗效果，辅助选择化疗方案。
4)对于结直肠癌肝转移患者，接受手术治疗后，通过收集手术标本获得肝转移病灶的组织，用于预测患者术后辅助性化疗的效果。
5)对于结直肠癌复发/复发转移的患者，通过肠镜/穿刺获得活检组织，用于预测患者化疗效果，辅助选择化疗方案。
6)对于双/多病灶的结直肠癌患者，可同时收集不同部位的肿瘤病灶，分别预测化疗效果。
在一些实施方案中，所述步骤S2包括以下步骤：
S2.1、将所述步骤S1.5得到的沉淀用所述洗涤缓冲液重悬，然后离心，弃上清液，保留沉淀；
S2.2、用所述洗涤缓冲液重悬所述步骤S2.1得到的沉淀，将得到的细胞悬液用所述第二细胞过滤网过滤，保留所述第二细胞过滤网上被拦截的细胞团，此时单个细胞被滤出，弃滤液；
S2.3、用所述洗涤缓冲液自上而下清洗所述第二细胞过滤网及所述被拦截的细胞团，洗去残余的单个细胞；
S2.4、将所述步骤2.3处理后的第二细胞过滤网倒置，用所述干细胞培养液将细胞团从所述第二细胞过滤网上洗脱下来；
S2.5、将所述步骤2.4洗脱的细胞团用所述干细胞培养基培养，形成明显球形结构并具有光滑的表面；继续培养形成所述肠癌类器官。
第四方面，本发明还提供一种肠癌类器官在体外化疗药物药敏试验中的应用，所述肠癌类器官采用如上所述的构建方法获得；所述肠癌类器官在体外化疗药物药敏试验中的应用包括以下步骤：
S3.1、选择所述步骤S2.5得到的直径大于200um的肠癌类器官用于体外化疗药物药敏试验；设立所述直肠癌化疗药物的浓度梯度；
S3.2、将所述步骤S3.1中对应浓度的直肠癌化疗药物加入所述步骤S3.1选中的肠癌类器官；
S3.3、将经所述步骤S3.2处理的肠癌类器官在5％CO2中于37℃培养，期间捕获图像，测量培养过程中所述肠癌类器官的面积，通过比较培养过程中所述肠癌类器官的面积与其起始大小来计算生长/抑制效率，以0μM的药物剂量为基线绘制药物剂量-反应曲线，并且数据表示为从0μM开始的生长百分比，得到所述肠癌类器官的曲线下相关面积(AUC)；根据所述肠癌类器官的AUC比照疗效标准，得出所述肠癌类器官属于所述结直肠癌化疗药物的敏感组、中等组或耐药组。
对于不同的用药方案有不同的疗效标准。比如，XELOX方案的疗效标准为：采用所述预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒用悬浮法构建肠癌类器官，根据所述肠癌类器官在XELOX方案下的药物剂量-反应曲线，计算不同结直肠癌患者来源的所述肠癌类器官的IC50；若IC50值<4μM，则所述肠癌类器官属于敏感组，若IC50值>10μM，则所述肠癌类器官属于耐药组；若4≤IC50≤10μM，则所述肠癌类器官属于中等组。
本领域技术人员可以采用本发明提供的试剂盒和肠癌类器官的构建方法通过小样本研究建立其他用药方案的疗效标准。其基本原则是：将药物剂量反应曲线计算曲线下相应面积(AUC)，标准化后按照数值大小分为3组，数值最高的为1，数值最低的为0，取数值在67-100％范围的为耐药组，数值在34-66％范围的为中等组，数值在0-33％范围的为敏感组；与临床数据进行比较，若基本相符则采用，若出入较大则适应性调整；然后对应各组的IC50，得到耐药组、中等组和敏感组对应的IC50。
本发明涉及的试剂盒、构建方法及应用可以在临床治疗的多个时间段多次收集标本，并预测患者化疗的效果。
本发明可评估的化疗药物包括：
(1)试剂盒包括的奥沙利铂和5-氟尿嘧啶，可用于检测结直肠癌的一线治疗方案XELOX。
(2)通过增加检测药物种类，可个性化检测结直肠癌的其他治疗方案包括：FOLFOX(奥沙利铂、氟尿嘧啶、亚叶酸)，FOLFIRI(伊立替康、氟尿嘧啶、亚叶酸)等。
本发明涉及的试剂盒提供的药物5-氟尿嘧啶是临床结直肠癌治疗药物卡培他滨在体内代谢后的有效作用成分，因此选择5-氟尿嘧啶用于体外药物评估。
本发明涉及的试剂盒不适用于预测接受放射性疗法治疗的患者的效果。
本发明涉及的试剂盒不适用于预测药物作用靶点位于非肿瘤细胞的药物效果，包括：
(1)免疫疗法药物：PD-1单抗、CTLA4单抗。
(2)抗血管生成药物：贝伐珠单抗。
本发明涉及的试剂盒不适用于预测结直肠癌治疗指南已明确规定的用药方案中包含的药物：
(1)西妥昔单抗：指南推荐用于kras突变患者。
本发明涉及的试剂盒提供预测XELOX方案(奥沙利铂+5-氟尿嘧啶)的疗效标准：我们前期绘制了12位结直肠癌患者的药物剂量-反应曲线(图1)，计算不同患者的AUC值(曲线下相应面积)，根据AUC值将不同患者来源的肠癌类器官分为耐药、中等、敏感三个组(图2)。预测其他结直肠癌化疗药物的疗效标准可以参照预测XELOX方案(奥沙利铂+5-氟尿嘧啶)的疗效标准获得。
本发明的优点是：本发明涉及的试剂盒运用体外肿瘤类器官构建方法，从临床来源的结直肠癌组织中构建类器官模型，在体外药物敏感性测试，能够准确预测患者的临床化疗效果，为医生提供可靠的模拟结果，进而指导和判断临床治疗方案，实现个体化治疗。本发明涉及的试剂盒运用悬浮法构建肠癌类器官，操作简单、成功率高。同时，肠癌类器官构建时间相比3维(3D)培养法大大缩短，能够在一周的时间内完成肠癌类器官的构建和体外药物敏感性实验，同时报告体外药物疗效的预测结果。在初期的12名受试案例中，该试剂盒的预测结果与患者临床化疗结果一致率达到91.66％(表1)。
