CN103243074B - 一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents
一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103243074B CN103243074B CN201210033124.0A CN201210033124A CN103243074B CN 103243074 B CN103243074 B CN 103243074B CN 201210033124 A CN201210033124 A CN 201210033124A CN 103243074 B CN103243074 B CN 103243074B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- cell
- clone
- tumor
- cell line
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title abstract description 7
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 title abstract 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 152
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 112
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims abstract description 47
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 14
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 23
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 claims description 23
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims description 20
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 18
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 17
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 17
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 17
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 12
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 7
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 5
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 4
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 abstract description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 29
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N camptothecin Chemical compound C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 238000011728 BALB/c nude (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 2
- KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N Camptothecin Natural products CCC1(O)C(=O)OCC2=C1C=C3C4Nc5ccccc5C=C4CN3C2=O KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 2
- 235000018259 Solanum vestissimum Nutrition 0.000 description 2
- 240000002825 Solanum vestissimum Species 0.000 description 2
- -1 Streptomycin sulphates Chemical class 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229940127093 camptothecin Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N dl-camptothecin Natural products C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)C5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N sodium;5-ethyl-5-pentan-2-yl-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006478 Cecal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000994460 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 20 Proteins 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 102100032700 Keratin, type I cytoskeletal 20 Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000405217 Viola <butterfly> Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 208000011645 metastatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N vitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N 0.000 description 1
- 235000001892 vitamin D2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011653 vitamin D2 Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种人结直肠癌肿瘤干细胞系及其制备方法和应用，所述细胞系为保藏号为CGMCC No.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C，所述细胞系的制备方法，包括以下步骤：1)分离原代结肠癌干细胞；2)原代结肠癌干细胞的体外培养；3)结肠癌干细胞的培养及鉴定；4)将步骤3)获得的结肠癌干细胞再次按与步骤1)、2)和3)相同的方法分离、培养筛选表达CD44膜蛋白的肿瘤干细胞系所述细胞系的应用为其在制备用于诱导肿瘤形成的药物、用于肿瘤转移的药物和筛选抗肿瘤发生、抗肿瘤生长和抗肿瘤转移药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞系，尤其涉及一种人结直肠癌肿瘤细胞系，该细胞系表达正常干细胞自我更新相关因子，具有高克隆形成能力和体内成瘤能力，具有肿瘤干细胞特征，及其可应用于肿瘤干细胞的研究、药物开发和相关领域。
背景技术
癌症是严重威胁人类生存和健康的疾病。近几十年来，随着科学的发展，人们对于癌症的认识有了显著的深入。但是传统的治疗方式并不能彻底治愈癌症，复发和转移往往是导致癌症病人死亡的原因。研究发现肿瘤组织无论是原发肿瘤还是转移癌中都包含有不同特征和功能的癌细胞：高度分化的癌细胞增殖能力较弱；而具有低分化表型的癌细胞却具有很强的增殖能力，移植到免疫缺陷小鼠体内能够产生和原发肿瘤表型类似的肿瘤，有此功能的这部分细胞被称为肿瘤干细胞(Al-Hajj and Clarke，2004)。
近年来，支持肿瘤干细胞学说的研究不断涌现，目前从脑瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌等癌组织中分离和鉴定出肿瘤干细胞，研究发现肿瘤干细胞具有与正常干细胞相似的生物学特性(Spillane and Henderson，2007；Sagar et al.，2007)，包括自我更新、分化、死亡耐受、膜转运活跃、侵袭和转移等。目前通过对肿瘤干细胞的研究认识到，癌症的发生和生长是由一小部分肿瘤干细胞群决定的，肿瘤干细胞有着不同于普通癌细胞和正常细胞的生物学特征，目前已经发现肿瘤干细胞的特征包括1)在肿瘤中存在比例很低，仅有数很少的一群癌细胞具有无限增殖能力；2)具有肿瘤形成能力，通过流式细胞技术或其他免疫分选技术根据表面特异分子分离出来的细胞接种到动物体内能够形成新的肿瘤。
