CN116200451B - 用于ptc药敏检测的试剂混合物及其混合方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于PTC药敏检测的试剂混合物及其混合方法和用途，属于生物技术领域。用于PTC药敏检测的试剂混合物，包括：模型培养试剂组和受测药物组；其中受测药物组包括以下至少一种药物组合：表阿霉素、环磷酰胺；多西他赛、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；多西他赛、卡铂、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；多西他赛、表阿霉素、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗；T‑DM1、帕妥珠单抗；或多西他赛、曲妥珠单抗、吡咯替尼。本发明试剂混合物用于PTC药敏检测，通过PTC药敏检测对治疗方案的临床疗效进行预测，从而选择有针对性的个性化治疗方案，实现精准医疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于PTC药敏检测的试剂混合物及其混合方法和用途。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率呈现逐年上升的趋势，居女性癌种发病率首位。
HER2阳性乳腺癌是新辅助治疗获益的主体人群，但目前抗HER2治疗和化疗的方案众多，尚缺乏个体化指导制定方案的策略，临床实践中只能凭借经验或临床习惯选择抗HER2治疗药物以及不同的化疗配伍。具体而言，面临两个主要问题：1）当前基于大分子单抗或者小分子TKI的治疗方案至多达到60%左右的病理学完全缓解（pCR）。达到pCR者在后续的5~10年终依然面临着约10%左右的患者发生复发转移、未达到pCR者整体面临超过25%的患者复发转移；2）未达到pCR者虽然目前可以使用T-DM1在辅助阶段与单用曲妥珠单抗比较有生存获益，但与两个大分子单抗联用或者与小分子TKI比较来说并没有明确结果能提示更优，且无论何种加强方案依然有不少于15%的病人发生复发转移，且其中相当一部分属于难治的脑/脑膜转移，究竟如何在新辅助未达pCR后选择进一步加强的策略也非常缺乏个体化指导。
恶性肿瘤的发病率逐年升高，而其中化疗以及靶向治疗是中晚期肿瘤最主要的治疗手段。但是在临床实践中我们发现，同样的肿瘤不同的患者，即使使用相同的化疗方案，其有效率也有很大差别。为达到更好的治疗效果，使患者的治疗方案个性化迫在眉睫。肿瘤类器官药敏检测可以通过手术或穿刺活检等方式，取到新鲜的肿瘤细胞在几小时内运到实验室。由实验室模拟人体器官环境进行肿瘤细胞培养。将肿瘤组织分为多份，培养成功以后，按照人体内的化疗药或靶向药的浓度，将不同的药物加入到肿瘤的培养基当中观察疗效。例如中国专利CN114032277A公开了一种基于染色法的肿瘤类器官药物敏感性检测方法，该专利基于细胞染色，使用肿瘤患者源的类器官，直接计算活死细胞数量，进行活力分析，从而判断样本对药物的敏感性。对于药敏检测的其他方面，还需要更多研究。
发明内容
本发明提供一种PTC（Patient-Derived tumor-like Cell Clusters，PTC）药敏检测方案以及PTC药敏检测在预测乳腺癌临床疗效中的用途。使用本发明PTC药敏检测方案进行检测后，能够通过检测结果直接判断治疗方案的临床疗效，有助于选择疗效最好的方案对患者进行治疗，从而为患者制定个性化治疗方案，有助于患者康复。
为达到上述发明目的，采用如下技术方案。
用于PTC药敏检测的试剂混合物，包括：
模型培养试剂组和受测药物组；
其中受测药物组包括以下至少一种药物组合：
（1）表阿霉素和环磷酰胺；
（2）多西他赛、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（3）多西他赛、卡铂、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（4）多西他赛、表阿霉素、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（5）T-DM1和帕妥珠单抗；或
（6）多西他赛、曲妥珠单抗和吡咯替尼。
优选地，模型培养试剂组包括消化液、培养基和基质胶。
更优选地，消化液包括消化液A和消化液B。
更进一步优选地，消化液A的配制方法为：向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加100-120mg II型胶原酶、10-25g透明质酸酶，混合均匀即得消化液A；
消化液B的配制方法为向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加470-550mg分散酶和10-12mg DNase Ⅰ，混合均匀即得消化液B。
本发明还公开了上述用于PTC药敏检测的试剂混合物的混合方法，混合方法包括消化液的混合，消化液包括消化液A和消化液B；其中，