本发明所涉及的试剂盒结合悬浮培养肿瘤球的方法来构建用于体外药物筛选的类器官模型(即本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法)，其优点还体现在可以在短时间内提取大量高纯度的肠癌细胞，并且构建的肠癌类器官与原发肿瘤中的肿瘤细胞高度一致，因此非常适合体外药物疗效预测。
通过对比试验发现，本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法得到的肠癌类器官包含肿瘤干细胞(CSC)和非CSC成分，而Matrigel法构建的肠癌类器官完全来源于CSC。由于原发肿瘤也含有CSC和非CSC成分，因此本发明的方法构建的类器官与原发肿瘤中的肿瘤细胞高度一致(图11)。
随着培养时间的延长，本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法得到的类器官与Matrigel法得到的类器官之间的差异逐渐减小，在生长状态和连续繁殖次数方面，它们之间没有显着差异(图10)。在培养时间上，本发明构建的类器官的时间明显缩短(图12)。
本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法与既往公开的体外建立肿瘤类器官的方法中很大改进是增加了第二细胞过滤网(尤其是孔径为40μm的细胞过滤网)以及2-巯基乙醇两个成分。使用40μm细胞过滤网，能够有效捕获直径大于40μm的肿瘤球，这些肿瘤球能够在体外保留原始肿瘤的特征，并在2-巯基乙醇的刺激下形成肿瘤类器官。
本发明与CN112080474A(一种体外建立肿瘤类器官的方法)相比，CN112080474A的方法是采用Matrigel法构建肿瘤类器官，然后将其消化为单细胞悬液进行化疗药物敏感性测定，目的是后期使用悬浮培养的方法降低Matrigel法所带来的耐药性问题。本发明采用悬浮法构建类器官，悬浮法进行药物敏感性测定，以最大程度的避免Matrigel法所带来的耐药性问题，并且能够极大的缩短实验周期。
本发明与CN113201479A(一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法)相比，CN113201479A的方法是在体外构建小鼠小肠类器官，与本发明构建的肠癌类器官在方法学和研究对象方面均不相同。Wnt3A是Wnt信号通路中的主要配体，是Wnt家族具有代表性的信号蛋白，是信号转导的关键诱导者。对于培养肠类器官而言，Wnt3A的补充是必须的，因此本发明不额外补充Wnt3A，使得正常的肠类器官无法在本发明的培养系统中繁殖，从而选择性的培养肿瘤类器官。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是12位结直肠癌患者的药物剂量-反应曲线。
图2是预测XELOX方案的疗效标准AUC值及分组情况。
图3是本发明所涉及的试剂盒及其应用的总体技术路线。
图4是实施例1的类器官的生长过程。
图5是实施例1的药物剂量-反应曲线。
图6是实施例1患者化疗前/后影像学图片。
图7是实施例2的类器官的生长过程。
图8是实施例2的药物剂量-反应曲线。
图9是实施例2患者化疗前/后影像学图片。
图10是Matrigel法和本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法(图中简称本发明)构建的肠癌类器官的形态。
图11是检测原始肿瘤、Matrigel法和本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法(图中简称本发明)构建的肠癌类器官中肿瘤干细胞的比例。
图12是检测Matrigel法和本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法(图中简称本发明)构建的肠癌类器官的生长速度。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图3示出了本发明所涉及的试剂盒及其应用的总体技术路线。从临床诊断为结直肠癌或直肠癌的患者体中取出肿瘤的活检组织；对该患者进行化学药物治疗，并在化疗前后对病变处分别拍摄影像图片，得到临床实际化疗结果；同时采用本发明所涉及的试剂盒将取出的活检组织培养为肠癌类器官；对培养的肠癌类器官进行体外化疗药物药敏试验；绘制药物剂量-反应曲线，根据AUC的大小得到预测化疗结果；比较预测化疗结果与临床实际化疗结果，发现一致性可以达到91.66％，表明本发明涉及的试剂盒预测结直肠癌患者化疗药物疗效的准确性高。
在这个基础上，临床医师可以在化疗前，先采用本发明所涉及的试剂盒进行相应化疗药物疗效的预测，对敏感组(也可能包括中等组)患者考虑采用该药物治疗；而对耐药组(也可能包括中等组)患者改换其他药物治疗。
实施例1
1、62岁男性，临床诊断为结直肠癌，直肠核磁共振(MR)诊断：结直肠癌(T4N2)；CRM(+)；EMVI(+)。在行新辅助治疗前，通过内窥镜手段获得活检组织。
2、试剂盒的组成成分：
(1)洗涤缓冲液：含1X青霉素－链霉素溶液的磷酸盐缓冲液(PBS)。
青霉素-链霉素溶液(100X)中青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml。该溶液用0.9％氯化钠配制。
磷酸盐缓冲液(PBS)，含135mM NaCl,4.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM NaH2PO4，pH值为7.3。