肿瘤干细胞一般在肿瘤中所占比例低，它们通常处于细胞周期的G0期，具有较高的耐药性，对射线不敏感性。常规的化疗或放疗只能杀死快速分裂的普通癌细胞，而对这一小群肿瘤干细胞作用甚微。逃脱药物和射线杀伤作用的肿瘤干细胞成为癌症复发和转移的根源。肿瘤干细胞能够启动肿瘤发生，并且这一小群细胞能够维持肿瘤生长，肿瘤干细胞的特征为开发新型高效的诊断和治疗手段提供了新思路。按照肿瘤干细胞的理论模型，常规的治疗方式不能有效地清除肿瘤干细胞，杀死普通癌细胞只能暂时缓解癌症，癌症的转移和复发在所难免。尽管目前临床上有多种非常成功的治疗肿瘤的药物，可以有效缓解肿瘤，但是这种药物并没有治愈疾病，相当大比例的患者会发生癌症复发。原因是传统抗肿瘤药物的筛选是根据短期临床治疗效果评估的，因此那些能迅速杀死大量普通癌细胞的药物往往被筛选出来，能够杀伤肿瘤干细胞的药物反而因为作用时间长、短期疗效不明显而被剔除。而针对肿瘤干细胞的药物虽然在短期内效果不太明显，但是由于遏制癌症发展的源头，长期效果更加显著。肿瘤干细胞模型为设计高效彻底治愈癌症的治疗方法提供了思路：通过传统治疗杀死普通癌细胞，针对肿瘤干细胞特异性靶点来抑制肿瘤干细胞功能或清除肿瘤干细胞，可能会达到既疗效显著又能彻底治愈的效果。更精确地靶向肿瘤干细胞的药物疗效将会更加持久，副作用更小，可能达到完全治愈的目的。
肿瘤干细胞的概念为癌症的发生、发展、转移和复发提供了新的思路，这方面的深入研究有可能为肿瘤的治疗和早期诊断带来新的契机。寻找肿瘤干细胞特异标志及信号通路，找到能有效杀伤肿瘤干细胞的方法和手段，将为癌症的治疗提供新的思路。然而制约肿瘤干细胞研究的主要困难在于肿瘤干细胞数目稀少，且在体外培养容易分化为普通癌细胞。
目前国内外尚无肿瘤干细胞系的报道，肿瘤干细胞主要来源于运用流式细胞分选技术从临床样本中获得特定表面蛋白(如CD44，CD133，CD24等)标记的原代癌细胞，这就导致了肿瘤干细胞活力低和样本之间差异大的问题。由于原代肿瘤干细胞在普通体外培养条件下极易分化程普通癌细胞，极大制约了肿瘤干细胞的深入研究。
发明内容
因此，本发明的目的是针对现有条件的不足，提供一种具有肿瘤干细胞特征的细胞系，从而能够更为有效地进行杀伤肿瘤干细胞的药物开发，从根本上治疗肿瘤。
本发明的另一目的是提供一种肿瘤干细胞的建系方法，其用于分离、鉴定肿瘤干细胞特征，还提供一种长期培养肿瘤干细胞系的技术，用于在标准培养体系内获得稳定和充足的肿瘤干细胞来源。
针对上述目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种表达CD44膜蛋白的人结直肠癌肿瘤干细胞系，所述细胞系为保藏号为CGMCC No.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C(该细胞系的分类命名为人结肠癌干细胞，并于2011年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)。
另一方面，本发明提供一种人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C的指示细胞系，所述细胞系通过将Otc3/4启动子连接EGFP基因的质粒转染于本发明所述的细胞系而得。
优选地，所述细胞系能够形成肿瘤。
优选地，所述细胞系形成的肿瘤为皮下肿瘤或原位肿瘤。
优选地，所述形成的肿瘤能够发生转移。
更优选地，所述形成的肿瘤能够转移到肝脏。
再一方面，本发明提供一种高表达CD44膜蛋白的人结直肠癌肿瘤干细胞系的制备方法，包括以下步骤：
1)分离原代结肠癌干细胞：取结肠癌组织剪碎后，消化获得单细胞悬液，再加入小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647单抗和小鼠抗人CD44FITC单抗孵育；再用无菌流式细胞分选技术分离出原代结肠癌细胞；
2)原代结肠癌干细胞的体外培养：稀释步骤1)获得的原代细胞，接种于96孔板中进行培养；
3)结肠癌干细胞的培养及鉴定：当原代细胞形成的悬浮球状克隆直径达到0.5毫米左右时，离心去上清，再将其消化后，以1∶5的比例重新接种到新鲜细胞培养液中，筛选体内成瘤能力和体外克隆形成能力的P6C细胞；
4)将步骤3)获得的结肠癌干细胞再次按与步骤1)、2)和3)相同的方法分离、培养筛选表达CD44膜蛋白的肿瘤干细胞系P6C，即得。
优选地，还包括将Otc3/4启动子连接于EGFP基因的质粒转染于步骤4)获得的肿瘤干细胞系。
又一方面，本发明提供一种上述所述的细胞系或所述的方法制得的细胞系在制备用于诱导肿瘤形成的药物中的应用。
另一方面，本发明提供一种上述所述的细胞系或所述的方法制得的细胞系在制备用于转移肿瘤的药物中的应用。
再一方面，本发明提供一种上述所述的细胞系或所述的方法制得的细胞系在制备筛选抗肿瘤药物中的应用。
本发明的肿瘤干细胞系表达肿瘤干细胞表面标志蛋白，具有极高的克隆形成你能力和体内成瘤能力，并对多种临床抗肿瘤药物具有极强的耐药性，能够在体外稳定培养，从而细胞系材料应用于肿瘤和肿瘤干细胞的药物开发。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1表明流式细胞仪分选EpCAM+CD44+的原代结肠癌细胞的试验结果图，其中，图1A为流式细胞仪分选EpCAM+原代结肠癌细胞的点样分布图，图中1为不表达EpCAM的细胞，2为表达EpCAM的细胞；图1B为流式细胞仪分选EpCAM+CD44+原代结肠癌细胞的试验结果图；
图2表明EpCAM+CD44+原代结肠癌干细胞的克隆形成能力；
图3表明EGFP指示本发明所述肿瘤干细胞系P6C的指示细胞系的Oct3/4启动子的激活状态；
图4表明流式细胞技术分析本发明所述的肿瘤干细胞系P6C膜蛋白表达的试验结果，其中，图4A为本发明所述肿瘤干细胞系P6C的膜蛋白表达的流式细胞分析图，其中M1表示不表达该膜蛋白，即阴性；M2表示表达该膜蛋白，即阳性；图4B为本发明所述的肿瘤干细胞系P6C膜蛋白相对表达量柱状图；
图5表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C表达干细胞因子Oct3/4，其中，图5A为细胞系P6C表达的内源性Oct3/4免疫荧光结果，图5B为细胞系P6C的DAPI染核结果，图5C为A与B荧光叠加结果；
图6表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C具有很高的克隆形成能力，其中，图6A为发明所述的肿瘤干细胞系P6C、HCT116和SW480的克隆结果图，图6B为本发明所述的肿瘤干细胞系P6C、HCT116和SW480克隆数量统计图；
图7表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C的皮下成瘤能力；
图8表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C能够在原位形成肿瘤，并能够转移到肝脏。
图9表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C对喜树碱(camptothecin)具有很高的耐药性，其中，图9A为喜树碱处理本发明所述的肿瘤干细胞系P6C、HCT116和SW480的细胞形态图，其中的对照为未经药物处理的细胞形态，图9B为喜树碱处理本发明所述的肿瘤干细胞系P6C、HCT116和SW480存活细胞统计图；
本发明的生物材料的保藏信息：
保藏号为CGMCC No.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C，该细胞系的分类命名为人结肠癌干细胞，并于2011年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的裸鼠品种均为BALB/c nude，购自中国医学科学院动物所；结肠癌组织，取自北京肿瘤医院；结肠癌细胞系HCT116和SW480均购自ATCC。
除非特别指明，以下实施例中所用的细胞培养液均为：2％胎牛血清(购自Hyclone公司)，8％血清替代物(购自Gibco)，1×非必须氨基酸(购自Gibco)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM培养液(购自Gibco)。
除非特别指明，以下实施例所用的DAPI染核方法参见：Karen G.Porterand Yvette S.Feig，The Use of DAPI for Identifying and Counting AquaticMicroflora，Limnology and oceanography，1980年，25(5)期(卷)，943-948页。
实施例1分离、鉴定原代结肠癌干细胞
a)分离原代结肠癌干细胞：取结肠癌病人新鲜结肠癌组织(取自北京肿瘤医院)，在含有300单位/毫升(U/mL)青霉素和300U/mL链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗3次；用无菌眼科剪将其剪碎；加入1毫克/毫升(mg/mL)胶原酶(购自Sigma公司)和1mg/mL透明质酸酶(购自Sigma公司)消化液，于37℃消化30分钟(min)；离心去上清，PBS重悬后用40微米细胞筛过滤获得单细胞悬液。将细胞与小鼠抗人EpCAMAlexa Fluor647单抗(1∶50，购自Cell Signaling公司)，小鼠抗人CD44FITC单抗(1∶50，购自BD公司)一起4℃孵育15分钟；然后用无菌流式细胞分选技术(FACS)分离出EpCAM+CD44+的原代结肠癌细胞。图1A中红色点即2为表达EpCAM的细胞，即EpCAM+；图1B细胞均为图1A中红色点细胞(图1中的2)，即EpCAM+，其中P2为表达EpCAM，表达CD44的细胞，即EpCAM+CD44+，P3为表达EpCAM，不表达CD44的细胞，即EpCAM+CD44-。
b)原代结肠癌干细胞的体外培养：稀释原代细胞，以平均0.5个细胞/孔的密度接种在96孔板中，培养条件为2％胎牛血清(购自Hyclone公司)，8％血清替代物(购自Gibco)，1×非必须氨基酸(购自Gibco)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM培养液(购自Gibco)，于37℃、5％二氧化碳、95％空气的恒温培养箱(购自Sanyo公司)中进行培养。三天换细胞培养液一次，取单细胞来源的克隆。
c)结肠癌干细胞的培养及鉴定：当原代细胞形成的悬浮球状克隆直径达到0.5毫米左右时，300g离心5分钟，去上清；加入0.25％胰蛋白酶(购自Sigma公司)，37℃消化10分钟；轻轻将细胞球吹散后以1∶5的比例重新接种到新鲜细胞培养液中。体内成瘤能力和体外克隆形成能力是鉴定肿瘤干细胞特征的两个金标准。上述低粘附板中的球状克隆长至0.5mm直径时，用玻璃管小心吸出单个克隆球，接种到裸鼠(BALB/c nude，购自中国医学科学院动物所)皮下，观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，计算体积。当皮下肿瘤长轴达到5mm或40天时，处死裸鼠，剥取皮下肿瘤。部分肿瘤继续接种到裸鼠皮下，检测次级皮下肿瘤的发生；部分肿瘤固定在10％中性福尔马林溶液中，石蜡包埋切片，免疫组化方式检测CD44等肿瘤干细胞表面蛋白的表达，苏木素/伊红(H&E)染色观察皮下肿瘤的组织形态；还有部分肿瘤用胶原酶/透明质酸酶消化成单细胞悬液，流式细胞技术分析CD44等肿瘤干细胞相关蛋白的表达。除体内成瘤实验以外，传代中的单细胞悬液经过计数以后接种1000个到0.35％软琼脂中，21天以后用结晶紫染色，所有克隆均可以被染上蓝紫色(图2)。只统计直径大于等于0.5mm的克隆的数目，计算克隆形成能力(＝克隆数目/1000×100％)。
实施例2建立具有肿瘤干细胞特征的细胞系
a)表达CD44膜蛋白的肿瘤干细胞系的建立：用上述方法分离、培养获得的结肠癌细胞具有肿瘤干细胞的特征，具有极高的肿瘤形成能力和克隆形成能力，命名为P6C。P6C能在体外稳定传代，目前已经传代到第120代。P6C在低粘附培养条件下形成悬浮的克隆球，在粘附条件下能贴壁形成干细胞样克隆(holoclone)。
b)Oct3/4启动子激活指示细胞系的建立：Oct3/4启动子被调控激活状态下EGFP表达发出绿色荧光，以此指示干细胞因子Oct3/4的活化状态。转染细胞系P6C的前一天，将细胞系P6C从克隆球中用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，预铺于铺有明胶的六孔板中(2×105个细胞/孔)。Oct3/4promoter EGFP质粒(该质粒为Oct3/4启动子克隆到EGFP基因上游的质粒)，购自上海交通大学医学院，取2μg该质粒与6μL脂质体lipo2000(购自Invitrogen公司)的混合物；6小时后吸去质粒-脂质体，加入细胞培养液，隔天换细胞培养液(与前述细胞培养液一致)。第三天收集所有细胞，通过流式细胞仪分选表达EGFP的细胞，于新鲜细胞培养液中贴壁培养；1周以后再次收集细胞，流式分选表达EGFP的细胞；重复分选1次，把分选到的细胞以平均0.5个细胞/孔的密度接种到96孔板中，得到EGFP绿色荧光指示Oct3/4启动子激活状态的P6C指示细胞，如图3所示。
实施例3肿瘤干细胞系P6C的分化特性检测
a)将贴壁培养的细胞系P6C用0.2％胰蛋白酶37℃消化成单细胞悬液，计数，加入pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)至终浓度为106个细胞/毫升。
b)分别加入荧光标记的小鼠抗人单克隆抗体anti-CD24(1∶50，购自Biolegend)；anti-CD44(1∶50，购自BD pharmingen)；anti-CD133(1∶50，购自Miltenyi)；anti-CD45-FITC(1∶50，购自BD pharmingen)；anti-CD31(1∶50，购自BD pharmingen)；anti-CK1(1∶50，购自Santa Cruz)；anti-CK20(1∶50，购自Santa Cruz)；anti-CDX2(1∶100，购自DAKO)。
c)4℃孵育20分钟，然后用流式细胞仪检测对应抗原的表达情况；FITC标记的山羊抗小鼠IgG与P6C细胞系孵育作为阴性对照。
如图4所示，表明细胞系P6C表达上皮细胞标志物CD24，癌症干细胞标志物CD44，CD133；不表达内皮来源标志物CD45，CD31；低表达分化的癌细胞标志物CK1、CK20、CDX2。球状克隆状态的P6C(P6MC)表达更多的肿瘤干细胞标志蛋白CD44和CD133。结肠癌细胞系SW480作为分化癌细胞对照。
实施例4肿瘤干细胞系P6C表达干细胞因子Oct3/4
a)在低粘附培养板中如实施例1所述条件下培养肿瘤干细胞系P6C，收集P6C球状克隆。
b)加入多聚甲醛(购自Sigma公司)固定20分钟，2N HCl处理20分钟。
c)加入小鼠抗人Oct3/4单克隆抗体(购自Santa Cruz公司)，室温孵育3小时。
d)加入Cy3标记的抗小鼠IgG二抗。
e)DAPI复染细胞核后封片。
如图5所示，荧光显微镜下检测到P6C表达内源性Oct3/4，且与DAPI染色结果重合，表明Oct3/4定位于细胞核中。
实施例5肿瘤干细胞系P6C体外克隆形成能力检测
a)细胞系P6C用0.2％胰蛋白酶37℃消化10分钟，玻璃管吹打成单细胞悬液，计数。
b)1000rpm离心去上清，加入细胞培养液(同前所述)至终浓度104个细胞/毫升。
c)取20微升P6C单细胞悬液接种于六孔板，每4-5天更换新鲜细胞培养液。
d)21天以后吸去细胞培养液，pH7.2磷酸盐缓冲液洗1次。
e)加入1％结晶紫(购自Sigma公司)染色，PBS洗一次。计算每孔克隆数量，结果如图6所示，显示P6C的克隆形成能力显著高于结肠癌细胞系HCT116和SW480。
实施例6肿瘤干细胞系P6C在免疫缺陷小鼠皮下形成肿瘤
a)2×106个P6C细胞接种在六孔板中，加入如前所述的细胞培养液培养24小时。
b)将DsRed红色荧光质粒(购自中国科学院动物研究所)1μg与3μL转染试剂(购自Origen公司)在200μL无血清DMEM中混合均匀，滴入预铺P6C细胞的六孔板中，共同孵育6小时。
c)吸去细胞培养液混合物，加入如前所述细胞培养液，24小时之后在荧光显微镜下观察红色荧光，估算转染效率。
d)往细胞培养液中加入0.5μg/mL终浓度的嘌呤霉素(puromycin)(购自Sigma公司)，隔天吸去死细胞并加入新鲜细胞培养液(含嘌呤霉素)，重复4次，获得稳定表达DsRed红色荧光蛋白的P6C细胞。
e)0.2％胰蛋白酶消化此细胞成单细胞悬液，并以平均0.5个细胞/孔的密度接种于96孔板中。14天后取形成的单细胞克隆接种于裸鼠(BALB/cnude，购自中国医学科学院动物所)皮下，用活体荧光成像的方法检测皮下肿瘤的形成，如图7所示。
实施例7肿瘤干细胞系P6C能在免疫缺陷小鼠盲肠形成原位肿瘤
a)以3×105个细胞/mL细胞培养液的密度将稳定表达DsRed红色荧光的P6C肿瘤干细胞系接种在底面积为25cm2的培养瓶中，加入如前所述的细胞培养液培养24小时，获得对数生长期的细胞。
b)0.2％胰蛋白酶消化此细胞成单细胞悬液，计数，并以2×107个细胞/mL的浓度重悬在磷酸盐缓冲液PBS中。
c)100μL 3％戊巴比妥溶液腹腔注射联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID，购自中国医学科学院动物所)，待5分钟小鼠麻醉后在超净工作台剪开小鼠腹膜，暴露盲肠。
d)用胰岛素针吸取50μL P6C细胞悬液，并将细胞悬液移植到盲肠肠壁。
e)手术缝合小鼠腹膜和皮肤，4周后用活体荧光成像的方法检测盲肠原位肿瘤的形成，如图8所示。
实施例8肿瘤干细胞系P6C形成的肿瘤能够转移到肝脏
a)以3×105个细胞/mL细胞培养液的密度将稳定表达DsRed红色荧光的P6C肿瘤干细胞系接种在底面积为25cm2的培养瓶中，加入如前所述的细胞培养液培养24小时，获得对数生长期的细胞。
b)0.2％胰蛋白酶消化此细胞成单细胞悬液，计数，并以2×107个细胞/mL的浓度重悬在磷酸盐缓冲液PBS中。
c)100μL 3％戊巴比妥溶液腹腔注射联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID，购自中国医学科学院动物所)，待5分钟小鼠麻醉后在超净工作台剪开小鼠腹膜，暴露盲肠。
d)用胰岛素针吸取50μL P6C细胞悬液，并将细胞悬液移植到盲肠肠壁。
e)手术缝合小鼠腹膜和皮肤，12周后用活体荧光成像的方法检测肿瘤转移到肝脏，如图8所示。
实施例9肿瘤干细胞系P6C的耐药性
a)将P6C细胞克隆球用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，预铺于铺有明胶的六孔板中(2×105个细胞/孔)，培养24小时。
b)加入终浓度为2μM，5μM喜树碱(Camptothecin，购自Sigma公司)，培养24小时至48小时。
c)明场显微镜下观察细胞形态，按与步骤b)相同的方法处理的普通结肠癌细胞系HCT116(购自ATCC)和SW480作为一般结肠癌细胞系耐药性对照，未加喜树碱处理的P6C、HCT116和SW480细胞作为阴性对照。
d)收集所有贴壁和悬浮的细胞，AnnexinV/PI染色(Manon vanEngeland，Luc J.W.Nieland，Frans C.S.Ramaekers，Bert Schutte，and ChrisP.M.Reutelingsperger，Annexin V-Affinity Assay：A Review on an ApoptosisDetection System Based on Phosphatidylserine Exposure，Cytometry，1998年，31期，1-9页)，流式细胞技术检测活细胞比例。
试验结果如图9所示，图示浓度和作用时间下细胞形态的检测(图9A)和MTT细胞活力检测(Denis Gerlier，Nicole Thomasset，Use of MTTcolorimetric assay to measure cell activation，Journal of ImmunologicalMethods，94卷，1-2期，57-63页，1986年)(图9B)都显示相对于结肠癌细胞HCT116和SW480，P6C都具有高耐药性。
Claims (7)
1.一种表达CD44膜蛋白的人结直肠癌肿瘤干细胞系，所述细胞系为保藏号为CGMCC No.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C。
2.一种人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C的指示细胞系，所述细胞系通过将Otc3/4启动子连接EGFP基因的质粒转染于权利要求1所述的细胞系而得。
3.根据权利要求1所述的细胞系的制备方法，包括以下步骤：
1)分离原代结肠癌干细胞：取结肠癌组织剪碎后，消化获得单细胞悬液，再加入小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647单抗和小鼠抗人CD44FITC单抗孵育；再用无菌流式细胞分选技术分离出原代结肠癌细胞；
2)原代结肠癌干细胞的体外培养：稀释步骤1)获得的原代细胞，接种于96孔板中进行培养；
3)结肠癌干细胞的培养及鉴定：当原代细胞形成的悬浮球状克隆直径达到0.5毫米时，离心去上清，再将其消化后，以1：5的比例重新接种到新鲜细胞培养液中，筛选体内成瘤能力和体外克隆形成能力的P6C细胞；
4)将步骤3)获得的结肠癌干细胞再次按与步骤1)、2)和3)相同的方法分离、培养筛选表达CD44膜蛋白的肿瘤干细胞系P6C，即得。
4.根据权利要求3所述的细胞系的制备方法，其特征在于，还包括将Otc3/4启动子连接EGFP基因的质粒转染于步骤4)获得的肿瘤干细胞系。
5.根据权利要求1或2所述的细胞系或权利要求3或4所述的方法制得的细胞系在制备用于肿瘤形成或转移肿瘤的药物中的应用。
6.根据权利要求1或2所述的细胞系或权利要求3或4所述的方法制得的细胞系在制备筛选抗肿瘤发生、肿瘤生长或肿瘤转移的药物中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为皮下肿瘤或原位肿瘤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210033124.0A CN103243074B (zh) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | 一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210033124.0A CN103243074B (zh) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | 一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103243074A CN103243074A (zh) | 2013-08-14 |
| CN103243074B true CN103243074B (zh) | 2014-10-01 |
Family
ID=48922953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210033124.0A Expired - Fee Related CN103243074B (zh) | 2012-02-14 | 2012-02-14 | 一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103243074B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105296430B (zh) * | 2015-09-29 | 2018-08-17 | 浙江大学 | 一种人类结肠癌细胞系dxh-1及其应用 |
| CN105154405B (zh) * | 2015-10-09 | 2019-04-05 | 河北医科大学第一医院 | 一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法 |
| CN105950560B (zh) * | 2016-05-24 | 2019-07-23 | 苏州系统医学研究所 | 人源化pd-l1肿瘤细胞系及具有该细胞系的动物模型与应用 |
| CN108070561A (zh) * | 2016-11-15 | 2018-05-25 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种人原代结肠癌细胞的分离及培养方法 |
| CN106944163A (zh) * | 2017-01-24 | 2017-07-14 | 瑞汉智芯医疗科技(嘉善)有限公司 | 一种针对尿路上皮癌的尿脱落肿瘤细胞的免疫荧光染色技术 |
| CN111004782B (zh) * | 2019-12-13 | 2021-08-17 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 人肠癌原代细胞及其培养方法与应用 |
| CN110846280B (zh) * | 2019-12-13 | 2021-08-17 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 人肠癌原代细胞及其培养方法与应用 |
| CN110904043B (zh) * | 2019-12-13 | 2021-09-21 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 人肠癌原代细胞、应用和培养方法 |
| CN112941024A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-06-11 | 天津医科大学肿瘤医院 | 一种高效分离人实体瘤相关中性粒细胞的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102144163A (zh) * | 2008-04-10 | 2011-08-03 | 麻省理工学院 | 关于鉴定和使用靶向癌症干细胞的试剂的方法 |
-
2012
- 2012-02-14 CN CN201210033124.0A patent/CN103243074B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102144163A (zh) * | 2008-04-10 | 2011-08-03 | 麻省理工学院 | 关于鉴定和使用靶向癌症干细胞的试剂的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| phenotypic charavterition of human clorectal cancer stem cells;piero dalerba et al;《proceedings of the national academy of sciences of the united states of america》;20070612(第104卷第24期);10158页第1行至第35行、10162页第10行至10163页第30行 * |
| piero dalerba et al.phenotypic charavterition of human clorectal cancer stem cells.《proceedings of the national academy of sciences of the united states of america》.2007,(第104卷第24期), |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103243074A (zh) | 2013-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103243074B (zh) | 一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用 | |
| CN105209489B (zh) | 针对间质和上皮-间质转化的循环肿瘤细胞的特异性检测工具 | |
| CN101855339A (zh) | 人类癌症干细胞 | |
| CN101481677B (zh) | 体外刺激树突状细胞成熟的方法 | |
| CN102510719A (zh) | 用与细胞毒性化学治疗剂组合的内皮素受体抑制剂治疗脑转移 | |
| CN107043749B (zh) | 一种肿瘤浸润t淋巴细胞的分离诱导方法 | |
| Lim et al. | Isolation of mesenchymal stem-like cells in meningioma specimens | |
| CN106222141B (zh) | Nk细胞培养液和细胞培养方法 | |
| CN106102753A (zh) | 治疗赘生物形成的方法 | |
| CN105339000A (zh) | 用于活性自体免疫疗法的高纯度卵巢癌干细胞 | |
| US20200046766A1 (en) | Cancer stem cell exosomes | |
| Zhang et al. | Relationship of tumor marker CA125 and ovarian tumor stem cells: preliminary identification | |
| CN114717190B (zh) | 一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系bpt0713及其应用 | |
| CN104262459A (zh) | 一种急性单核细胞白血病相关抗原mlaa-34 表位多肽及其疫苗和制药应用 | |
| CN104195109B (zh) | 一种人肺腺癌细胞系及其应用 | |
| CN103800897B (zh) | 一种肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗制备方法及其试剂盒 | |
| CN107158367A (zh) | 结直肠癌干细胞疫苗制备方法及应用 | |
| CN109097334A (zh) | Ph+急性B淋巴细胞白血病KQBL-84细胞株及其构建方法和应用 | |
| CN103966334A (zh) | Csf2rb基因在前列腺癌骨转移中的应用 | |
| CN110358737A (zh) | 一种利用外泌体制备嵌合抗原受体t淋巴细胞的方法 | |
| CN106244552A (zh) | 一种弥漫性大b细胞型淋巴瘤动物模型的建立方法及其应用 | |
| CN105219731A (zh) | 一种卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法 | |
| CN107460170B (zh) | 人垂体腺瘤细胞系的建立及其应用 | |
| CN110438081B (zh) | 人套细胞淋巴瘤恶性克隆细胞株及其建立方法和应用 | |
| CN103289957B (zh) | 干细胞样肺癌细胞制备及其抗原组合物负载树突状细胞的方法与试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141001 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |