CN102510719A - 用与细胞毒性化学治疗剂组合的内皮素受体抑制剂治疗脑转移 - Google Patents

用与细胞毒性化学治疗剂组合的内皮素受体抑制剂治疗脑转移 Download PDF

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Abstract

本发明内容涉及用于与细胞毒性化学治疗剂、放射疗法或两者组合在脑转移的预防或治疗中使用的内皮素受体拮抗剂。内皮素受体拮抗剂可以是例如波生坦、马西替坦或波生坦和马西替坦的混合物。

Description

用与细胞毒性化学治疗剂组合的内皮素受体抑制剂治疗脑转移
背景
脑转移是肿瘤学面临的最困难的挑战之一。转移性肿瘤对于大多数化学治疗剂有抵抗力。关于脑转移的治疗主要是全脑且集中于放射疗法，伴随在少数病例中肿瘤的手术切除。大多数化学治疗方案涉及2-3种试剂，包括顺铂、环磷酰胺，依托泊苷、替尼泊苷、丝裂霉素、伊立替康、长春瑞滨、依托泊苷、异环磷酰胺、替莫唑胺和氟尿嘧啶(5-FU)。这些试剂与放射疗法组合施用。这些化学疗法对延长存活的作用一般小于一年。用于脑肿瘤的相当新的化学疗法是与全脑照射一起使用的替莫唑胺。结果是初步的，但与单独的放射比较，替莫唑胺看起来对应答速率具有某些有限的作用，并且在II期试验中，看起来与放射组合具有某些临床活性。
尽管不断努力，但可用于脑转移的有限医疗选项仍是贫乏的，并且更通常是姑息性的而不是治疗上有效的。事件的这种状况长期以来已被认识到，但迄今为止，仍未实现重大进展。因此，存在关于在治疗脑转移方面有效的新治疗方法和药物的极大和呈现的医学需要。
本公开内容在下文讨论了与脑转移有关的内皮素受体拮抗剂。内皮素-1(下文“ET-1”)，血管活性肽，主要在内皮、血管平滑肌和上皮细胞中产生。ET-1经由两种高亲和力G蛋白偶联受体——内皮素-A(下文“ETA”)和内皮素-B(下文“ETB”)受体发挥其生理效应。内皮素受体拮抗剂(ERAs)是能够抑制这些内皮素受体(下文“ETRs”)的充分确定的化合物种类。在这个种类内的是对于ETA或ETB特异性的拮抗剂亚类和针对两者有效的亚类(双重特异性)。双重特异性亚类的一个成员，波生坦，目前批准用于在治疗肺动脉高压中使用。
一些ERAs已就用于在癌症治疗中的用途进行研究。[Nelson JB，等人，Phase 3，randomized，controlled trial of atrasentan in patientswith nonmetastatic，hormone-refractory prostate cancer.Cancer，2008 Nov 1；113(9)：2376-8.；Chiappori AA，等人Phase I/II studyof atrasentan，an ETA receptor antagonist，in combination withpaclitaxel and carboplatin as first-line therapy in advanced non-smallcell lung cancer.Clin Cancer Res，2008Mar 1；14(5)：1464-9.]这些研究在很大程度上排除了具有主动脑转移的患者。同前。这种排除基于下述一般观点进行：现有脑转移将不响应治疗，并且因此由于这些转移的发病率和症状会掩盖测试治疗对原发性肿瘤的作用。[CardenCP，等人，Eligibility of patients with brain metastases for phase Itrials：time for a rethink？The Lancet Oncology，第9卷，Issue 10，第1012-1017页，2008年10月doi：10.1016/S1470-2045(08)70257-2.]这种标准临床试验设计策略作用于强调下述一般预期：针对原发性肿瘤和甚至非脑转移肿瘤有效的疗法将不能影响脑转移肿瘤。
附图简述
图1：通过扫描电子显微镜检查评估MDA-MB-231乳腺癌细胞(T)和鼠星形胶质细胞(A)的体外培养物。在星形胶质细胞(延伸的荚足(pods-feet))和肿瘤细胞之间的直接接触是显而易见的；
图2：星形胶质细胞-转移的癌细胞共培养物显示在共培养的细胞之间的染料转移；
图3：人MDA-MB-231乳腺癌细胞或人PC14Br4肺癌细胞与星形胶质细胞(而不是3T3成纤维细胞)一起培养使与紫杉醇(5ng/ml)温育72小时的肿瘤细胞的相对凋亡指数(增加的抗性)分别减少58.3+8.9％(平均值±S.D.，P＜0.01)和61.8±6.7％(平均值±S.D.，P＜0.05)(凋亡指数通过学生t试验比较)；
图4：人肺癌PC14Br4细胞单独或与星形胶质细胞(直接细胞间接触)一起在培养基中培养，所述培养基含有P-糖蛋白结合的阿霉素(200ng/ml)、紫杉醇(5ng/ml)、长春碱(3ng/ml)、长春新碱(8ng/ml)和P-糖蛋白解离的5-FU(500ng/ml)或顺铂(2.4μg/ml)；
图5：在直接星形胶质细胞-脑转移细胞接触丧失后，星形胶质细胞介导的脑转移细胞不受细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡的保护不持续长于72小时；
图6：基因转录概况分析状况区分鼠和人mRNA；
图7：在MDA-MB-231细胞中，1069种基因是差异表达的，并且在PC14Br4细胞中，594种基因是差异表达的。两个基因列表比较揭示了众所周知与抗凋亡和存活相关的几种基因的表达增加：谷胱甘肽S转移酶5(GSTA5)、BCL2L1、TWIST；
图8：几种抗凋亡和存活基因的表达通过蛋白质印迹分析在蛋白质水平上得到证实；
图9：从共培养实验的2个周期中收集基因转录数据；
图10：与星形胶质细胞但不与成纤维细胞(3T3)共培养的MDA-MB-231人乳腺癌细胞中ETA-R的表达增加；
图11：通过与星形胶质细胞/泰素共培养的MDA-MB-231人乳腺癌细胞的pAKT表达；
图12：单独、或与星形胶质细胞一起或与3T3成纤维细胞一起加入MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的ACT-064992不产生任何可测量的细胞毒性效应；
图13：单独、或与星形胶质细胞一起或与3T3成纤维细胞一起加入PC14肺癌细胞中的ACT-064992不产生任何可测量的细胞毒性效应；
图14A-D：在用于转移性脑癌的几个体内实验模型中关于ETAR和ETBR的免疫染色显示与肿瘤而不是正常脑组织特异性相关的相对高表达；
图15：在与星形胶质细胞或与3T3成纤维细胞共培养的MDA-MB-231人乳腺癌细胞上紫杉醇和ACT-064992的组合疗法；
图16：在与星形胶质细胞或与3T3成纤维细胞共培养的人肺癌细胞PC14Br4上紫杉醇和ACT-064992的组合疗法；
图17：ACT-064992对于星形胶质细胞和肿瘤细胞的共培养物的添加抑制存活因子pAKT和pMAPK的表达；
图18：将脑切片固定且染色用于脑转移显现。对照(媒介物)(图18A)；替莫唑胺(“TMZ”)10mg/kg p.o.每天(图18B)；ACT-06499250mg/kg p.o.每天(图18C)；或组合TMZ+ACT-064992(图18D)；在更高放大率下的组合TMZ+ACT-064992(图18E)；
图19：将脑切片固定且染色用于脑转移显现。A.对照(用媒介物溶液注射)；B.紫杉醇(腹膜内施用的8mg/kg，每周一次)；C.ACT-064992(经口施用的50mg/kg，每天一次)；和D.ACT-064992和紫杉醇的组合；
图20：来自4个处理组的代表性脑切片就CD31(内皮细胞标记)和Ki67(细胞增殖标记)进行染色：A.对照小鼠；B.仅用紫杉醇处理的小鼠；C.ACT-064992；D.紫杉醇和ACT-064992；
图21：通过原位末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(TUNEL)分析来自不同处理组的小鼠的脑切片：A.对照；B.紫杉醇处理的；C.ACT-064992处理的；D.ACT-064992加上紫杉醇的组合；
图22：来自4个处理组的小鼠的脑切片就产生桔黄色的ETA(红色)和磷酸丝氨酸(绿色)共定位进行免疫染色。A.对照脑；B.来自用紫杉醇处理的小鼠的脑；C.来自用单独的ACT-064992处理的小鼠的脑；D.来自用ACT-064992+紫杉醇处理的小鼠的脑。
发明详述
定义
如本文使用的，当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，单词“一个”或“一种”的使用可能意指“一个”或“一种”，但它还与“一个或多个”、“一种或多种”、“至少一个”、“至少一种”、“一个或超过一个”和“一种或超过一种”的含义一致。再进一步地，术语“具有”、“含有”、“包括”和“包含”是可互换的，并且本领域技术人员已认识到这些术语是开放末端术语。
如本文使用的，术语“治疗”指给受试者施用治疗有效的医学干预，例如化学疗法，从而使得受试者具有与癌症有关的参数中的改善。改善可以是任何可观察或可测量的改善，包括癌症肿瘤大小中的变化、癌症肿瘤的生长速率中的减少、或与癌症肿瘤有关的疼痛的主观或客观测量。因此，本领域技术人员认识到治疗可以改善患者的病状但可能不是疾病的完全治愈。
如本文使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”指导致疾病或病状症状的改善或矫正的量。
如本文使用的，术语“现有脑转移肿瘤”指由GFAP阳性星形胶质细胞围绕且浸润的多细胞的脑肿瘤和脑转移。现有脑转移肿瘤具有2个临床上不同的类型：太小而不能通过放射性手段显现的微小转移，和其为足够大可通过临床放射性手段区分的那些肿瘤的可见转移，所述临床放射性手段例如磁共振成像、计算机断层摄影术或正电子发射断层摄影术。这些转移病灶不同于在体循环中的转移癌细胞和溢出进入脑组织内或静止位于其中的单个癌细胞。[一般参见Johanna A.Joyce & Jeffrey W.Pollard，Microenvironmental regulation ofmetastasis，Nat Rev Cancer 9，239-252(2009年4月)|doi：10.1038/nrc2618.]如本文使用的，“微小转移”优选定义为在最大限度宽度中测量为大于0.2mm和/或具有超过200个细胞到2mm的一组汇合癌细胞。更优选地，“微小转移”定义为在最大限度宽度中从0.2mm到2mm的一组汇合癌细胞。参见The AJCC Cancer StagingManual and Handbook，第7版(2010)，Edge，S.B.；Byrd，D.R.；Compton，CC；Fritz，A.G.；Greene，F.L.；Trotti，A.(编辑)，ISBN：978-0-387-88440-0。“微小转移”的备选优选定义是具有至少1000个癌细胞和在最宽尺度至少0.1mm直到在最宽尺度1mm的汇合组。微小转移在标准造影MRI成像或其他临床成像技术中一般是不可见的。然而，在一些癌症中，针对肿瘤选择性抗原(例如对于乳腺癌转移的Her2)的放射性抗体将允许显现微小转移。其他间接检测法包括由于VEGF诱导的血管渗漏，在脑微小转移部位的造影剂渗漏。Yano S；等人(2000)，Expression of vascular endothelial growth factoris necessary but not sufficient for production and growth of brainmetastasis.Cancer research 2000；60(17)：4959-67。更灵敏的成像技术也可以应用于检测微小转移。例如，使用备选造影剂USPIO(Molday Iron，Biopal，Worcester，MA，作为Molday IONTM销售)通过MRI可以成像血容量，以检测微小转移。Juan Yin J，等人Noninvasive imaging of the functional effects of anti-VEGF therapyon tumor cell extravasation and regional blood volume in anexperimental brain metastasis model.Clin Exp Metastasis.2009；26(5)：403-14.Epub 2009年3月11日。
如本文使用的，术语“星形胶质细胞介导的保护”指星形胶质细胞减少化学药物对于在与星形胶质细胞的直接物理接触中的另一个细胞类型的细胞毒性的能力。这种物理接触包括特别经由间隙连接通讯(GJC)与癌细胞连接的星形胶质细胞。
如本文使用的，术语“细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡”指通过细胞毒性化学药物诱导的细胞凋亡或坏死性细胞死亡。大多数医学上使用的化学治疗剂以这种方式快速杀死分裂的肿瘤细胞。
如本文使用的，术语“内皮素受体拮抗剂”指像这样本领域公认的化合物种类，并且特别指这样的化合物，当用于本专利申请中所述的“用于测定ETA或ETB IC50的测试”时，其具有针对ETA、针对ETB或针对ETA和ETB等于或小于1μM的IC50。ERA是阻断内皮素受体与ET-1的相互作用或阻止ETR响应结合的ET-1的药物。存在两个主要类别的ERAs：影响ETA受体的选择性ERAs，例如西他生坦、安立生坦和阿曲生坦，和影响ETA和ETB受体的双重ERAs，例如波生坦。ERA种类的化合物的示例性成员可以在[HAM Mucke″Small-molecule endothelin receptor antagonists：A review ofpatenting activity across therapeutic areas″IDrugs 200912：366-375.]中引用的专利文献中找到。已在人临床试验中进行研究或批准用于医学使用的代表性ERAs包括西他生坦、替唑生坦、克拉生坦、安立生坦(abbrisentan)、波生坦、马西替坦(也称为ACT-064992)和/或阿曲生坦。
如本文使用的，术语“ETA拮抗剂”指这样的化合物，当用于本专利申请中所述的“用于测定ETA或ETB IC50的测试”时，其具有针对ETA等于或小于1μM的IC50。
如本文使用的，术语“ETB拮抗剂”指这样的化合物，当用于本专利申请中所述的“用于测定ETA或ETB IC50的测试”时，其具有针对ETB等于或小于1μM的IC50。
如本文使用的，术语“双重内皮素受体拮抗剂”或“双重ERAs”指这样的化合物，当用于本专利申请中所述的“用于测定ETA或ETB IC50的测试”时，其具有针对ETA等于或小于1μM的IC50和针对ETB等于或小于1μM的IC50。双重ERAs包括波生坦和马西替坦。
如本文使用的，术语“细胞毒性化学治疗剂”指诱导细胞凋亡或坏死性细胞死亡的物质。依照本发明可以与ERAs组合使用的细胞毒性化学治疗剂的例子包括：
■烷化剂(例如氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、链佐星、卡莫司汀、罗莫司汀、美法仑、白消安、达卡巴嗪、替莫唑胺、噻替派或六甲蜜胺)；
■铂药物(例如顺铂、卡铂或奥沙利铂)；
■抗代谢药物(例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨或培美曲塞)；
■抗肿瘤抗生素(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C或米托蒽醌)；和
■有丝分裂抑制剂(例如紫杉醇、多西他赛、伊沙匹隆、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春地辛或雌氮芥)；和
■拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷、替尼泊苷、托泊替康、伊立替康、二氟替康或依洛替康)。
“超致敏作用”或“超致敏”定义为在与星形胶质细胞的物理接触中由一种或多种细胞毒性化学治疗剂引起的细胞死亡中超过在不存在星形胶质细胞的情况下或与星形胶质细胞没有直接物理接触的细胞中可见的那种的相对增加。
当提及治疗使用时，“同时地”或“同时”在本申请中意指所涉及的治疗使用由2种或更多种活性成分通过相同途径和在同时的施用组成。
当提及治疗使用时，“分开地”或“分开”在本申请中意指所涉及的治疗使用由2种或更多种活性成分在大约同时通过至少2个不同途径的施用组成。
“经过一段时间”的治疗施用在本申请中意指2种或更多种成分在不同时间的施用，且特别是根据其在另一种或多种的施用开始前完成活性成分之一的全部施用的施用方法。以这种方式，可以在施用另一种或多种活性成分前数天、数周或数月施用活性成分之一。在这种情况下，不出现同时施用。
公开内容
在脑实质中，星形胶质细胞在维持稳态中的作用是充分公认的。星形胶质细胞用专门的终足(specialized end-feet)包裹每根血管，并且与其他脑细胞例如神经元通讯。这种独特结构允许星形胶质细胞将必需营养素例如葡萄糖和氨基酸从循环转运到依赖性的神经元，并且星形胶质细胞中的糖酵解近来已显示调节神经元活性，即所谓的“神经元-星形胶质细胞代谢偶联”。在病理学条件例如缺氧、缺血和变性条件下，星形胶质细胞将变得活化，并且表达指名为GFAP的蛋白质。GFAP反应性星形胶质细胞已显示保护神经元不受多种攻击，并且援救神经元不受由谷氨酸盐累积产生的兴奋性中毒。活化的星形胶质细胞还可以保护神经元不受由乙醇、过氧化氢和铜催化的半胱氨酸细胞毒性产生的细胞凋亡。
临床脑转移通常由活化(GFAP阳性)星形胶质细胞围绕且浸润。[Yoshimine T，等人(1985)Immunohistochemical study of metastaticbrain tumors with astroprotein(GFAP)，a glia-specific protein.Tissuearchitecture and the origin of blood vessels.J Neurosurg 62：414-418.]本发明人已证实这种现象在下文异种移植物模型中再现。
下文呈现了本发明的多个实施方案：
1)本发明首先涉及用于与细胞毒性化学治疗剂、放射疗法或两者组合在脑转移的预防或治疗中使用的内皮素受体拮抗剂。
2)根据实施方案1)的一个主要变体，所述内皮素受体拮抗剂将用于与化学治疗剂组合使用。
3)根据实施方案2)的一个亚实施方案，所述细胞毒性化学治疗剂将包含(且特别是)烷化剂。
4)特别地，实施方案3)的烷化剂将选自氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、链佐星、卡莫司汀、罗莫司汀、美法仑、白消安、达卡巴嗪、替莫唑胺、噻替派和六甲蜜胺。
5)根据实施方案2)的另一个亚实施方案，所述细胞毒性化学治疗剂将包含(且特别是)铂药物。
6)特别地，实施方案5)的铂药物将选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。
7)根据实施方案2)的另外一个亚实施方案，所述细胞毒性化学治疗剂将包含(且特别是)抗代谢药物。
8)特别地，实施方案7)的抗代谢药物将选自5-氟尿嘧啶、卡培他滨、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、吉西他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨和培美曲塞。
9)根据实施方案2)的一个进一步的亚实施方案，所述细胞毒性化学治疗剂将包含(且特别是)抗肿瘤抗生素。
10)特别地，实施方案9)的抗肿瘤抗生素将选自柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C和米托蒽醌。
11)根据实施方案2)的另一个亚实施方案，所述细胞毒性化学治疗剂将包含(且特别是)有丝分裂抑制剂。
12)特别地，实施方案11)的有丝分裂抑制剂将选自紫杉醇、多西他赛、伊沙匹隆、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春地辛和雌氮芥。
13)根据实施方案2)的另外一个亚实施方案，所述细胞毒性化学治疗剂将包含(且特别是)拓扑异构酶II抑制剂。
14)特别地，实施方案13)的拓扑异构酶II抑制剂将选自依托泊苷、替尼泊苷、托泊替康、伊立替康、二氟替康和依洛替康。
15)在实施方案2)的一个优选亚实施方案中，所述细胞毒性化学治疗剂将选自紫杉醇、多柔比星、长春碱、长春新碱、5-氟尿嘧啶、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、替尼泊苷、丝裂霉素-C、伊立替康、长春瑞滨、异环磷酰胺和替莫唑胺(且特别选自紫杉醇和替莫唑胺)。
16)特别地，实施方案15)的细胞毒性化学治疗剂将选自紫杉醇、替莫唑胺以及紫杉醇和替莫唑胺的混合物。
17)根据实施方案16)的一个优选变体，实施方案16)的内皮素受体拮抗剂将选自波生坦、马西替坦以及波生坦和马西替坦的混合物(并且将显著地是马西替坦)。
18)本发明还涉及用于与实施方案2)-17)之一中提及的至少一种细胞毒性化学治疗剂和放射疗法组合使用的内皮素受体拮抗剂。
19)根据本发明的一个优选实施方案，在实施方案1)-18)中使用的内皮素受体拮抗剂将包含(且特别是)双重内皮素受体拮抗剂。
20)特别地，实施方案19)的双重内皮素受体拮抗剂将选自波生坦、马西替坦以及波生坦和马西替坦的混合物。
21)在一个特别优选的实施方案中，实施方案20)的双重内皮素受体拮抗剂将是马西替坦。
22)根据实施方案1)-21)的一个变体，所述内皮素受体拮抗剂和所述化学治疗剂将分开施用。
23)根据实施方案1)-21)的另一个变体，所述内皮素受体拮抗剂和所述化学治疗剂将同时施用。
24)根据实施方案1)-21)的另外一个变体，所述内皮素受体拮抗剂和所述化学治疗剂将经过一段时间施用。
25)根据实施方案1)的另外一个主要变体，所述内皮素受体拮抗剂将用于与放射疗法组合使用(由此这种放射疗法优选是全脑放射疗法或立体定位性放射手术)。
26)根据本发明的一个优选实施方案，实施方案25)中使用的内皮素受体拮抗剂将包含(且特别是)双重内皮素受体拮抗剂。
27)特别地，实施方案26)的双重内皮素受体拮抗剂将选自波生坦、马西替坦以及波生坦和马西替坦的混合物。
28)在一个特别优选的实施方案中，实施方案27)的双重内皮素受体拮抗剂将是马西替坦。
29)在本发明的另一个主要变体中，根据实施方案2)-23)之一用于与细胞毒性化学治疗剂一起使用的内皮素受体拮抗剂将用于连同放射疗法一起使用(由此这种放射疗法优选是全脑放射疗法或立体定位性放射手术)。
30)可与前述实施方案1)-29)中的一个或多个组合的本发明的另一个主要变体是用于在受试者中的现有脑转移肿瘤治疗中使用的内皮素受体拮抗剂，其中所述现有脑转移肿瘤是微小转移肿瘤，例如选自肺癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤或肾癌脑微小转移肿瘤的微小转移肿瘤。
31)本发明还涉及抑制星形胶质细胞介导的脑转移细胞的保护的方法，所述方法包括给脑转移细胞和星形胶质细胞施用有效量的内皮素受体拮抗剂，以抑制星形胶质细胞介导的保护。
32)本发明进一步涉及实施方案31)的方法，其进一步包括给脑转移细胞施用有效量的至少一种细胞毒性化学治疗剂。
33)本发明进一步涉及实施方案31)的方法，其进一步包括将脑转移细胞进行放射疗法(由此这种放射疗法优选是全脑放射疗法或立体定位性放射手术)。
34)本发明进一步涉及实施方案31)的方法，其进一步包括给脑转移细胞施用有效量的至少一种细胞毒性化学治疗剂，且将脑转移细胞进行放射疗法(由此这种放射疗法优选是全脑放射疗法或立体定位性放射手术)。
35)本发明另外涉及制造用于根据前述1)-34)中的任何使用的药剂及其任何组合的方法。优选地，通过前述产生的药剂与用于执行1)-34)中的一个或多个及其任何组合的说明书一起进一步包装在商业包装中。
36)本发明进一步涉及根据1)-34)中的一个或多个及其任何组合，与细胞毒性化学治疗剂、放射疗法或两者组合，用于在减少脑转移的危险和/或减少脑转移的扩张速率中使用的内皮素受体拮抗剂，所述脑转移包括脑微小转移。
实验部分
实验1-脑转移的免疫荧光分析。
材料和方法
通过将人肺腺癌细胞PC14Br4注射到裸鼠的颈内动脉内产生实验性脑转移(S1)。5周后将小鼠杀死，并且将组织样品在OCT化合物中处理用于冷冻切片，如先前所述(S2)。将组织切片(8-10μm)，固定在带正电荷的载玻片，并且风干30分钟。使用由在丙酮、50∶50(v/v)丙酮∶氯仿和丙酮(各5分钟)的冰冷溶液中的3次顺次浸入组成的方案执行组织固定。然后将样品用PBS洗涤3次，与在PBS中含有5％正常马血清和1％正常山羊血清的蛋白质封闭液一起在室温温育20分钟，并且随后与兔抗GFAP多克隆抗体(Biocare Medical，Concord，CA)的1∶400稀释物一起在4℃温育18小时。将样本用PBS清洗4次，各3分钟，并且随后与山羊抗兔Cy5抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)的1∶1500稀释物一起温育1小时。对照样品用等同浓度的同种型对照抗体和山羊抗兔Cy5抗体进行标记。将所有样品清洗，并且随后与sytox绿色核酸染剂(Eugene，OR)一起短暂温育。载玻片用含有0.1mol/L没食子酸丙酯(Sigma)的甘油/PBS溶液固定，以使荧光漂白降到最低。在ZeissLSM 510激光扫描显微镜系统(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)上收集共焦图像，所述激光扫描显微镜系统配备机动的Axioplan显微镜、氩激光器、HeNe激光、LSM 510控制和图像采集软件和合适的滤光器(Chroma Technology Corp.，Brattleboro，VT)。
用Photoshop软件(Adobe Systems，Inc.，Mountain View，CA)构建了18张复合图像。
结果
由免疫组织化学反应的样品的彩色图像(未显示)测定结果。肿瘤细胞由GFAP阳性(红色)星形胶质细胞围绕且浸润。这个实验证实临床脑转移样品的星形胶质细胞浸润的先前观察。用同基因鼠小鼠模型可见由GFAP阳性星形胶质细胞的相同浸润。在C57小鼠的脑中小鼠Lewis肺癌(3LL)的免疫组织化学分析。分裂的3LL细胞(PCNA阳性，蓝色)由活化的星形胶质细胞(GFAP阳性，褐色)围绕且浸润。总之，这些实验验证鼠-人异种移植物模型再现了在临床人样品和同基因小鼠模型中可见的现象。本发明的一个方面因此是体内小鼠-人脑转移细胞模型，这例如在研究人转移性脑癌的现象中有用。
实验2-扫描电子显微镜研究
已确定鼠星形胶质细胞在脑转移的形成中在体内与人肿瘤细胞相互作用，其方式与原发性人临床样本中可见的相同。本发明人检查了这2种细胞类型在体外在简化共培养系统中的相互作用。不确定此类系统是否将导致任何细胞间相互作用(与上文描述的体内状况具有少得多的直接生理关联性)。因此，在体外达到在人转移性癌细胞系和鼠星形胶质细胞之间的细胞间相互作用是令人惊讶的发现。
材料和方法
细胞系和培养条件。将人乳腺癌细胞系MDA-231(S3)、人肺腺癌细胞系PC14Br4(Si)的脑转移变体和鼠NIH 3T3成纤维细胞维持为在完全伊格尔最小必需培养基(CMEM)中的单层培养，所述CMEM补充有10％胎牛血清(FBS；HyClone，Logan，UT)、L-谷氨酰胺丙酮酸盐、非必需氨基酸、2倍维生素溶液和青霉素链霉素(GIBCO/Invitrogen，Carlsbad，CA)。用于组织培养的所有试剂不含内毒素，如通过鲎变形细胞裂解物测定(Associate of Cape Cod，Woodshole，MA)测定的，并且细胞系不含下述鼠病原体：支原体属(Mycoplasma)物种、汉坦病毒、肝炎病毒、细小病毒、腺病毒(MAD1、MAD2)、巨细胞病毒、鼠痘病毒、乳酸脱氢酶升高病毒、多瘤病毒和仙台病毒(由Research Animal Diagnostic Laboratory，University ofMissouri，Columbia，MO测定)。在这个研究中使用的细胞来自冷冻原种，并且所有实验在融化后的10次体外传代内执行。
鼠星形胶质细胞的分离和维持。对于温度敏感的SV40大T抗原纯合的新生小鼠(H-2Kb-tsA58小鼠；CBA/caxC57BL/10杂种；Charles River Laboratories，Wilmington，MA)在二氧化碳室中实施安乐死，并且以标准方式制备皮肤用于手术(S4)。无菌显微手术镍(Roboz Surgical Instrument Co.，Gaithersburg，MD)用于从头骨去除皮肤，并且显微手术剪用于产生从左耳开口到右耳开口的环形后侧切口。沿着脑中线做出另一个切口，并且将头骨分开，以允许接近颅腔。将视神经夹住，并且用平头镊子取出脑，且放置于100-mm冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)内。解剖整个新皮质，并且取出海马和内部结构，以仅留下皮质层。将脑膜剥离，并且将皮质层用解剖刀切碎，并且在37℃在达尔贝科改良必需培养基(DMEM)中消化30分钟，所述DMEM含有0.1％胶原酶(150U/ml；WorthingtonBiochemical Corp.，Lakewood，NJ)和40pg/ml脱氧核糖核酸酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。然后将皮质组织在含有10％FBS的DMEM中研磨，并且通过50-pm的无菌网筛过滤。将所得到的单细胞悬浮液铺平板到75-cm 2组织培养瓶中，所述组织培养瓶先前已用5μg/ml小鼠层粘连蛋白(Sigma)包被。允许细胞在含有10％FBS和补充物(参见上文)的DMEM中在8％二氧化碳的大气中(以达到在33℃pH的合适缓冲)生长7天。在这时，星形胶质细胞形成具有神经元、少突胶质细胞和成纤维细胞在顶部生长的汇合单层。通过使烧瓶以250每分钟转数在温室中旋转振荡过夜去除这些污染细胞。所得到的培养物由超过95％星形胶质细胞组成，如通过与针对GFAP的抗体的免疫反应性测定的。使这些培养物扩增，重复该程序，并且这些培养物中星形胶质细胞的百分率测定为超过99％。
培养的肿瘤细胞和星形胶质细胞的扫描电子显微镜成像。人乳腺癌MDA-MB-231细胞和鼠星形胶质细胞在含有5％FBS的DMEM中在无菌玻璃盖玻片上在24孔板中以2.4x104细胞的密度铺平板。在48小时后，去除盖玻片，并且在室温在0.1M二甲砷酸盐缓冲液(pH7.3)中在含有3％戊二醛/2％多聚甲醛/7.5％蔗糖的溶液中固定1小时。然后用0.1m二甲砷酸盐缓冲液洗涤样品，并且用含有7.5％蔗糖的1％二甲砷酸盐缓冲的四氧化锇后固定1小时。将样品用0.1M二甲砷酸盐缓冲液随后为蒸馏水洗涤，并且顺次地在黑暗中用Millipore过滤的水性1％鞣酸处理30分钟，在蒸馏水和Millipore过滤的1％水性的乙酸双氧铀中在黑暗中洗涤1小时。将样品用蒸馏水彻底清洗，通过递增系列的乙醇脱水，并且随后转移至等级系列的浓度渐增的六甲基二硅氮烷，各5分钟，并且允许风干过夜。将样品固定在加厚的碳标签(carbon tabs)上(Ted Pella，Inc.，Redding，CA)，所述加厚的碳标签先前已固定到铝样本支架(Electron MicroscopySciences，Ft.Washington，PA)上。随后使用具有25nm厚度的铂合金的Balzer MED 010蒸发器(Technotrade International，Manchester，NH)在真空下包被样品，并且随后在真空下进行立即快速碳包被。将样品转移至干燥器用于在以后日期检查。使用JSM-5910扫描电子显微镜(JEOL，Inc.，Peabody，MA)以5kV的加速电压检查样品。
结果
结果显示于图1中。通过扫描电子显微镜检查评估MDA-MB-231乳腺癌细胞(T)和鼠星形胶质细胞(A)的体外培养物。在星形胶质细胞(延伸的荚足)和肿瘤细胞之间的直接接触是显而易见的。单个星形胶质细胞可以接触多个肿瘤细胞。这些看起来是在星形胶质细胞和中枢神经系统的神经元之间可见的完全形成的间隙连接种类。相似结果对于黑素瘤、乳腺癌和肺癌细胞系可见(未显示)。
实验3-间隙连接测定
为了进一步验证图1中所示的间隙连接的功能性质，本发明执行染料转移实验，以确定实验2中可见的间隙连接样结果是否是功能性的。
材料和方法
间隙连接通讯。通过测量染料转移的流式细胞术分析在受体肿瘤细胞(MDA-MB-231)和供体细胞(星形胶质细胞、3T3细胞、MDA-MB-231)之间的间隙连接通讯。简言之，将受体细胞(300,000细胞/孔)铺平板到6孔板内且培养过夜。在那时，供体细胞用1μg/ml绿色钙黄绿素-AM(Molecular Probes)标记45分钟，随后为充分洗涤。供体细胞(60,000细胞/孔)与受体细胞直接或在transwell室(Transwell-Boyden Chamber，0.4p.m孔径；Costar，Corning，NY)中共培养5小时。将细胞收获，洗涤，在乙醇中固定，并且通过流式细胞术分析。间隙连接形成计算为漂移的FITC峰(S9-S11)的百分比。
结果
如图2中显示的，星形胶质细胞-转移癌细胞共培养物显示在共培养的细胞之间的染料转移。本发明的共培养系统因此导致在鼠星形胶质细胞和人转移癌细胞系之间形成的活跃间隙连接。对照transwell实验证实这是真实的细胞-细胞相互作用。本发明的第二个方面因此是体外小鼠星形胶质细胞-人转移细胞共培养系统，这例如在研究在可操作的离体设置中人转移性脑癌与星形胶质细胞的相互作用的现象中有用。
实验4-化学保护测定
脑转移的化学抗性的建模是且将是用于前述体内模型系统和体外细胞共培养系统的主要用途。因为基于细胞的共培养系统更顺应实验操作，所以进一步评价基于细胞的共培养系统，以测定在体内可见的脑转移的化学抗性是否通过基于细胞的培养系统再现。
材料和方法
体外共培养化学保护测定。如先前所述用GFP基因转染星形胶质细胞和NIH 3T3成纤维细胞(S5，S6)。通过短暂(2分钟)暴露于在0.1％EDTA/PBS溶液中的0.25％胰蛋白酶，从60-70％汇合培养物中收获靶肿瘤细胞、星形胶质细胞或3T3成纤维细胞。通过快速轻拍培养瓶移出细胞，并且重悬浮于CMEM中。鼠星形胶质细胞、3T3成纤维细胞和肿瘤细胞单独或作为共培养物以1∶2的肿瘤细胞/星形胶质细胞/3T3细胞比铺平板到无菌6孔组织培养多孔皿的各35-mm直径孔上。允许细胞在增湿的37℃温箱中在6.4％二氧化碳加上空气的大气中贴壁过夜。随后将培养物洗涤且与新鲜的CMEM(阴性对照)或含有多种浓度的
Figure BDA0000143552740000171
(紫杉醇；NDC 0015-3476-30，Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ)和其他化学治疗药物(参见下文)的培养基一起温育。在72小时后，挑选出GFP标记的星形胶质细胞或NIH 3T3细胞，并且通过碘化丙啶染色和FACS分析测定肿瘤细胞的凋亡部分(参见下文)。为了测定在肿瘤细胞和星形胶质细胞(或充当对照的成纤维细胞)之间的直接接触是否是产生对于化学疗法的抗性的诱导的必要条件，我们使用Transwell-Boyden室执行共培养测定，即在室中针对肿瘤细胞铺平板并且在孔中针对ImmortoAstrocytes(或成纤维细胞)铺平板。在温育72小时后，如下所述测定肿瘤细胞的相对凋亡指数。
在第二组体外研究中，我们测定星形胶质细胞介导的对于化学治疗药物的肿瘤细胞抗性的诱导是暂时的还是永久的。将人肺癌细胞PC14Br4细胞与星形胶质细胞或3T3成纤维细胞一起在单独的培养基或含有5ng/ml紫杉醇的培养基中共培养。在72小时后，通过FACS将星形胶质细胞或3T3成纤维细胞与肿瘤细胞分离，并且如下所述通过碘化丙啶染色在多个孔中测定肿瘤细胞的相对凋亡指数。从平行孔中，我们收获存活的肿瘤细胞且将其重新铺平板到星形胶质细胞或3T3细胞的不同单层上。这些共培养物是首先与星形胶质细胞且随后与星形胶质细胞或3T3细胞共培养的肿瘤细胞，或首先与3T3细胞且随后与3T3细胞或星形胶质细胞共培养的肿瘤细胞。第二轮共培养物随后接受含有5ng/ml紫杉醇的培养基。在72小时后，通过碘化丙啶染色和FACS分析测定肿瘤细胞的相对凋亡指数。
关于碘化丙啶染色和FACS分析的准备。将含有漂浮细胞的上清培养基从每个皿收集到15-ml尖底离心管内。通过使细胞短暂暴露于在含有0.1％EDTA/PBS的溶液中的0.25％胰蛋白酶，收获贴壁细胞。将细胞与相应上清培养基合并。通过以100g离心5分钟使样品形成团块。将团块重悬浮于10ml HBSS中，并且以100g 5分钟进一步形成团块。通过涡旋重悬浮样品，并且将细胞在1ml 1％多聚甲醛中在室温固定10分钟。然后将样品转移到聚丙烯微量离心管内，并且在1ml PBS中洗涤固定的细胞，并且随后以10,000g 1分钟形成团块。通过涡旋重悬浮团块，并且将细胞在1ml乙醇中在-20℃固定过夜。随后将细胞涡旋，并且通过微量离心机以10,000g 1分钟形成团块。随后将样品涡旋，并且将团块重悬浮且在含有RNA酶(15μg/ml；Cat.A7973，Promega，Madison，WI)的300碘化丙啶(50μg/ml；Cat.P4864，Sigma)中在37℃染色20-30分钟。最后将样品转移至5-ml塑料培养管用于FACS分析，其中使用Coulter EPICS Cytometer(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)。通过比较肿瘤细胞的凋亡指数/肿瘤细胞和ImmortoAstrocytes或肿瘤细胞和NIH 3T3成纤维细胞的凋亡指数x100(％)来测定相对凋亡指数(S7)。
结果
人MDA-MB-231乳腺癌细胞或人PC14Br4肺癌细胞与星形胶质细胞(而不是3T3成纤维细胞)一起培养使与紫杉醇(5ng/ml)温育72小时的肿瘤细胞的相对凋亡指数(即增加的化学抗性)分别减少58.3+8.9％(平均值±S.D.，P＜0.01)和61.8±6.7％(平均值±S.D.，P＜0.05)(凋亡指数通过学生t试验比较)(图3)。这种减少依赖于在肿瘤细胞和星形胶质细胞之间的直接接触。本发明人以显示下述的数据作为这个结论的基础：当肿瘤细胞和星形胶质细胞通过半透膜(Transwell-Boyden Chamber，0.4pm孔径膜；Costar，Corning，NY)分离时，未观察到星形胶质细胞的化学保护效应。肿瘤细胞与3T3成纤维细胞的共培养无法保护肿瘤细胞不受化学疗法(图3)。人肿瘤细胞与使用从H-2kb-tsA58小鼠中分离的成纤维细胞的备选对照的共培养也无法保护肿瘤细胞不受化学治疗剂(数据未显示)。使用确定细胞毒性程度的标准MTT测定可见类似结果(数据未显示)。[Cory AH，Owen TC，Barltrop JA，Cory JG(1991年7月)″Use ofan aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assaysin culture.″Cancer Communications 3(7)：207-212.]
这些数据验证本文公开的基于细胞的共培养系统作为复制脑转移化学抗性的现象。共培养系统复制化学抗性的出乎意料的能力因此致使其充分适合于用于研究化学抗性的机制和用于取消体内现有脑转移中的化学抗性的潜在治疗干预。
为了扩展这些起始实验，本发明人已测试了几种另外的化学治疗剂，迄今为止在使用中的主要种类药物的代表。人肺癌PC14Br4细胞单独或与星形胶质细胞(直接细胞间接触)一起在培养基中培养，所述培养基含有P-糖蛋白结合的阿霉素(200ng/ml)、紫杉醇(5ng/ml)、长春碱(3ng/ml)、长春新碱(8ng/ml)和P-糖蛋白解离的5-FU(500ng/ml)或顺铂(2.4μg/ml)。与星形胶质细胞的共培养诱导针对所有药物的显著(P＜0.01)保护(图4)。这个出乎意料的发现进一步验证基于细胞的共培养系统。细胞培养系统证实通过星形胶质细胞诱导的化学抗性的坚固性，其方式与在体内在临床背景中可见的脑转移化学抗性可直接比较或相当。本发明的第三个方面因此是在体外基于细胞的化学抗性测定，其例如在研究星形胶质细胞介导的脑转移细胞不受细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡的现象中有用。在一个特定实施方案中，在体外基于细胞的化学抗性测定可以用于筛选一种或多种候选化学治疗剂，以评价星形胶质细胞介导的针对化学治疗剂的细胞毒性效应的保护程度。
图5中概括的另外实验证实在直接星形胶质细胞-脑转移细胞接触丧失后，星形胶质细胞介导的脑转移细胞不受细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡的保护不持续长于72小时。进一步地，已丧失由先前星形胶质细胞接触提供的保护效应的细胞可以通过与星形胶质细胞的第二次共培养再次被保护，以重新获得星形胶质细胞介导的针对化学治疗剂的细胞毒性效应的保护。这反映了原发性肿瘤和甚至其他非脑转移是化学应答性的而其衍生的脑转移是化学抗性的临床观察。
实验5-星形胶质细胞介导的化学抗性的机制
本发明人应用上述基于细胞的化学抗性测定以研究位于该现象下的潜在机制。基因表达概况分析加上蛋白质生产的蛋白质印迹证实用于研究星形胶质细胞介导的脑转移细胞不受细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡的保护。
材料和方法
通过RNA微阵列分析的基因表达概况。在第一个组实验中，MDA-MB-231或PC14Br4细胞单独、与鼠星形胶质细胞或NIH 3T3成纤维细胞一起在35-mm直径6孔板(Cat.353046，BD Falcon TM，San Jose，CA)中温育。为了确定细胞间接触，肿瘤细胞与鼠星形胶质细胞或NIH 3T3细胞的比是1∶2。在72小时后，通过FACS方法挑选出GFP标记的鼠星形胶质细胞或成纤维细胞，并且将肿瘤细胞加工用于微阵列分析。在第二组实验中，我们测定与对于化学治疗药物的肿瘤细胞抗性相关的基因表达是否依赖于与星形胶质细胞的连续接触。MDA-231或PC14Br4细胞与鼠星形胶质细胞或NIH 3T3细胞共培养72小时。挑选出鼠星形胶质细胞或NIH 3T3细胞，并且将肿瘤细胞加工以通过微阵列分析测定基因表达概况，或铺平板用于与鼠星形胶质细胞或成纤维细胞的第二轮共培养。因此，首先与鼠星形胶质细胞共培养的肿瘤细胞再次与鼠星形胶质细胞或成纤维细胞共培养，并且相反地，起始与成纤维细胞一起培养的肿瘤细胞再次与成纤维细胞或星形胶质细胞共培养。在72小时温育后，挑选出鼠星形胶质细胞或成纤维细胞，并且将肿瘤细胞加工用于微阵列分析。
微阵列分析。根据制造商的方案(Illumina，Inc.，San Diego，CA)将总RNA(500ng)用于标记和杂交。简言之，使用IlluminaR TotalPrep RNA Amplification Kit(Applied Biosystem，Austin，TX)由总RNA生成cDNA。接下来，在37℃执行体外转录4小时，以将生物素标记的核苷酸掺入cRNA内。根据制造商的说明书，使总共1500ng生物素标记的cRNA与Illumina′s SentrixR人6-v2ExpressionBeadChips在58℃杂交过夜(16小时)。用1μg/ml花青3-链霉素(GEHealthcare，Piscataway，NJ)检测杂交的生物素化cRNA，并用Illumina BeadArray Reader(Illumina，Inc.)扫描BeadChips。用Bead Studio 3.7(Illumina，Inc.)提取微阵列数据的结果，不含任何标准化或本底扣除。使用在R(www.r-project.org)中的LIMMA包中的分位数归一化法标准化基因表达数据(S12)。在进一步分析之前，将每种基因的表达水平转化成log2。为了选择在2组组织中差异表达的基因，我们使用在BRB Array Tools(v 3.6；Biometrics ResearchBranch，National Cancer Institute，Bethesda，MD)中的种类比较工具作为具有FDR估计的双样本t检验的方法。
蛋白质印迹分析。蛋白质印迹用于证实微阵列的结果。简言之，使用含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Indianapolis，IN)的1ml裂解缓冲液(10mM Tris[pH 8.0]、1mM EDTA、0.1％SDS、1％脱氧胆酸盐、1％NP40、0.14M NaCl、1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑肽酶和1μg/ml胃酶抑素)来制备FACS挑选的肿瘤细胞的全细胞裂解产物。通过在4-12％Nu-PAGE凝胶(Invitrogen)上的电泳分离含有等量蛋白质(30fag)的样品，并且转移至硝酸纤维素膜。在用含有5％脱脂奶的TTBS(TBS+0.1％Tween 20)封闭后，使膜在4℃与针对BCL2的小鼠单克隆抗体(1∶1,000，BD PharMingen，San Diego，CA)、针对BCL2L1的兔多克隆抗体(1∶1,000，Cell Signaling，Beverly，MA)、针对TWIST的兔多克隆抗体(1∶1000，Cell Signaling)、针对谷胱甘肽S转移酶的小鼠单克隆抗体(1∶1,000，BD PharMingen)和针对I3-肌动蛋白的小鼠单克隆抗体(Sigma)温育过夜。随后使印迹暴露于辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶3000)，并且通过来自Amersham(Piscataway，NJ)的增强化学发光系统显现。通过剥离印迹且用抗13肌动蛋白抗体重新探测它们证实相等蛋白质装载。
绕计分析。对于基因表达概况的统计分析，在进一步分析之前，将每种基因的表达水平转化成log2。用于具有FDR估计的双样本t检验的在BRB Array Tools(v 3.6；Biometrics Research Branch，National Cancer Institute，Baltimore，MD)中的种类比较工具是用于测定在与不同宿主细胞共培养的肿瘤细胞之间差异表达的基因的统计显著性的方法。通过单变量检验(双样本t检验)与多变量置换检验(permutation test)(10,000个随机置换)选择用于Venn图的基因。我们应用小于0.001的截断P值，以保留其表达在检查的2组组织之间显著不同的基因。
结果
通过应用双样本t检验(P＜0.001)，本发明人鉴定了其表达在与星形胶质细胞的共培养后通常改变的肿瘤细胞基因。使用这种程序，本发明人鉴定在MDA-MB-231细胞中差异表达的1069种基因，和在PC14Br4细胞中差异表达的594种基因(图7)。两个基因列表比较揭示了熟知与抗凋亡和存活相关的几种基因的表达增加：谷胱甘肽S转移酶5(GSTA5)、BCL2L1、TWIST(图7)。这些基因的表达通过蛋白质印迹分析在蛋白质水平上得到证实(图8)。本发明人随后测定在与星形胶质细胞(而不是成纤维细胞)共培养的肿瘤细胞中改变的基因表达模式是永久的还是短暂的。本发明人使肿瘤细胞与星形胶质细胞或成纤维细胞共培养一个周期，并且随后收获肿瘤细胞并且将其置于在星形胶质细胞或成纤维细胞上的第二轮中。当从共培养实验的2个周期中收集基因表达数据时，第二次共培养的影响在癌细胞的基因表达模式中是占优势的。与第一次共培养条件无关，在第二个周期中与星形胶质细胞共培养的癌细胞显示出在第一个周期培养实验中检测到的独特的基因表达标记(GSTA5、BCL2L1和TWIST的高表达)，而当它们在第二轮中与成纤维细胞共培养时，在第一轮中与星形胶质细胞共培养的癌细胞丧失特异性基因表达标记(图9)。这个结果与图5中概括的体外化学保护测定结果的那种平行，并且证明在肿瘤细胞中的基因表达模式依赖于与星形胶质细胞的不断接触。在第二轮中与星形胶质细胞共培养的肿瘤细胞还表达高水平的TCF4、CD24、CARD14和EFNB2基因(数据未显示)。临床研究已显示这些基因的肿瘤细胞表达与预后不良相关。本发明的第四个方面因此是具有分子诊断组分的在体外基于细胞的化学抗性测定，其例如研究在离体设置中星形胶质细胞介导的脑转移细胞不受细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡的现象中有用。在一些实施方案中，分子诊断组分是一个或多个基因表达概况分析步骤和细胞蛋白质浓度的分析。在特定实施方案中，预定的基因表达标记用于评估实验干预例如取消星形胶质细胞介导的保护的效应。本发明的第五个方面是指示星形胶质细胞介导的脑转移细胞不受细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡的基因表达标记或蛋白质水平概况的组合。第六个方面是产生如上文描述且例示的所述基因标记或蛋白质水平概况的过程。
实验6-通过肿瘤细胞和星形胶质细胞的内皮素受体表达
使300,000个MDA-MB-231人乳腺癌细胞与600,000个GFP标记的星形胶质细胞或GFP标记的3T3成纤维细胞共培养24小时。然后收集且挑选细胞，以分离MDA-MB-231细胞。将蛋白质提取，通过蛋白质印迹分析且与抗ETAR抗体杂交。图10中所示的数据明确证实与星形胶质细胞共培养的肿瘤细胞表达高水平的ETAR。
在接下来的研究组中，将10,000个GFP标记的MDA-MB-231细胞与20,000个星形胶质细胞在腔室载玻片中共培养。24小时后，将培养物用泰素(15ng/ml)处理24小时，并且随后就磷酸化的pAKT(4％PFA固定)进行染色。如图11所示，与星形胶质细胞(和泰素)共培养的肿瘤细胞产生高表达的pAKT。因此，与星形胶质细胞的共培养产生肿瘤细胞的增加表达的ETR和存活因子，这与肿瘤细胞增加的对于化学治疗药物的抗性有关。用抗ETBR抗体的相似研究揭示ETBR表达。
实验7-内皮素受体拮抗剂不产生针对肿瘤细胞的细胞毒性效应
使用如上所述的在体外基于细胞的化学抗性测定方案，本发明人测试具有双重ETAR和ETBR亲和力的2种内皮素受体拮抗剂，以评价星形胶质细胞介导的针对化学治疗剂的细胞毒性效应的保护程度。测试的一种ETR拮抗剂是波生坦，其由EMEA批准用于在肺动脉高压(PAH)的治疗中使用。测试的第二种药物指名为ACT-064992，并且是波生坦的衍生物，也具有双重ETAR/ETBR亲和力。ACT-064992先前指名为马西替坦，且具有结构[N-[5-(4-溴苯基)-6-(2-(5-溴嘧啶-2-基氧)乙氧基)-嘧啶-4-基]-N′-丙基氨基磺胺]：
Figure BDA0000143552740000241
马西替坦
Iglarz M，等人，Pharmacology of macitentan，an orally activetissue-targeting dual endothelin receptor antagonist，J Pharmacol ExpTher.2008Dec；327(3)：736-45.Epub 2008年9月9日。ACT-064992分子、其合成及其药理学活性的最初公开内容可以在WO02/053557中找到。ACT-064992是波生坦的药理学活性的大约3倍(即它需要1/3剂量)。本文的详细数据涉及ACT-064992实验，然而，通过更高剂量的波生坦实验达到类似结果。
将ACT-064992(100nM)加入具有1∶2的肿瘤细胞∶星形胶质细胞比或肿瘤细胞∶3T3成纤维细胞的上述基于细胞的共细胞测定48小时，并且如上所述测量凋亡的程度。如图12(MDA-231乳腺癌)和图13(PC14肺癌)中显示的，单独或与星形胶质细胞或3T3成纤维细胞一起加入的ACT-064992不产生任何可测量的细胞毒性效应。
实验8-与化学治疗剂组合的内皮素受体拮抗剂
如上所示的ETR拮抗剂作为单一试剂化学疗法是无效的。这个阴性结果使得用ETR拮抗剂作为联合治疗的组分可见的引人注目效应是高度出乎意料的。在共培养实验中，细胞培养比是1∶2肿瘤细胞∶星形胶质细胞(50,000∶100,000)，并且处理是使用紫杉醇
Figure BDA0000143552740000242
(6ng/ml)和/或ACT-064992(100nM)共48小时(图15；＊p＜0.01)。对于使用MDA-MB-231细胞的对照实验，相同的星形胶质细胞介导的不受紫杉醇的保护与先前实验中一样出现。存在来自这些组合实验的2个令人惊讶的结果。首先，在缺乏星形胶质细胞的对照中紫杉醇和ACT-064992的组合不获得细胞死亡中超过单独的紫杉醇的显著增加。这在至少3次独立实验中可见(图15)。这些结果使用人肺癌细胞PC14Br4得到复制(图16)。因此，在测试的条件下，如作为单一试剂在实验6中观察到的，ETR拮抗剂在组合中也是无效的。在肿瘤细胞-星形胶质细胞共培养物中，ACT-064992显示取消星形胶质细胞介导的针对紫杉醇的保护的出乎意料的能力。更加令人惊讶的是，与不含星形胶质细胞的对照实验比较，ACT-064992实际上增强紫杉醇的功效，以使转移性肿瘤细胞对紫杉醇超致敏。ACT-064992对于星形胶质细胞和肿瘤细胞的共培养物的添加抑制存活因子pAKT和pMAPK的表达(图17)。这种抑制与由化学治疗药物介导的增加的肿瘤细胞死亡直接相关。这种协同作用是更加令人惊讶的，因为缺乏星形胶质细胞的实验不证实平均的附加效应。这些引人注目的结果证实本文公开的新共培养筛选方法的重要性，因为在联合治疗中ETR拮抗剂的效应在缺乏共培养的星形胶质细胞的标准肿瘤细胞系测定方案中将无法见到。本发明的第七个方面因此是与一种或多种细胞毒性化学治疗剂和/或放射疗法组合的内皮素受体拮抗剂治疗受试者中的现有脑转移肿瘤的用途。在特定实施方案中，这种联合治疗使现有脑转移对于与ETR拮抗剂共施用的细胞毒性化学治疗剂和/或放射疗法超致敏。
用于现有脑转移的体内内皮素受体拮抗剂治疗
通过在用于这类化合物的多个成员的先前临床试验中已开发且使用的相同经口和或全身递送可以达到一种或多种内皮素受体拮抗剂和共施用的化学治疗剂的体内递送。此类治疗方案的开发和最佳化是本领域常规的。[Clinical trials：a practical guide to design，analysis andreporting Edited by Ameet Bakhai and Duolao Wang.Remedica，London 2005.]对于脑癌特异性的一个问题是血脑屏障的影响。虽然这长期以来已作为排除对于脑转移的全身疗法的技术问题提到，但本领域现在已认识到即使在微小转移中，血脑屏障也是被部分破坏的。[Cavaliere R.和Schiff D.，Chemotherapy and cerebral metastases：misperception or reality？Neurosurg Focus.2007年5月15日；22(3)：E6.]因此，预期一种或多种内皮素受体拮抗剂的全身递送将穿透且在脑转移肿瘤中具有疗效将是合理的。此外，一个或多个内皮素受体拮抗剂家族的一些成员具有跨越即使完整的血脑屏障的能力，从而致使其特别适合于在体内脑转移肿瘤治疗中使用。[Vatter H，等人，Cerebrovascular characterization of clazosentan，the first nonpeptideendothelin receptor antagonist shown to be clinically effective for thetreatment of cerebral vasospasm.Part II：effect on endothelin(B)receptor-mediated relaxation.J Neurosurg.2005年6月；102(6)：1108-14.]。最后，当转移性肿瘤的大小致使此类方法可行时，一种或多种内皮素受体拮抗剂的直接肿瘤输注或注射可以是合适的。
用于小鼠中的脑转移的体内治疗
为了进一步验证内皮素受体拮抗剂治疗对于现有脑转移的功效，本发明人使用小鼠执行示例性体内实验。通过颈内动脉用10,000个活MDA231细胞注射裸鼠。初步的病理学工作揭示在注射后2周形成明显建立的转移(数据未显示)。本发明人因此在这个时间点开始处理。
实验9-ACT-064992和替莫唑胺对体内肿瘤生长的作用
裸鼠用10,000个活MDA231细胞注射到颈内动脉内。在注射后2周时的处理组是：对照(媒介物)(图18A)；替莫唑胺(“TMZ”)10mg/kg p.o.每天(图18B)；ACT-06499250mg/kg，p.o.每天(图18C)；或组合TMZ+ACT-064992(图18D)。
所有小鼠在处理的第28天时被杀死。将脑切片固定且染色。视觉评估脑转移。示例性样本以相同放大率显示于图18A-D中。如图18E中可以更详细地看到的，与单独TMZ的比较，组合TMZ和ACT-064992急剧减少转移性肿瘤的大小和密度。这证实上述细胞培养系统结果与在体内观察到的效应直接相关。
实验10-ACT-064992和紫杉醇对体内肿瘤生长的作用
雌性裸鼠(10-12周龄)用10,000个活MDA231细胞注射到颈内动脉内。在注射后2周，当脑转移建立时，将小鼠随机化到4个处理组(n＝10)内：1)对照(用媒介物溶液注射)；2)紫杉醇(腹膜内施用的8mg/kg，每周一次)；3)ACT-064992(经口施用的50mg/kg，每天一次)；和4)ACT-064992和紫杉醇的组合。所有小鼠在处理28天后实施安乐死且进行尸体解剖。收集脑用于组织学研究和免疫组织化学。示例性结果显示于图19A中。对照(19A)、ACT-064992(19B)和紫杉醇(19C)都具有定义明确的转移性肿瘤。相比之下，ACT-064992+紫杉醇组(19D)具有小很多的肿瘤细胞集落。
用替莫唑胺和紫杉醇的结果证实内皮素受体拮抗剂治疗使脑转移对于一般而言的化学治疗剂致敏。
实验11-ACT-064992和紫杉醇对体内肿瘤细胞增殖的作用
来自4个处理组的代表性脑切片就CD31(内皮细胞标记)和Ki67(细胞增殖标记)进行染色。对照小鼠、仅用紫杉醇或仅用ACT-064992处理的小鼠的脑含有大量增殖细胞。形成鲜明对比的是，用紫杉醇和ACT-064992处理的小鼠的脑仅含有少数分裂细胞。分别为图20A、B、C和D。
实验12-ACT-064992和紫杉醇对体内肿瘤细胞凋亡的作用
通过原位末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(TUNEL)分析来自不同处理组的小鼠的脑切片Negoescu A，等人，J HistochemCytochem.1996Sep；44(9)：959-68。对照、泰素处理的和ACT-064992处理的脑具有少数至无凋亡细胞。图21A-C。形成鲜明对比的是，用ACT-064992加上泰素的组合处理的小鼠的脑具有大量凋亡肿瘤细胞(绿色)和内皮细胞(黄色)(图21D)。
实验13
来自4个处理组的小鼠的脑切片就产生桔黄色的ETAR(红色)和磷酸丝氨酸(绿色)共定位进行免疫染色。对照脑表达磷酸化的ETAR，与来自用紫杉醇处理的小鼠的脑一样(图22A-B)。用单独的ACT-064992和用ACT-064992+紫杉醇的处理阻止ETAR的磷酸化(图22C-D)。这个结果证实内皮素受体拮抗剂活性和转移性肿瘤对于化学治疗剂的致敏作用关联。
实验14
关于用ACT064992和泰素处理实验性人MDA231乳腺癌脑转移的存活研究
实验细节
根据实验10中的方案，注射5x 103MDA231细胞。根据实验10中的方案，在注射后第14天时开始处理。描绘存活曲线并且衍生p值，以比较在处理组中的统计显著性。
处理组
对照(媒介物)：每天经口施用和每周一次i.p.注射。
紫杉醇(5mg/kg)：每天经口媒介物施用和紫杉醇的每周一次i.p.注射
ACT064992(10mg/kg)：每天经口ACT064992施用和紫杉醇的每周一次i.p.注射
结果
死亡日(在处理后)
对照：42、43、53、60、64、68、68、69、69
紫杉醇：49、53、60、63、74、74、78
ACT064992：51、63、68、75、78、82
紫杉醇+ACT：48
Figure BDA0000143552740000291
用于测定ETA或ETBIC50的测试：
对于竞争结合研究，使用表达人重组ETA或ETB受体的CHO细胞的膜。制备来自重组CHO细胞的微粒体膜，并且如先前所述进行结合测定(Breu V.，等人，FEBS Lett.(1993)，334，210)。
测定在包括25mM MnCl2、1mM EDTA和0.5％(w/v)BSA的200μL 50mM Tris/HCl缓冲液，pH 7.4中在聚丙烯微量滴定板中执行。将含有0.5ug蛋白质的膜与8pM[125I]ET-1(4000cpm)和浓度渐增的未标记的拮抗剂一起在20℃温育2小时。分别在不含和含100nM ET-1的样品中评估最大限度和最低限度结合。在2小时后，在含有GF/C滤器的滤板(来自Canberra Packard S.A.Zürich，瑞士的Unifilterplates)上过滤膜。向每个孔中，加入50μL闪烁混合物(cocktail)(MicroScint 20，Canberra Packard S.A.Zürich，瑞士)，并且在微板计数器(TopCount，Canberra Packard S.A.Zürich，瑞士)中计数滤板。
将所有测试化合物溶解，稀释且加入DMSO中。测定在2.5％DMSO的存在下运行，发现所述2.5％DMSO不显著干扰结合。IC50计算为抑制ET-1的50％特异性结合的拮抗剂浓度。
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本文引用或另外鉴定的所有参考文献整体且特别为了它们由于其引用的任何具体信息在此通过引用合并。

Claims (26)

1.一种内皮素受体拮抗剂，其用于与细胞毒性化学治疗剂、放射疗法或两者组合在脑转移的预防或治疗中使用。
2.根据权利要求1用于在脑转移的预防或治疗中使用的内皮素受体拮抗剂，其是双重内皮素受体拮抗剂。
3.根据权利要求1或2用于在脑转移的预防或治疗中使用的内皮素受体拮抗剂，其选自波生坦、马西替坦以及波生坦和马西替坦的混合物。
4.根据权利要求1-3中任一项用于在脑转移的预防或治疗中使用的内皮素受体拮抗剂，由此所述内皮素受体拮抗剂选自波生坦、马西替坦及其混合物，并且旨在与细胞毒性化学治疗剂一起使用。
5.根据权利要求4用于在脑转移的预防或治疗中使用的内皮素受体拮抗剂，其中所述细胞毒性化学治疗剂选自紫杉醇、替莫唑胺以及紫杉醇和替莫唑胺的混合物。
6.根据权利要求4用于在脑转移的预防或治疗中使用的内皮素受体拮抗剂，其中所述内皮素受体拮抗剂选自波生坦、马西替坦以及波生坦和马西替坦的混合物。
7.一种抑制星形胶质细胞介导的脑转移细胞不受细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡的保护的方法，所述方法包括给所述脑转移细胞和所述星形胶质细胞施用有效量的内皮素受体拮抗剂的步骤，以抑制所述星形胶质细胞介导的保护。
8.一种抑制星形胶质细胞介导的脑转移细胞不受细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡的保护的方法，所述方法包括给所述脑转移细胞和所述星形胶质细胞施用有效量的内皮素受体拮抗剂，以抑制所述星形胶质细胞介导的保护，和进一步使所述脑转移细胞对于所述细胞毒性化学疗法诱导的细胞死亡超致敏的步骤。
9.权利要求7或8的方法，其进一步包括给所述脑转移细胞施用至少一种细胞毒性化学治疗剂的步骤。
10.权利要求9的方法，其中所述脑转移细胞包含在受试者中的现有脑转移肿瘤中或所述脑转移细胞是分离的细胞。
11.权利要求9或10的方法，其中所述细胞毒素化学治疗剂是下述中的至少一种：紫杉醇、多柔比星、长春碱、长春新碱、5-氟尿嘧啶、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、替尼泊苷、丝裂霉素、伊立替康、长春瑞滨、异环磷酰胺和/或替莫唑胺。
12.权利要求7-11中任一项的方法，其中所述内皮素受体拮抗剂是马西替坦、西他生坦、替唑生坦、克拉生坦、安立生坦、波生坦和/或阿曲生坦中的一种或多种。
13.权利要求11或12的方法，其中所述受试者是人且任选进一步包括在所述人受试者中施用现有脑转移肿瘤的标准护理姑息性和/或治疗性处理的步骤。
14.权利要求13的方法，其中给予所述标准护理治疗性处理，并且所述标准护理治疗性处理是全脑放射疗法或立体定位性放射手术中的一个或两个。
15.一种治疗受试者中的现有脑转移肿瘤的方法，其包括给所述受试者施用内皮素受体拮抗剂和至少一种细胞毒性化学治疗剂的组合。
16.一种具有人癌症转移细胞脑肿瘤的小鼠，所述小鼠进一步包含a)以治疗有效量的至少一种细胞毒性化学治疗剂，以治疗所述人癌症转移性脑肿瘤，和b)至少一种内皮素受体拮抗剂，其量足以抑制星形胶质细胞介导的所述人癌症转移性脑肿瘤的保护。
17.一种分离的星形胶质细胞-癌细胞复合物，其中分离的星形胶质细胞与分离的癌细胞处于间隙连接通讯中。
18.权利要求17的分离的星形胶质细胞-癌细胞复合物，其中所述分离的星形胶质细胞是鼠星形胶质细胞，并且所述分离的癌细胞是人癌细胞。
19.权利要求18的分离的星形胶质细胞-癌细胞复合物，其中所述分离的癌细胞系细胞是MDA-MB-231或PC14Br4。
20.一种形成分离的星形胶质细胞-癌细胞复合物的方法，其包括步骤a)提供分离的星形胶质细胞，b)提供癌细胞，c)将所述提供的细胞共培养对于在所述细胞之间的间隙连接形成足够的时间，从而形成所述星形胶质细胞-癌细胞复合物。
21.权利要求20的方法，其中所述分离的星形胶质细胞是鼠星形胶质细胞，并且所述分离的癌细胞是人癌细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述分离的癌细胞系是MDA-MB-231或PC14Br4。
23.权利要求20、21或22的方法，其进一步包括加入一种或多种候选化学治疗剂的步骤，以评价星形胶质细胞介导的针对所述化学治疗剂的细胞毒性效应的保护的程度。
24.权利要求23的方法，其进一步包括执行分子诊断步骤的步骤，以提供对应于所述星形胶质细胞介导的针对所述化学治疗剂的细胞毒性效应的保护的鉴定分子概况。
25.权利要求24的方法，其中所述分子诊断步骤是差异基因表达测量或差异细胞蛋白质浓度测量中的一种或多种。
26.权利要求25的方法，其中所述差异基因表达测量使用基因芯片执行。
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