(2)消化缓冲液：含0.5mg/mlⅣ型胶原蛋白酶、1X青霉素－链霉素溶液的DMEM培养液。
(3)100μm细胞过滤网，40μm细胞过滤网。
(4)干细胞培养液：DMEM/F12培养液、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、8ng/mLbFGF、0.1mM 2-巯基乙醇、5％血清替代物、1X青霉素－链霉素溶液。
(5)化疗药物：奥沙利铂、5-氟尿嘧啶。
3、检测步骤：
(1)将活检肿瘤组织裂解为单个细胞或细胞团：
a)取数个米粒大小的患者活检肿瘤组织，使用洗涤缓冲液清洗数遍，至肉眼干净无杂质。
b)在6cm细胞培养皿中使用一次性手术刀片将组织切割成肉糜状。
c)将切碎的组织转移至15ml离心管中，加入适量消化缓冲液，在37℃环境中震荡消化1个小时。
d)将充分裂解后的细胞/组织悬液用100μm的细胞过滤网过滤，去除残余组织。
e)将过滤液以1500rpm，5分钟离心，弃上清液，得到的沉淀即是单个细胞或细胞团，进入下一步。
(2)结直肠癌细胞的干性诱导和类器官形成：
a)将上一步的细胞沉淀用洗涤缓冲液重悬，然后1500rpm，5分钟离心，弃上清液。
b)用2ml洗涤缓冲液重悬沉淀，将得到的细胞悬液用40μm的细胞过滤网过滤，保留滤网上层被拦截的细胞团，此时单个细胞被滤出，弃滤液。
c)用洗涤缓冲液自上而下清洗滤网及拦截的细胞团，洗去残余的单个细胞；
d)将细胞过滤网倒置，用干细胞培养液将细胞团从滤网上洗脱下来。
e)将洗脱的细胞团用干细胞培养基连续培养24小时，形成明显球形结构并具有光滑的表面。
f)实施例1来源的肠癌类器官的生长过程(图4)。
g)选择直径大于200μm的肠癌类器官，进入下一步。
(3)肠癌类器官的体外化疗药物药敏试验：
a)将上一步的肠癌类器官用于体外药敏试验，所选择的药物组合是奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶，设立浓度梯度为：0、0.25、0.5、1、3、6、13、25、50、100μM；奥沙利铂与5-氟尿嘧啶均该浓度梯度。
b)将对应剂量的药物加入到肠癌类器官培养体系中，以96孔板培养，每孔10～20个肠癌类器官。
c)在5％CO2中于37℃培养7天，第1、3、5、7天捕获图像，测量肠癌类器官的面积，通过比较肠癌类器官的面积与其起始大小来计算生长/抑制效率，以0μM的药物剂量为基线绘制药物剂量-反应曲线，并且数据表示为从0μM开始的生长百分比。
d)根据试剂盒提供预测XELOX方案(奥沙利铂+5-氟尿嘧啶)疗效的标准，该案例评估为中等组(图5)。
e)该案例的临床评估结果，化疗后影像学结果发现患者肿瘤无明显缩小，直肠MR诊断：直肠癌化疗后改变，肿块实体部分较前基本相仿，CRM(+)；EMVI(+)(图6)。该案例的临床评估结果为中等组。
f)该案例通过预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒法评估对化疗药物疗效的结果与临床评估结果(即实际化疗结果)一致。
实施例2
1、65岁男性，临床诊断为直肠癌，直肠MR诊断：拟直肠癌(mrT3N2)，MRF(+)，EMVI(-)。在行新辅助治疗前，通过内窥镜手段获得活检组织。
2、试剂盒的组成成分：
(1)洗涤缓冲液：含1X青霉素－链霉素溶液的磷酸盐缓冲液(PBS)。
青霉素-链霉素溶液(100X)中青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml。该溶液用0.9％氯化钠配制。
磷酸盐缓冲液(PBS)，含135mM NaCl,4.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM NaH2PO4，pH值为7.3。
(2)消化缓冲液：含0.5mg/mlⅣ型胶原蛋白酶、1X青霉素－链霉素溶液的DMEM培养液。
(3)100μm细胞过滤网，40μm细胞过滤网。
(4)干细胞培养液：DMEM/F12培养液、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、8ng/mLbFGF、0.1mM 2-巯基乙醇、5％血清替代物、1X青霉素－链霉素溶液。
(5)化疗药物：奥沙利铂、5-氟尿嘧啶。
3、检测步骤：
(1)将活检肿瘤组织裂解为单个细胞或细胞团：
a)取数个米粒大小的患者活检肿瘤组织，使用洗涤缓冲液清洗数遍，至肉眼干净无杂质。
b)在6cm细胞培养皿中使用一次性手术刀片将组织切割成肉糜状。
c)将切碎的组织转移至15ml离心管中，加入适量消化缓冲液，在37℃环境中震荡消化1个小时。
d)将充分裂解后的细胞/组织悬液用100μm的细胞过滤网过滤，去除残余组织。
e)将过滤液以1500rpm，5分钟离心，弃上清液，得到的沉淀即是单个细胞或细胞团，进入下一步。
(2)结直肠癌细胞的干性诱导和类器官形成：
a)将上一步的细胞沉淀用洗涤缓冲液重悬，然后1500rpm，5分钟离心，弃上清液。
b)用2ml洗涤缓冲液重悬沉淀，将得到的细胞悬液用40μm的细胞过滤网过滤，保留滤网上层被拦截的细胞团，此时单个细胞被滤出，弃滤液。
c)用洗涤缓冲液自上而下清洗滤网及拦截的细胞团，洗去残余的单个细胞。
d)将细胞过滤网倒置，用干细胞培养液将细胞团从滤网上洗脱下来。
e)将洗脱的细胞团用干细胞培养基连续培养24小时，形成明显球形结构并具有光滑的表面。