消化液A的混合方法为：向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加100-120mgII型胶原酶、10-25g透明质酸酶，混合均匀即得消化液A；
消化液B的混合方法为：向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加470-550mg分散酶和10-12mg DNase Ⅰ，混合均匀即得消化液B。
本发明还公开了上述用于PTC药敏检测的试剂混合物在PTC药敏检测中的用途。
本发明还公开了上述用于PTC药敏检测的试剂混合物的使用方法，包括如下步骤：
使用模型培养试剂组培养微肿瘤PTC模型：
取癌组织洗涤后剪切并使用消化液进行消化；消化后加入培养基进行培养；培养后加入基质胶，培养微肿瘤PTC模型；
使用受测药物组进行药敏检测：和
将微肿瘤PTC模型与不同药物组合共同作用。
优选地，上述用于PTC药敏检测的试剂混合物的使用方法，包括如下步骤：
使用模型培养试剂组培养微肿瘤PTC模型：
取癌组织使用含青霉素-链霉素混合液洗涤后剪切并加入消化液A，37℃进行消化1-2h；消化后离心弃上清，使用消化液B继续在37℃消化10-15min；消化结束后加入HBSS终止消化；之后离心弃上清，使用HBSS重悬沉淀后过滤；过滤后除去滤液，加入红细胞裂解液，混匀后静置3-5min，再次离心，弃上清；之后加入培养基重悬细胞，并加入基质胶混匀，得细胞悬液。将细胞悬液接种于6孔板，置于37℃培养基培养30-60min；培养后取出6孔板，每孔加入类器官培养基继续培养。
更优选地，加入基质胶的同时，添加人血清和鲑降钙素。人血清和鲑降钙素的加入有利于微肿瘤PTC模型的快速构建，并且能有效提高微肿瘤PTC模型构建的成功率。
更进一步优选地，每毫升基质胶添加2-7mg鲑降钙素。
更进一步优选地，所添加的基质胶与人血清的体积比为1-2:0.1-0.5。
优选地，微肿瘤PTC模型包括患者癌组织。
更优选地，患者癌组织包括原发上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。
优选地，共同作用的时间为24-72h。
优选地，使用受测药物制进行药敏检测后，检测微肿瘤PTC模型中细胞生长抑制率。
更优选地，根据细胞生长抑制率判断受测药物组合有效性的标准为：细胞生长抑制率＞30%。
更优选地，根据细胞生长抑制率预测治疗方案临床疗效的标准为：
至少达到CR，抑制率＞70%；
至少达到PR，抑制率30-70%；
至少达到SD，抑制率10-30%。
本发明还公开了一种PTC药敏检测方法，包括使用上述的用于PTC药敏检测的试剂混合物进行检测。
优选地，药敏检测方法包括以下至少一种检测方案：
（1）表阿霉素和环磷酰胺；
（2）多西他赛、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（3）多西他赛、卡铂、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（4）多西他赛、表阿霉素、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（5）T-DM1和帕妥珠单抗；或
（6）多西他赛、曲妥珠单抗和吡咯替尼。
不同于其他大众疾病，肿瘤的复杂性导致肿瘤患者对抗肿瘤药物的敏感性千差万别，因此进行药敏检测有助于为患者选择更加个性化的治疗方案，从而提高治疗效果。
优选地，判断上述方案有效的标准为：
对细胞的抑制率大于30%。
更优选地，上述方案对细胞的抑制率的分级有以下5个等级：
强杀伤，抑制率＞70%，剩余细胞活力0-30%；
有效杀伤，抑制率30-70%，剩余细胞活力30-70%；
稳定，抑制率10-30%，剩余细胞活力70-90%；
耐药，抑制率0-10%，剩余细胞活力90-100%；
强烈耐药，抑制率为0，剩余细胞活力为100%。
根据上述标准对药敏检测结果对临床治疗的疗效进行预测，根据预测结果，选择合适的治疗方案进行临床治疗。试验发现，根据药敏检测结果预测的临床疗效与实际治疗中获得的疗效一致。
更进一步优选地，选取治疗方案的标准包括：
若几个方案的抑制率均属于有效杀伤等级，即当A方案和B方案的抑制率均落在有效杀伤等级时，根据抑制率，A-B≥0.1时，选择A方案；A-B＜0.1时，选择毒副作用小的方案。
本发明还公开了PTC药敏检测在在预测乳腺癌临床疗效中的用途。本发明通过临床试验表明，PTCs不仅可以准确地预测治疗初期乳腺癌患者的药物反应，而且还可以帮助临床医生识别潜在的pCR反应或最差反应的患者。在临床决策中前瞻性进行测试或许可以提供最佳的治疗选择。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过PTC药敏检测对治疗方案的临床疗效进行预测，从而选择有针对性的个性化治疗方案，实现精准医疗。经过治疗后对患者的跟踪走访记录统计出，通过PTC药敏检测确定治疗方案的患者术后病理分级达到M&P4～5级的超过70%，说明治疗方案有效率高于70%，并且通过PTC药敏检测确定治疗方案的患者有超过30%达到了病理完全缓解。经过对患者术后M&P分级与PTC引导方案杀伤率进行相关性分析，病理诊断准确率可达77%以上。此外，本发明在构建微肿瘤PTC模型时，除使用基质胶，还在使用基质胶的同时加入人血清和鲑降钙素，有利于微肿瘤PTC模型的快速构建，并且能有效提高微肿瘤PTC模型构建的成功率。
附图说明
图1为培养过程中加入基质胶、人血清和鲑降钙素的微肿瘤PTC模型的显微观察结果；
图2为培养过程中加入基质胶的微肿瘤PTC模型的显微观察结果；
图3为PTC药敏检测在预测治疗方案的临床疗效中的ROC曲线。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与本公开的一些方面相一致的方法的例子。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。类器官培养基购自合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司，货号PRS-BCM-3D；Advanced DMEM/F-12培养基购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号12634028。
实施例1
微肿瘤PTC模型建立
1、志愿者招募
入选标准：
1. 经病理诊断的浸润性乳腺癌；
2. 临床分期T1-4N0-3M0；
3. 经病理免疫组化诊断HER2表达3+或FISH检测阳性表达；
4. 拟接受新辅助治疗（术前治疗），或已接受新辅助治疗后进行手术拟行术后辅助阶段治疗者；
排除标准：
1.经过任何未被包含在方案内的抗肿瘤治疗者；
2.存在明确远处转移者；
3.不计划行手术者；
4.存在严重心脑血管等合并症无法接受化疗或靶向治疗者。
将志愿者分为PTC组和常规治疗组。
2、样本收集
新辅助治疗前:
手术癌组织每次100mg，共需100mg或者穿刺癌组织每次4条，共需4条；视情况抽取外周血每次10mL，共需10mL；
新辅助治疗后：
手术癌组织每次100mg，共需100mg或者穿刺癌组织每次4条，共需4条；视情况抽取外周血每次10mL，共需10mL。
3、制备微肿瘤PTC模型
取PTC组患者癌组织使用含青霉素-链霉素混合液洗涤后剪切并加入消化液A，37℃进行消化2h；消化后离心弃上清，使用消化液B继续在37℃消化15min；消化结束后加入HBSS终止消化；之后离心弃上清，使用HBSS重悬沉淀后过滤，滤网孔径为100μm；过滤后除去滤液，加入红细胞裂解液，混匀后静置3min，再次离心，弃上清；之后加入Advanced DMEM/F-12培养基重悬细胞，并加入培养基体积2倍的基质胶混匀（或：加入培养基体积2倍的基质胶，加入基质胶体积0.5倍的人血清，加入鲑降钙素并使鲑降钙素的终浓度为3mg/mL，混匀），得细胞悬液；将细胞悬液接种于6孔板，每孔50μL，接种后倒置于37℃培养基培养40min；培养后取出6孔板，每孔加入类器官培养基2mL，37℃培养；每3d更换一次培养基，并观察微肿瘤PTC模型的形成和生长状态。
其中，消化液A的配制方法为：向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加120mgII型胶原酶、20g透明质酸酶，混合均匀即得消化液A；消化液B的配制方法为向100mLAdvanced DMEM/F-12培养基中添加500mg分散酶和10 mg DNase Ⅰ，混合均匀即得消化液B。
共对46例患者进行微肿瘤PTC模型的培养，将来自同一患者的癌组织分为两份，一份在培养过程中仅加入基质胶；另一份加入基质胶的同时还加入了人血清和鲑降钙素；最终，仅加入基质胶的一组中有共有37例成功构建，加入基质胶的同时还加入了人血清和鲑降钙素的一组共有41例成功构建。在此仅展示1号患者癌组织培养成的微肿瘤PTC模型，该患者的两份微肿瘤PTC模型（一份在培养过程中仅加入基质胶；另一份加入基质胶的同时还加入了人血清和鲑降钙素）生长到第5天的如图1和图2所示；图1为在培养过程中加入基质胶的同时还加入了人血清和鲑降钙素的微肿瘤PTC模型，图2为在培养过程中仅加入基质胶的微肿瘤PTC模型；图1中细胞成团更明显，并且形状较图2更加规则，成团更大；说明图1较图2的生长和成团速度更快，因此人血清和鲑降钙素的加入有利于微肿瘤PTC模型的快速构建，并且能有效提高微肿瘤PTC模型构建的成功率。
实施例2
PTC药敏检测
1、PTC药敏检测方案如下：
（1）表阿霉素和环磷酰胺；
（2）多西他赛、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（3）多西他赛、卡铂、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（4）多西他赛、表阿霉素、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（5）T-DM1和帕妥珠单抗；
（6）多西他赛、曲妥珠单抗和吡咯替尼。
检测方法包括如下步骤：
取上述制得的微肿瘤PTC模型，分别经不同药敏检测方案的药物作用24h，使用MTT试剂盒测试细胞活力，并计算药物抑制率；对细胞的抑制率大于30%则认为药物组合方案有效，并根据细胞生长抑制率判断药物组合方案的等级：
上述方案对细胞的抑制率的分级有以下5个等级：
强杀伤，抑制率＞70%，剩余细胞活力0-30%；
有效杀伤，抑制率30-70%，剩余细胞活力30-70%；
稳定，抑制率10-30%，剩余细胞活力70-90%；
耐药，抑制率0-10%，剩余细胞活力90-100%；
强烈耐药，抑制率为0，剩余细胞活力为100%。
2、治疗方案设计
PTC组根据药敏结果给患者个性化选择新辅助治疗方案，选择标准如下：
若几个PTC药敏检测的药物组合方案的抑制率均属于有效杀伤等级，即当A方案和B方案的抑制率均落在有效杀伤等级时，根据抑制率，A-B≥10%时，选择A方案；A-B＜10%时，选择毒副作用小的方案。
常规治疗组根据临床常规选择TCH(P)*6、EC*4-TH(P)*4方案进行新辅助治疗，依据计划在术前完成全部周期治疗，达到完全缓解（CR）或部分缓解（PR）或疾病稳定（SD）的目标。其中，CR、PR和SD的判断标准为：
CR：临床检查肿瘤消失并且维持4周以上；
PR：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积减少50%以上；并且维持4周以上；
SD：肿瘤最大直径与其最大垂直径的乘积减少＜50%或增加＜25%，并且维持4周以上。
设计方案后，预估PTC组患者的治疗效果；治疗过程中的主要参考指标包括：总体病理完全缓解率（tpCR）、客观缓解率（ORR），次要参考指标包括乳腺癌治疗后2年内无浸润性癌复发率（2y-IDFS），乳腺癌治疗后5年内无浸润性癌复发率（5y-IDFS），总生存期（OS）。
检测方案对患者病例缓解程度的预测指标如下：
至少达到CR，抑制率＞70%；
至少达到PR，抑制率30-70%；
至少达到SD，抑制率10-30%。
在此仅举例1号患者经PTC药敏检测所筛选出的最佳药物组合方案的检测结果：
经PTC药敏检测选择的最敏感药物组合方案为多西他赛、曲妥珠单抗、吡咯替尼，该方案的抑制率为64.7%；无效的方案为表阿霉素、环磷酰胺，该方案的抑制率小于10%。根据预测，该患者完成全部治疗周期后至少能够达到PR。
治疗过程中及时记录临床疗效，并进行后续跟踪和走访记录。
5、治疗结果统计
1号患者经多西他赛、曲妥珠单抗和吡咯替尼方案治疗4个周期后，顺利达到了PR。
在全部分子分型的患者中，PTC药物测试中最敏感的方案与临床治疗方案一致的有21例，其中术后病理分级为M&P4~5级（视为治疗有效）的有15例，有效率达到71.4%，病理完全缓解7例。
对接受过治疗前PTC药物测试并且进行新辅助化疗和手术的患者进行统计，并对术后M&P分级与PTC引导方案有效率进行相关性分析，绘制ROC曲线，如图3所示，p<0.01，相关性显著，AUC为77.4%，说明PTC检测的准确率高，达到77%以上。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.用于PTC药敏检测的试剂混合物，其特征在于，所述试剂混合物包括：模型培养试剂组和受测药物组；其中，
所述模型培养试剂组包括消化液、培养基、基质胶、血清和鲑降钙素；所述消化液包括消化液A和消化液B；所述消化液A的混合方法为：向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加100-120mg II型胶原酶、10-25g透明质酸酶，混合均匀即得消化液A；所述消化液B的混合方法为：向100mL Advanced DMEM/F-12培养基中添加470-550mg分散酶和10-12mg DNaseⅠ，混合均匀即得消化液B；
所述受测药物组包括以下至少一种药物组合：
（1）表阿霉素和环磷酰胺；
（2）多西他赛、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（3）多西他赛、卡铂、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（4）多西他赛、表阿霉素、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；
（5）T-DM1和帕妥珠单抗；或
（6）多西他赛、曲妥珠单抗和吡咯替尼。
2.微肿瘤PTC模型的培养方法，其为使用权利要求1中所述的模型培养试剂组培养微肿瘤PTC模型，具体为：取癌组织洗涤后剪切并使用消化液进行消化；消化后加入培养基进行培养；培养后加入基质胶、人血清和鲑降钙素，培养微肿瘤PTC模型。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，每毫升基质胶添加2-7mg鲑降钙素，基质胶与人血清的体积比为1-2:0.1-0.5。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述癌组织包括原发上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。
5.人血清和鲑降钙素在培养微肿瘤PTC模型中的用途。
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