CN109744199A - 一种肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用，通过将患者肿瘤组织解离的原代细胞植入斑马鱼的体内，得到患者来源的肿瘤异种移植模型。本发明所建立的肿瘤异种移植模型，保留了临床上人胃癌组织的病理特征，具有更高的临床相关性，可以用于系统地研究肿瘤的增殖、转移、扩散和耐药的机制，以及筛选有效的肿瘤治疗药物。

Description

一种肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种患者来源的胃癌异种移植的斑马鱼模型、其构建方法及应用。

背景技术

肿瘤疾病已经成为全世界重大的公共卫生问题，最常见的肿瘤有肺癌、胃癌、乳腺癌等。

其中，胃癌是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在东亚地区最为高发。世界卫生组织(WHO)公布的《2014年全球癌症报告》数据显示，2012年中国新增的胃癌病例和死亡人数均占全球的40％以上。2016年，美国癌症学会(ACS)主办的权威期刊《CA Cancer JClin》中新发表的中国2015年癌症统计报告显示，中国2015年胃癌的新发病例为67.91万例，其中，男性新发病例数为47.77万例，位列男性高发癌症的第二位，仅次于肺癌。女性新发病例数为20.14万例，位列女性高发癌症的第三位，仅次于乳腺癌和肺癌。胃癌已经成为中国人群中第二位致死癌症，死亡病例数为49.8万例，仅次于肺癌。

早期胃癌患者进行根治性切除术后的5年生存率可达90％，但是由于胃癌早期症状不明显和胃镜常规检查普及不足等原因，我国胃癌患者就诊时约80％已到晚期。现有的胃癌治疗手段有限，单纯手术治疗的总生存率只有20％左右，放疗和化疗常用于术前或术后的辅助性治疗。胃癌的药物治疗仍然以经典化疗药物为主，如5-氟尿嘧啶，紫杉醇和铂类，靶向药物在胃癌治疗中尚处于临床试验阶段。由于胃癌是一种异质性极高的肿瘤，现有的众多临床方案表明，化疗可延长胃癌患者的生存时间，但目前尚未找到公认的、优势明显的符合个性化用药的“金标准”治疗方案。很多患者因未能接受与个体最为匹配的药物而失去原本的治疗窗。因此，胃癌临床上急需个性化的用药方案指导。

另外，肺癌是当今恶性肿瘤相关死亡的首要原因。流行病学资料显示，2012年全球肺癌死亡病例数约为160万，占全部恶性肿瘤死亡的19.4％。在中国新近公布的统计数据中，中国2015年肺癌新发病例约73万，死亡病例约61万，发病率及死亡率均已成为恶性肿瘤首位。男性肺癌新发病例及死亡率居所有恶性肿瘤之首，女性肺癌新发病例及死亡率均明显低于男性，新发病例居第四位(低于乳腺癌、结直肠癌及宫颈癌)，死亡率居第二位(仅次于乳腺癌)。尽管近年来肺癌治疗手段有较快发展，然而总体预后并无明显改善，目前5年总生存率仅为16％-18％。

肺癌的种类较多，其中最常发生的是非小细胞肺癌(NSCLC)，并且由于肺癌早期缺乏特异性症状，当多数患者确诊时病情已发展至中晚期，治疗难度进一步加大。非小细胞肺癌占肺癌总体的80％以上，在首次确诊的病例中，有25％～30％为局部晚期，40％～50％已有转移灶。目前对NSCLC的化疗，仍然以美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国国立综合癌症网络(NCCN)推荐的铂类联合第三代化疗药的两药化疗方案为主。如吉西他滨+铂类、多西他赛+铂类、长春瑞滨+铂类、培美曲赛+铂类等。对于其他类型的肺癌，目前临床上常用的化疗药物有顺铂、吉西他滨、多柔比星、紫杉醇、长春新碱等。此外，表皮生长因子受体(EGFR)-TK抑制剂(TKI)是肺癌中针对EGFR靶点的小分子抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼及埃克替尼等。阿法替尼和达克替尼均进入临床阶段，成为新的高效、不可逆的治疗肺癌的前景药物。

虽然治疗肺癌的药物较多，但是患者的生存率并没有明显改善，而且化疗属于姑息性的，主要目的是延长患者生存期，提高其生活质量。目前常用的抗肿瘤化疗药物对患者治疗的有效性不仅低于70％，而且，由于缺乏化疗药物个体化治疗的遗传学分析，使20％～40％的患者甚至有可能接受了错误的药物治疗，同样病理类型、病期甚至分子表型相同的患者在接受相同方案治疗后可能产生“天壤之别”的结果。因此，对高危人群进行早期筛查，分子水平上检测基因突变类型，在多种临床治疗方案中寻找符合个性化用药的治疗方案是未来肺癌治疗的发展方向。很多患者因未能接受与个体最为匹配的药物而失去原本的治疗窗。因此，肺癌临床上急需个性化的用药方案指导。

病人(患者)来源的肿瘤异种移植模型(Patient-derived tumor xenograft，PDX)，是指将患者的新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷动物上，依靠动物体提供的微环境进行生长。与人源肿瘤细胞系异种移植模型相比，PDX模型肿瘤的分化程度、形态特征、结构特点以及分子特性等与患者本身的肿瘤特点更为接近，这为肿瘤的生物学研究、诊断标志物的寻找和药物筛选提供了一个重要的体内模型。此外，PDX模型能够体现标本来源患者自述肿瘤的特点，包括对药物反应的特异性等。因此，PDX模型具有比传统肿瘤细胞系异种移植模型具有更高的临床相关性，对肿瘤临床前期评估、治疗和预后具有更加重要的转化意义，特别是对于肿瘤的个体化诊断和治疗具有不可代替的价值。目前，小鼠是最常用的肿瘤PDX模型动物，但是由于小鼠肿瘤接种、成瘤和药效评价时间通常为3个月，而很多患者的生存期不足3个月，因此，已有的PDX模型不能满足临床实时指导个体化用药的重大需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种患者来源的肿瘤细胞异种移植动物模型及其构建方法与在肿瘤治疗药物筛选中的用途。

本发明首先提供一种患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型，该斑马鱼胚胎移植有患者来源的肿瘤组织分离培养的原代单细胞。所述的肿瘤包括但不限于实体瘤与血液瘤，尤其是实体瘤，特别是肺癌、胃癌。

本发明所述斑马鱼胚胎的移植是在斑马鱼受精后的24-72小时内进行，最好是在36-60小时内，更优选在48小时进行。所述移植的部位在斑马鱼的胚胎卵黄囊。

本发明所述来自患者的肿瘤组织的原代单细胞在移植到斑马鱼的胚胎前是经过染色试剂染色的，所述的染色试剂也称为染色染料，选自为荧光染料，优选为荧光染料CM-Dil，染料浓度为1-5μg/ml。

本发明另一方面提供上述患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型在研究肿瘤如胃癌、肺癌的增殖、转移、扩散或耐药的机制，或者筛选有效的肿瘤如胃癌、肺癌治疗药物的应用。特别的，本发明的肿瘤细胞移植斑马鱼模型尤其适用于肿瘤细胞增殖情况的研究，特别是治疗药物的活性作用研究。对于药物的治疗作用研究，特别适用于5-FU(5-氟尿嘧啶)对胃癌患者或者是吉非替尼、顺铂或多西他赛对肺癌患者的单用或联用的治疗效果研究。

本发明所述的患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型用于筛选有效的肿瘤治疗药物的应用包括如下步骤：确定肿瘤候选药物对未经移植的胚胎的安全范围内的最高药物浓度；以胚胎安全范围内的药物浓度的候选药物浸泡所述的患者来源的肿瘤细胞异种移植马鱼胚胎，并选用候选药物的溶解溶剂作为对照药物同法处理；在荧光显微镜下对斑马鱼胚胎中患者来源的细胞的增殖、扩散的情况进行定性分析或/和定量分析。所述定量分析按下式公式计算抗肿瘤效果：药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％，当抑制率小于100％时，表示该药物具有抑制肿瘤效果，数值越小，抑制肿瘤效果越显著。

其中，候选药物浸泡斑马鱼胚胎处理的时间为持续2到5天，优选3天。观察时间优选为第1、4、7天，也可以仅在第7天观察计算。

更具体而言，本发明所述的患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型用于筛选有效的肿瘤如肺癌、胃癌治疗药物的具体步骤如下：

(1)以不同浓度的备选药物处理受精后一到三天龄、优选两天龄的未经移植的斑马鱼胚胎，持续处理三到五天，优选四天，根据胚胎存活情况确定胚胎安全范围内的最高药物浓度；

(2)以确定的所述胚胎安全范围内的最高药物浓度的所述备选药物对受精后1到3天龄、优选两天龄的已注射过患者来源的胃癌细胞的斑马鱼胚胎，处理2到5天、优选3天，并选用备选药物的溶剂作为对照药物同法处理。

(3)观察比较处理后的斑马鱼胚胎中红色患者来源的细胞的增殖、扩散的情况。在荧光显微镜下对红色细胞进行拍照，并用Image Pro Plus软件对红色荧光强度定量，并用公式计算药物的抗肿瘤效果。

本发明的第三方面是提供一种患者来源的肿瘤如肺癌、胃癌细胞异种移植斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)将患者来源的肿瘤临床手术组织标本解离成原代单细胞；

(2)将解离所得的原代单细胞染色；

(3)将步骤(2)得到的原代单细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊内。

所述的构建方法中步骤(1)所述的解离包括：将样本在生理盐水中进行无菌清洁后，在磷酸盐缓冲液中剪切成小块，经胰酶消化至解离完全，离心，去除胰酶；步骤(2)所述染色，使用的染料为CM-Dil，染料浓度为1-5μg/ml，染色时间为1-10小时，染色后去除染料，磷酸盐缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为5×10³-5×10⁵个/μl；步骤(3)所述的注射包括：将受精后36-60小时的斑马鱼胚胎固定，采用显微注射器在体视镜下，将10-30nl，优选为20nl的步骤(2)得到的原代细胞注射入斑马鱼胚胎卵黄囊内。

本发明所述的构建方法，在所述的步骤(3)后还包括使用荧光显微镜进行定性分析或/和定量分析的观察步骤。所述观察步骤可以在异种移植细胞后的第1-7天内，将斑马鱼胚胎用三卡因麻醉，经荧光显微镜观察荧光细胞在斑马鱼体内的转移和扩散情况。

本发明所述的构建方法，更具体而言，步骤(1)具体为：将临床手术胃癌组织样本用磷酸缓冲液洗涤2遍，手术剪刀将其剪切成1mm³的小块后，经0.25％胰酶37℃消化10-120分钟，待观察到组织块解离完全后，离心，去除胰酶；

步骤(2)中CM-Dil染料的终浓度为2μg/ml，染色时间为1-10小时。离心去除染料，磷酸缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为5×10³-5×10⁵个/μl；

步骤(3)，具体为：将受精后36-60小时斑马鱼胚胎固定，采用显微注射器在体视镜下，将10-30nl，优选为20nl步骤(2)得到的原代细胞注射入斑马鱼胚胎卵黄囊。本发明使用的斑马鱼是国际公认的模式脊椎动物，基因与人类基因具有高度同源性(>85％)，是经典的发育生物学研究模型，也可作为药物活性筛选、药物毒性评价和人类疾病研究的常用动物模型。

利用本发明的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型进行胃癌药物筛选的应用，可以准确的筛选出5-FU(5-氟尿嘧啶)对哪些患者有效，哪些患者则无效，为临床用药提供准确的指导。利用本发明的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型进行肺癌药物筛选的应用时，可以准确的筛选出吉非替尼、、顺铂或多西他赛的单用或联用对哪些患者有效，对哪些患者则无效，为临床用药提供准确的指导。

本发明所述的CM-Dil是一种染料，通过与膜结构的脂质分子结合而标记细胞，有着强而稳定的红色荧光(激发峰553nm/发射峰570nm)，与Dil不同，它水溶性更好，所以对于细胞染色更为方便有效；它的CM基团(即氯甲基替代基团)能与多肽及蛋白上的巯基反应从而使该分子在醛类物质中保持稳定，所以CM-Dil标记细胞后再进行固定、破膜及石蜡包埋操作都不会影响其荧光，是免疫荧光、免疫组化和原位杂交中理想的细胞荧光标记染料。另外，CM-Dil对细胞无毒，且稳定长效，能很好地长期示踪细胞。研究证实，CM-Dil标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达98％以上，标记细胞形态良好，能有效地观察细胞在体外的诱导分化情况；或将标记的细胞注入体内，可以有效的显示移植细胞在活体组织中的迁移及分化。CM-Dil具有如下化学名：3H-Indolium,5-[[[4-(chloromethyl)benzoyl]amino]methyl]-2-[3-(1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-octadecyl-2H-indol-2-ylidene)-1-propenyl]-3,3-dimethyl-1-octadecyl-,chloride。

本发明中使用的斑马鱼具有体积小，生长快，发育早期通体透明的特点。基于斑马鱼的PDX模型具有成本低，通量高，操作简单，便于在体观察的优势，更重要的是，基于斑马鱼的PDX模型的实验周期短，只需1周，是目前唯一有望满足实时指导实体瘤如胃癌和肺癌的个体化用药临床需求的动物模型。

本发明通过构建患者来源的胃癌异种移植斑马鱼模型，可以用于筛选是否有效的肿瘤治疗药物，特别是筛选剔除掉那些对患者没有治疗效果的药物。本发明的患者来源的肿瘤异种移植(PDX)模型与人肿瘤(胃癌、肺癌等)细胞系异种移植模型相比，在指导临床胃癌患者个性化用药上有更高的准确性。

本发明使用荧光法进行肿瘤治疗药物有效评价的方法，该方法简单有效，适合临床需求。

本发明提供的斑马鱼模型对于评价5-FU(5-氟尿嘧啶)对胃癌患者或者吉非替尼、顺铂或多西他赛对肺癌患者的单用或联用的治疗效果研究提供了简单有效的方法。

附图说明

图1是实施例1患者来源的胃癌原代细胞注射入斑马鱼胚胎的表型。

图2是本发明实施例2中两例5-FU非敏感患者#1、#2来源的胃癌细胞异种移植斑马鱼模型评价5-FU的抗癌效果。

图3是本发明实施例2中两例5-FU敏感患者#3、#4来源的胃癌异种移植斑马鱼模型评价5-FU的抗癌效果。

图4是两例人类胃癌细胞株的异种移植斑马鱼模型评价5-FU的抗癌效果。

图5是本发明实施例4中经姜黄素处理的患者来源的胃癌异种移植斑马鱼模型的表型。

图6是本发明实施例4中患者来源的胃癌异种移植斑马鱼模型评价姜黄素的抗癌效果。

图7是实施例5患者来源的肺癌原代细胞注射入斑马鱼胚胎的表型。

图8是本发明实施例6中*1、*2患者来源的肺癌细胞建立的异种移植斑马鱼模型用于评价顺铂+多西他赛联合用药的抗癌效果。

图9是本发明实施例6中*3、*4患者来源的肺癌细胞建立的异种移植斑马鱼模型用于评价顺铂+多西他赛联合用药的抗癌效果。

图10是本发明实施例7中*5、*6患者来源的肺癌细胞建立的异种移植斑马鱼模型用于评价吉非替尼的抗癌效果。

图11是本发明实施例7中*7、*8患者来源的肺癌细胞建立的异种移植斑马鱼模型用于评价吉非替尼的抗癌效果。

图12实施例8的两例人类肺癌细胞株的异种移植斑马鱼模型评价吉非替尼的抗癌效果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述，但下例实施例不应看作对本发明范围的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述实验方法，也可以体现患者来源的胃癌或肺癌异种移植(PDX)模型与人胃癌或肺癌细胞系异种移植模型在指导临床胃癌患者个性化用药的准确性的差异。

实施例1：本发明的患者来源的胃癌细胞异种移植斑马鱼模型的构建

1.胃癌组织原代细胞的分离

将患者来源的临床组织活检为胃癌的手术标本放置于生理盐水中，在无菌条件下清除肿瘤组织表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织，用灭菌后的眼科剪将组织剪碎，经无菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)洗2次，加入少量磷酸缓冲液，用弯头眼科剪反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm³大小。加入0.25％胰酶，37℃消化10分钟，待观察到组织块解离完全后，离心，去除胰酶。用含10％FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基重悬细胞。

2.原代细胞的染色

将解离所得的原代单细胞用CM-Dil染色，染料终浓度为2μg/ml，染色时间为1小时。离心去除染料，磷酸缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为1×10⁴/μl。

3.细胞移植

将已染色的细胞装载到显微注射针中，将受精后48小时斑马鱼胚胎固定，用显微注射器在体视镜下，将20nl步骤(2)得到的原代细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊内。

4.荧光显微镜观察

在注射后的7天内，采用荧光显微镜观察斑马鱼体内患者来源的细胞的生长、转移和扩散的情况，并拍照。

如图1所示，患者来源的胃癌细胞在斑马鱼胚胎内显示出增殖和扩散的表型。注射后4天，可见患者来源的胃癌细胞已经向腹部和头部扩散。注射后7天，可见患者来源的胃癌细胞已经扩散至斑马鱼胚胎尾部和脑部。

实施例2：4例患者来源的异种移植斑马鱼模型用于评估5-FU临床的抗癌效果

1.安全剂量的确定

以不同浓度的5-FU处理(浸泡)受精后两天龄的斑马鱼胚胎，持续处理三天，确定胚胎安全范围内的最高5-FU浓度为4000μM。

2.药物处理斑马鱼胚胎

选用4000μM和400μM的5-FU作用于(浸泡)按实施例1方法制备得到的已注射不同患者来源的胃癌原代细胞的斑马鱼胚胎模型，连续作用三天，并用0.1％DMSO作为溶剂对照。

3.荧光显微镜观察抑瘤效果

观察比较处理后的斑马鱼胚胎中红色患者来源的细胞的增殖、扩散的情况。在荧光显微镜下对红色细胞进行拍照，并用Image Pro Plus软件对红色荧光强度定量，计算5-FU的抗肿瘤效果，计算公式：药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％(见图2、图3)。

患者来源的胃癌异种移植斑马鱼模型结果显示，在注射后7天时，#1、#2两例胃癌患者来源的胃癌细胞对5-FU不敏感，没有明显的抑瘤效果，而临床上该两名胃癌患者使用5-FU治疗胃癌的效果也均无明显疗效。#3、#4两例胃癌患者来源的胃癌细胞对5-FU敏感，肿瘤增殖明显被抑瘤，而临床上该两名胃癌患者使用5-FU治疗后，症状明显改善。

因此，患者来源的胃癌异种移植斑马鱼模型的药物评价结果与临床效果高度关联。

实施例3：两例人类胃癌细胞株(SGC-7901和AGS)的异种移植斑马鱼模型用于评估5-FU的抗癌效果

1.药物处理斑马鱼胚胎

选用4000μM和400μM的5-FU作用于(浸泡)已注射胃癌细胞株(SGC-7901和AGS)的斑马鱼胚胎(按实施例1的方法构建)，连续作用三天，并用0.1％DMSO作为溶剂对照。

2.荧光显微镜观察抑瘤效果

观察比较处理后的斑马鱼胚胎中红色患者来源的细胞的增殖、扩散的情况。在荧光显微镜下对红色细胞进行拍照，并用Image Pro Plus软件对红色荧光强度定量，计算5-FU的抗肿瘤效果,，计算公式：药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％(见图4)。

人类胃癌细胞株异种移植斑马鱼模型结果显示，在注射后7天时，两个胃癌细胞株对5-FU均比较敏感。因此，用细胞株建立的异种移植斑马鱼模型评价临床药物5-FU的抗胃癌效果与实际临床疗效之间有差异，不能用于指导胃癌的临床用药。

实施例4：患者来源的胃癌异种移植动物模型用于评估姜黄素的抗胃癌效果

1、将四组，每组四只随机抽取的受精后两天龄的斑马鱼胚胎分别置于含0.1％DMSO的姜黄素水溶液中，姜黄素浓度分别为10μM、30μM、50μM、70μM，持续处理三天，观测斑马鱼胚胎的死亡情况，确定胚胎安全范围内的最高姜黄素浓度为50μM。

2、将已注射患者来源的胃癌原代细胞的斑马鱼胚胎置于步骤1所述的10μM和50μM的含0.1％DMSO的姜黄素水溶液中，连续作用三天；将已注射人源化胃癌原代细胞的斑马鱼胚胎置于0.1％DMSO的水溶液，连续作用三天，作为溶剂对照组。

3、观察比较处理后的斑马鱼胚胎中患者来源的胃癌细胞的增殖、扩散的情况。此例胃癌细胞为原位增殖，在荧光显微镜下对人来源的胃癌细胞进行拍照(见图5)，并用Image Pro Plus软件对荧光强度定量，计算姜黄素的抗肿瘤效果(见图6)。

实施例5：本发明的患者来源的肺癌细胞异种移植斑马鱼模型的构建

1.肺癌组织原代细胞的分离

将患者来源的临床组织活检为肺癌的手术标本放置于生理盐水中，在无菌条件下清除肿瘤组织表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织，用灭菌后的眼科剪将组织剪碎，经无菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)洗2次，加入少量磷酸缓冲液，用弯头眼科剪反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm³大小。加入0.25％胰酶，37℃消化10分钟，待观察到组织块解离完全后，离心，去除胰酶。用含10％FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基重悬细胞。

2.原代细胞的染色

将解离所得的原代单细胞用CM-Dil染色，染料终浓度为2μg/ml，染色时间为1小时。离心去除染料，磷酸缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为1×10⁴/μl。

3.细胞移植

将已染色的细胞装载到显微注射针中，将受精后48小时的斑马鱼胚胎固定，用显微注射器在体视镜下，将20nl步骤(2)得到的原代细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊内。

4.荧光显微镜观察

在注射后的4天内，采用荧光显微镜观察斑马鱼体内患者来源的细胞的生长、转移和扩散的情况，并拍照。

如图7所示，患者来源的肺癌细胞在斑马鱼胚胎内显示出增殖和扩散的表型。注射后4天，可见患者来源的肺癌细胞已经向腹部和头部扩散。

实施例6：4例患者来源的肺癌异种移植斑马鱼模型用于评估多西他赛+顺铂临床用药的抗癌效果

1.安全剂量的确定

以不同浓度的顺铂和多西他赛分别处理(浸泡)受精后两天龄的斑马鱼胚胎，持续处理三天，确定胚胎安全范围内的最高顺铂浓度为40μM，多西他赛浓度为10uM。

2.药物处理斑马鱼胚胎

选用40μM顺铂+10uM多西他赛和4μM顺铂+1uM多西他赛分别作用于(浸泡)参照实施例1方法制备得到的已注射不同患者来源的肺癌原代细胞的斑马鱼胚胎模型，连续作用三天，并用0.1％DMSO作为溶剂对照。其中同一患者来源的肺癌原代细胞的斑马鱼胚胎模型分别使用两种不同的浓度的药物进行处理。

3.荧光显微镜观察抑瘤效果

观察比较处理后的斑马鱼胚胎中红色患者来源的细胞的增殖、扩散的情况。在荧光显微镜下对红色细胞进行拍照，并用Image Pro Plus软件对红色荧光强度定量，计算药物的抗肿瘤效果，计算公式：药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％(见图8、图9)。

患者来源的肺癌异种移植斑马鱼模型结果显示，在注射后7天时，*1、*2两例肺癌患者来源的肺癌细胞对顺铂+多西他赛联合用药不敏感，没有明显的抑瘤效果，而临床上该两名肺癌患者使用顺铂+多西他赛治疗肺癌的效果也均无明显疗效。*3、*4两例肺癌患者来源的肺癌细胞对顺铂+多西他赛联合用药敏感，肿瘤增殖明显被抑瘤，而临床上该两名肺癌患者使用两种药物联合治疗后，症状明显改善。

因此，患者来源的肺癌异种移植斑马鱼模型的药物评价结果与临床效果高度关联。跟多组数的实验结果也证实了这一结论。

实施例7：4例患者来源的肺癌细胞异种移植斑马鱼模型用于评估吉非替尼临床用药的抗癌效果

1.安全剂量的确定

以不同浓度的吉非替尼分别处理(浸泡)受精后两天龄的斑马鱼胚胎，持续处理三天，确定胚胎安全范围内的最高吉非替尼浓度为50μM。

2.药物处理斑马鱼胚胎

选用50μM吉非替尼和5μM吉非替尼分别作用于(浸泡)参照实施例1方法制备得到的已注射患者来源的肺癌原代细胞的斑马鱼胚胎模型，连续作用三天，并用0.1％DMSO作为溶剂对照。其中同一患者来源的肺癌原代细胞的斑马鱼胚胎模型分别使用两种不同的浓度的药物进行处理。

3.荧光显微镜观察抑瘤效果

观察比较处理后的斑马鱼胚胎中红色患者来源的细胞的增殖、扩散的情况。在荧光显微镜下对红色细胞进行拍照，并用Image Pro Plus软件对红色荧光强度定量，计算吉非替尼的抗肿瘤效果，计算公式：药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％(见图10、图11)。

患者来源的肺癌异种移植斑马鱼模型结果显示，在注射后7天时，*5、*6两例肺癌患者来源的肺癌细胞对吉非替尼敏感，有明显的抑瘤效果，肿瘤增殖明显被抑瘤，且临床上该两名肺癌患者使用吉非替尼治疗肺癌的效果也有明显疗效。*7、*8两例肺癌患者来源的肺癌细胞对吉非替尼不敏感，而临床上该两名肺癌患者使用两种药物联合治疗后，症状也未发生明显改善。

因此，患者来源的肺癌异种移植斑马鱼模型的药物评价结果与临床效果高度关联。跟多组数的实验结果也证实了这一结论。

实施例8：2个人类肺癌细胞株(A549和HCC827)的异种移植斑马鱼模型用于评估吉非替尼的抗癌效果

1.药物处理斑马鱼胚胎

选用50μM吉非替尼和5μM吉非替尼分别作用于(浸泡)已注射肺癌细胞株(A549和HCC827)的斑马鱼胚胎(参照实施例1的方法构建)，连续作用三天，并用0.1％DMSO作为溶剂对照。

2.荧光显微镜观察抑瘤效果

观察比较处理后的斑马鱼胚胎中红色患者来源的细胞的增殖、扩散的情况。在荧光显微镜下对红色细胞进行拍照，并用Image Pro Plus软件对红色荧光强度定量，计算吉非替尼的抗肿瘤效果,，计算公式：药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％(见图12)。

人类肺癌细胞株异种移植斑马鱼模型结果显示，在注射后7天时，两个肺癌细胞株对吉非替尼均比较敏感。因此，用细胞株建立的异种移植斑马鱼模型评价临床药物吉非替尼的抗肺癌效果与实际临床疗效之间有差异，不能用于指导肺癌的临床用药。

Claims (15)

1.一种患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型，其特征在于该斑马鱼胚胎移植有患者来源的肿瘤组织的原代单细胞。

2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于所述移植是在受精后24-72小时内进行，进一步优选36-60小时内，更优选在48小时进行。

3.根据权利要求1所述的模型，其特征在于所述移植的部位在胚胎卵黄囊。

4.根据权利要求1所述的模型，其特征在于所述原代单细胞是经过染色试剂染色的，优选的染色试剂选自CM-Dil。

5.根据权利要求1-4所述的模型，其特征在于所述的肿瘤选自胃癌或肺癌。

6.根据权利要求1所述的模型在研究肿瘤的增殖、转移、扩散或耐药的机制，或者筛选有效的肿瘤治疗药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述筛选包括如下步骤：确定肿瘤候选药物胚胎安全范围内的最高药物浓度；以胚胎安全范围内的药物浓度的候选药物处理所述的斑马鱼胚胎，并选用候选药物的溶解溶剂作为对照药物同法处理；在荧光显微镜下对斑马鱼胚胎中患者来源的细胞的增殖、扩散的情况进行定性分析或/和定量分析。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述定量分析按下式公式计算抗肿瘤效果：

药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于候选药物处理的时间为持续2到5天，优选3天。

10.根据权利要求6-8所述的应用，其特征在于所述的肿瘤选自胃癌，所述药物选自5-氟尿嘧啶。

11.根据权利要求6-8所述的应用，其特征在于所述的肿瘤选自肺癌，所述药物选自吉非替尼、顺铂或多西他赛的一种或二种联用。

12.一种患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)将患者来源的肿瘤临床手术组织标本解离成原代单细胞；

(2)将解离所得的原代单细胞染色；

(3)将步骤(2)得到的原代单细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊内。

13.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于：

步骤(1)所述的解离包括：将样本在生理盐水中进行无菌清洁后，在磷酸盐缓冲液中剪切成小块，经胰酶消化至解离完全，离心，去除胰酶；

步骤(2)所述染色，使用的染料为CM-Dil，染料浓度为1-5μg/ml，染色时间为1-10小时，染色后去除染料，磷酸盐缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为5×10³-5×10⁵个/μl；

步骤(3)所述的注射包括：将受精后36-60小时的斑马鱼胚胎固定，采用显微注射器在体视镜下，将10-30nl，优选为20nl的步骤(2)得到的原代单细胞注射入斑马鱼胚胎卵黄囊内。

14.根据权利要求12-13任一项所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)后还包括使用荧光显微镜进行定性分析或/和定量分析的步骤。

15.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于在异种移植细胞后的第1-7天内，将斑马鱼胚胎用三卡因麻醉，经荧光显微镜观察荧光细胞在斑马鱼体内的转移和扩散情况。