f)实施例2来源的肠癌类器官的生长过程(图7)。
g)选择直径大于200μm的肠癌类器官，进入下一步。
(3)肠癌类器官的体外化疗药物药敏试验：
a)将上一步的肠癌类器官用于体外药敏试验，所选择的药物组合是奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶，设立浓度梯度为：0、0.25、0.5、1、3、6、13、25、50、100μM。
b)将对应剂量的药物加入到肠癌类器官培养体系中，以96孔板培养，每孔10～20个肠癌类器官。
c)在5％CO2中于37℃培养7天，第1、3、5、7天捕获图像，测量肠癌类器官的面积，通过比较肠癌类器官的面积与其起始大小来计算生长/抑制效率，以0μM的药物剂量为基线绘制药物剂量－反应曲线，并且数据表示为从0μM开始的生长百分比。
d)根据试剂盒提供预测XELOX方案(奥沙利铂+5-氟尿嘧啶)疗效的标准，该案例评估为敏感组(图8)。
e)该案例的临床评估结果，化疗后影像学结果发现患者肿瘤较前缩小，直肠MR诊断：直肠Ca化疗后改变：原发灶及部分淋巴结较前缩小，CRM(+)；EMVI(-)(图9)。该案例的临床评估结果为敏感组。
f)该案例通过预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒法评估对化疗药物疗效的结果与临床评估结果(即实际化疗结果)一致。
实施例3
其他10名结直肠癌或者直肠癌患者也采用实施例1中所述试剂盒和检测步骤，其结果结合实施例1和2的2名患者的结果后，12名患者的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒法评估对化疗药物疗效的结果(即预测化疗结果)如图1所示。以0μM的药物剂量为基线绘制药物剂量-反应曲线，并且数据表示为从0μM开始的生长百分比。曲线下相应面积由统计软件计算生成，通过将得到的值除以每个病例测得的浓度范围的最大面积获得标准化后的曲线下相应面积，标准化后的值的范围在0-1之间(如图2所示)。将标准化后的曲线下相应面积按照数值大小分为3组，数值最高的(67-100％)为耐药组，数值中等的(34-66％)为中等组，数值最低的(0-33％)为敏感组。此时对应的各组的IC50(生长半抑制浓度)分别为，敏感组的IC50<4μM,中等组的IC50在4-10μM之间，耐药组的IC50>10μM。
12名患者的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒法评估对化疗药物疗效的结果(即预测化疗结果)和临床评估结果(即实际化疗结果)如表1所示。根据表1的数据得出，本发明所涉及的试剂盒的预测化疗结果与患者临床实际化疗结果一致率达到91.66％。
预测化疗结果的分组为：
预测化疗敏感：IC50<4μM。
预测化疗中等：4≤IC50≤10μM。
预测化疗耐药组：IC50>10μM。
实际化疗结果的分组为：
实际化疗敏感：明显退缩或消失。
实际化疗中等：部分退缩或无明显改变。
实际化疗耐药：肿瘤进展。
表1本发明所涉及的试剂盒对结直肠癌患者化疗药物疗效的预测效果
实际化疗敏感 实际化疗中等 实际化疗耐药 合计
预测化疗敏感 3 0 0 3
预测化疗中等 0 6 0 6
预测化疗耐药 0 1 2 3
合计 3 7 2 12
实施例4
1、54岁男性，临床诊断为直肠癌，通过手术标本获得肿瘤组织。
2、试剂盒的组成成分：
(1)洗涤缓冲液：含1X青霉素－链霉素溶液的磷酸盐缓冲液(PBS)。
青霉素-链霉素溶液(100X)中青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml。该溶液用0.9％氯化钠配制。
磷酸盐缓冲液(PBS)，含135mM NaCl,4.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM NaH2PO4，pH值为7.3。
(2)消化缓冲液：含0.5mg/mlⅣ型胶原蛋白酶、1X青霉素－链霉素溶液的DMEM培养液。
(3)100μm细胞过滤网，40μm细胞过滤网。
(4)干细胞培养液：DMEM/F12培养液、2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、8ng/mLbFGF、0.1mM 2-巯基乙醇、5％血清替代物、1X青霉素－链霉素溶液。
3、使用的对比试剂包括：
(1)洗涤缓冲液：含1X青霉素－链霉素溶液的磷酸盐缓冲液(PBS)。
青霉素-链霉素溶液(100X)中青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml。该溶液用0.9％氯化钠配制。
磷酸盐缓冲液(PBS)，含135mM NaCl,4.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM NaH2PO4，pH值为7.3。
(2)消化缓冲液：含0.5mg/mlⅣ型胶原蛋白酶、1X青霉素－链霉素溶液的DMEM培养液。
(3)100μm细胞过滤网。
(4)商品化Matrigel(货号356235，品牌Corning，New York，USA)。
(5)商品化人IntestiCultTM类器官生长培养基(货号06010，品牌STEMCELL，British Columbia，Canada)。
4、检测步骤：
(1)将活检肿瘤组织裂解为单个细胞或细胞团：
a)取数个米粒大小的患者活检肿瘤组织，使用洗涤缓冲液清洗数遍，至肉眼干净无杂质。
b)在6cm细胞培养皿中使用一次性手术刀片将组织切割成肉糜状。
c)将切碎的组织转移至15ml离心管中，加入适量消化缓冲液，在37℃环境中震荡消化1个小时。
d)将充分裂解后的细胞/组织悬液用100μm的细胞过滤网过滤，去除残余组织。
e)将过滤液以1500rpm，5分钟离心，弃上清液，得到的沉淀即是单个细胞或细胞团，进入下一步。
(2)使用本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法诱导类器官形成：
a)将上一步的细胞沉淀用洗涤缓冲液重悬，然后1500rpm，5分钟离心，弃上清液。
b)用2ml洗涤缓冲液重悬沉淀，将得到的细胞悬液用40μm的细胞过滤网过滤，保留滤网上层被拦截的细胞团，此时单个细胞被滤出，弃滤液。
c)用洗涤缓冲液自上而下清洗滤网及拦截的细胞团，洗去残余的单个细胞。
d)将细胞过滤网倒置，用干细胞培养液将细胞团从滤网上洗脱下来。
e)将洗脱的细胞团用干细胞培养基连续培养24小时，形成明显球形结构并具有光滑的表面。
f)实施例4来源的本试剂盒法提取的肠癌类器官的生长过程(图10)。
(3)使用Matrigel法诱导类器官形成：
a)将(1)中得到的细胞沉淀用洗涤缓冲液重悬，然后1500rpm，5分钟离心，弃上清液。
b)将细胞沉淀接种到Matrigel中并覆盖人IntestiCultTM类器官生长培养基。
c)实施例4来源的Matrigel法提取的肠癌类器官的生长过程(图10)。
(4)比较本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法和Matrigel法提取的类器官中含有肿瘤干细胞的比例：
a)收集两种方法提取的类器官并用PBS洗涤，然后使用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化成单细胞悬浮液。
b)收集(1)中得到的的细胞沉淀，进入下一步。
c)细胞用PBS洗涤，然后与荧光偶联的一抗在含有0.5％BSA的PBS中于4℃下避光孵育30分钟。使用的抗体包括CD133(货号372805，品牌Biolegend，USA)、CD166(货号343903，品牌Biolegend，USA)。根据制造商的操作说明，使用流式细胞术(BD Biosciences，美国)检测样品并通过FlowJo软件(Tree Star)进行分析。
d)实施例4来源的原始肿瘤细胞和肠癌类器官的CD133/CD166阳性细胞百分比(图11)。
(5)比较本发明所涉及的肠癌类器官的构建方法和Matrigel法获得的类器官的生长速度：
将两种方法获得的类器官，在5％CO2中于37℃培养13天，第1、3、5、7、9、11、13天捕获图像，测量肠癌类器官的面积，通过比较肠癌类器官的面积与其起始大小来计算生长效率，以第一天为基线绘制生长曲线(图12)。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒，其特征在于，包括洗涤缓冲液、消化缓冲液、直肠癌化疗药物、干细胞培养液、第一细胞过滤网，第二细胞过滤网；
所述洗涤缓冲液为含青霉素-链霉素溶液的磷酸盐缓冲液；所述消化缓冲液为含Ⅳ型胶原蛋白酶、青霉素-链霉素溶液的DMEM培养液；所述干细胞培养液为含谷氨酰胺、非必需氨基酸、bFGF、2-巯基乙醇、血清替代物、青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养液；所述第一细胞过滤网的孔径为100-500μm；所述第二细胞过滤网的孔径为20-70μm。
2.如权利要求1所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒，其特征在于，所述直肠癌化疗药物选自奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、伊立替康和卡培他滨中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为含1X青霉素-链霉素溶液的磷酸盐缓冲液；所述1X青霉素-链霉素溶液由2-100X青霉素-链霉素溶液稀释而成；其中，100X青霉素-链霉素溶液中青霉素的含量为5-20kU/ml，链霉素的含量为5-20mg/ml，用0.9％氯化钠配制。
4.如权利要求3所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒，其特征在于，所述消化缓冲液为含0.5-5mg/mlⅣ型胶原蛋白酶、1X青霉素-链霉素溶液的DMEM培养液；所述干细胞培养液为含2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1-50ng/mL bFGF、0.1mM 2-巯基乙醇、1-10％血清替代物、1X青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养液。
5.如权利要求1所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒，其特征在于，还包括XELOX方案的疗效标准；所述XELOX方案的疗效标准为：采用所述预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒用悬浮法构建肠癌类器官，根据所述肠癌类器官在XELOX方案下的药物剂量-反应曲线，计算不同结直肠癌患者来源的所述肠癌类器官的IC50；若IC50值<4μM，则所述肠癌类器官属于敏感组，若IC50值>10μM，则所述肠癌类器官属于耐药组；若4≤IC50≤10μM，则所述肠癌类器官属于中等组。
6.如权利要求1-5任一项所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒在构建用于预测结直肠癌患者化疗药物疗效的肠癌类器官中的应用。
7.一种肠癌类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用如权利要求1-5任一项所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒将结直肠癌组织裂解为单个细胞或细胞团；
S2、采用如权利要求1-5任一项所述的预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒将所述步骤S1得到的单个细胞或细胞团进行结直肠癌细胞的干性诱导和类器官形成。
8.如权利要求7所述的肠癌类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：
S1.1、取患者结直肠癌组织，使用所述洗涤缓冲液清洗；
S1.2、将所述步骤S1.1清洗后的组织切割成肉糜状；
S1.3、将所述步骤S1.2切碎的组织转移至离心管中，加入所述消化缓冲液，在37℃环境中震荡消化，得到裂解后的细胞/组织悬液；
S1.4、将所述步骤S1.3裂解后的细胞/组织悬液用所述第一细胞过滤网过滤，去除残余组织，保留过滤液；
S1.5、将所述步骤S1.4得到的过滤液离心，弃上清液，得到的沉淀即所述单个细胞或细胞团。
9.如权利要求8所述的肠癌类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S2包括以下步骤：
S2.1、将所述步骤S1.5得到的沉淀用所述洗涤缓冲液重悬，然后离心，弃上清液，保留沉淀；
S2.2、用所述洗涤缓冲液重悬所述步骤S2.1得到的沉淀，将得到的细胞悬液用所述第二细胞过滤网过滤，保留所述第二细胞过滤网上被拦截的细胞团，此时单个细胞被滤出，弃滤液；
S2.3、用所述洗涤缓冲液自上而下清洗所述第二细胞过滤网及所述被拦截的细胞团，洗去残余的单个细胞；
S2.4、将所述步骤2.3处理后的第二细胞过滤网倒置，用所述干细胞培养液将细胞团从所述第二细胞过滤网上洗脱下来；
S2.5、将所述步骤2.4洗脱的细胞团用所述干细胞培养基培养，形成明显球形结构并具有光滑的表面；继续培养形成所述肠癌类器官。
10.一种肠癌类器官在体外化疗药物药敏试验中的应用，其特征在于，所述肠癌类器官采用如权利要求9所述的构建方法获得；所述肠癌类器官在体外化疗药物药敏试验中的应用包括以下步骤：
S3.1、选择所述步骤S2.5得到的直径大于200um的肠癌类器官用于体外化疗药物药敏试验；设立所述直肠癌化疗药物的浓度梯度；
S3.2、将所述步骤S3.1中对应浓度的直肠癌化疗药物加入所述步骤S3.1选中的肠癌类器官；
S3.3、将经所述步骤S3.2处理的肠癌类器官在5％CO2中于37℃培养，期间捕获图像，测量培养过程中所述肠癌类器官的面积，通过比较培养过程中所述肠癌类器官的面积与其起始大小来计算生长/抑制效率，以0μM的药物剂量为基线绘制药物剂量-反应曲线，并且数据表示为从0μM开始的生长百分比，得到所述肠癌类器官的AUC；根据所述肠癌类器官的AUC比照疗效标准，得出所述肠癌类器官属于所述结直肠癌化疗药物的敏感组、中等组或耐药组。
CN202111507436.6A 2021-12-10 2021-12-10 预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用 Pending CN114134116A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111507436.6A CN114134116A (zh) 2021-12-10 2021-12-10 预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111507436.6A CN114134116A (zh) 2021-12-10 2021-12-10 预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114134116A true CN114134116A (zh) 2022-03-04

Family

ID=80385830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111507436.6A Pending CN114134116A (zh) 2021-12-10 2021-12-10 预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114134116A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118571500A (zh) * 2024-07-31 2024-08-30 南方医科大学南方医院 一种结直肠癌化疗反应预测系统及存储介质

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110207119A1 (en) * 2010-02-22 2011-08-25 Suchy Sarah L Methods for predicting a cancer patient's response to sunitinib
US20130012404A1 (en) * 2010-01-19 2013-01-10 Osaka Prefectural Hospital Organization Culture method, evaluation method and storage method for cancer-tissue-derived cell mass or aggregated cancer cell mass
CN103320383A (zh) * 2013-07-10 2013-09-25 杭州市萧山区中医院 一种培养大鼠毛囊干细胞的培养基
CN106701660A (zh) * 2017-01-16 2017-05-24 广东万海细胞生物科技有限公司 一种宫内膜干细胞无血清培养基
CN111534564A (zh) * 2020-04-17 2020-08-14 上海市第十人民医院 一种基于肠道类器官筛选药物的方法
CN111607495A (zh) * 2020-06-04 2020-09-01 奥格诺德生物科技(北京)有限公司 一种肿瘤类器官制备方法及其装置和应用
CN112176021A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 普罗布诺(重庆)生物技术有限公司 一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法
CN112195152A (zh) * 2020-09-29 2021-01-08 南方医科大学南方医院 一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用
WO2021113924A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Organoid cultures

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130012404A1 (en) * 2010-01-19 2013-01-10 Osaka Prefectural Hospital Organization Culture method, evaluation method and storage method for cancer-tissue-derived cell mass or aggregated cancer cell mass
US20110207119A1 (en) * 2010-02-22 2011-08-25 Suchy Sarah L Methods for predicting a cancer patient's response to sunitinib
CN103320383A (zh) * 2013-07-10 2013-09-25 杭州市萧山区中医院 一种培养大鼠毛囊干细胞的培养基
CN106701660A (zh) * 2017-01-16 2017-05-24 广东万海细胞生物科技有限公司 一种宫内膜干细胞无血清培养基
WO2021113924A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Organoid cultures
CN111534564A (zh) * 2020-04-17 2020-08-14 上海市第十人民医院 一种基于肠道类器官筛选药物的方法
CN111607495A (zh) * 2020-06-04 2020-09-01 奥格诺德生物科技(北京)有限公司 一种肿瘤类器官制备方法及其装置和应用
CN112195152A (zh) * 2020-09-29 2021-01-08 南方医科大学南方医院 一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用
CN112176021A (zh) * 2020-10-13 2021-01-05 普罗布诺(重庆)生物技术有限公司 一种体外构建的精准预测癌症患者用药的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘敏等: "消化道癌原代培养体外药敏试验的研究", 中国微生态学杂志, vol. 18, no. 6, pages 468 - 470 *
李恒善等: "应用MTT法对恶性肿瘤原代细胞培养进行规范化体外药敏试验的研究", 中国实用医药, vol. 15, no. 3, pages 197 - 198 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118571500A (zh) * 2024-07-31 2024-08-30 南方医科大学南方医院 一种结直肠癌化疗反应预测系统及存储介质
CN118571500B (zh) * 2024-07-31 2024-09-27 南方医科大学南方医院 一种结直肠癌化疗反应预测系统及存储介质

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Catenacci et al. Acquisition of portal venous circulating tumor cells from patients with pancreaticobiliary cancers by endoscopic ultrasound
Peng et al. An experimental model for the study of well-differentiated and dedifferentiated liposarcoma; deregulation of targetable tyrosine kinase receptors
Kolostova et al. Isolation, primary culture, morphological and molecular characterization of circulating tumor cells in gynecological cancers
CN109563486A (zh) 用于在癌症护理中做出患者特定的治疗决策的诊断方法
CN108179134A (zh) 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用
CN106489074A (zh) 作为转移性乳腺癌的生物标志物的s100p和透明质酸
US20090233324A1 (en) Methods for Diagnosing Cancer Using Samples Collected From A Central Vein Location or an Arterial Location
SG191028A1 (en) Method for the diagnosis of a carcinoma and uses thereof
CN114134116A (zh) 预测结直肠癌患者化疗药物疗效的试剂盒及其应用
KR102211972B1 (ko) 액체생검 다중 암 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 조기진단 및 치료 후 모니터링 방법
JP6173577B1 (ja) 細胞増殖法を用いた循環腫瘍細胞の検出・分離取得方法
CN111575385B (zh) Sb290157在卵巢上皮性癌疾病中的应用
CN112904006A (zh) 一种乳腺癌预后预测分子标志物及其应用
SK282091B6 (sk) Spôsob imunomagnetického oddeľovania buniek
RU2665965C1 (ru) Способ скрининга злокачественных новообразований у человека
CN116200451B (zh) 用于ptc药敏检测的试剂混合物及其混合方法和用途
WO2020233572A1 (zh) 多肽磁性纳米颗粒、其制备方法及应用
JP2013111021A (ja) 癌の再発リスクの判定方法及びその利用
US20240361327A1 (en) Detection and analysis of circulating tumor cells
Sciot et al. Adipocytic, vascular and skeletal muscle tumors: a practical diagnostic approach
Sriwidyani et al. High CD90 Expression is A Predictor of Axillary Nodal Metastasis in Breast Carcinoma
Zheng et al. Research Progress of Circulating Tumor Cells in the Evaluation of Early Cholangiocarcinoma
Madhavan Does the presence of disseminated tumour cells in bone marrow or circulating tumour cells predict early tumour recurrence in patients with oesophagogastric cancer?
Ismaili et al. Core Needle Biopsy Diagnosis of Fibroepithelial Lesions of the Breast in the Moroccan patients: Accuracy and Diagnostic Challenges
Anibat et al. Pre-analytical Performance in Surgical Pathology: Improvement of the Fixation Technique at Ibn Rochd University Hospital of Casablanca Morocco.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination