CN105296430B - 一种人类结肠癌细胞系dxh-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种来源于人乙状结肠癌的原发灶的人类结肠癌细胞系DXH‑1及其作为人结直肠癌发生、人结直肠癌发展或人结直肠癌转移的细胞模型中的应用，在建立人结直肠癌动物模型中的应用，在研究人结直肠癌发生机理和/或治疗人结直肠癌药物中的应用；本发明人结肠癌细胞系DXH‑1能够稳定传代50代以上，为大肠癌机制及药物筛选提供适宜材料；在体内裸鼠实验中有较强的成瘤能力，1*106细胞种入裸鼠皮下，35天即可(5/5)100％成瘤；DXH‑1细胞对结直肠癌化疗药物(5FU，奥沙利铂和伊立替康等)有一定的耐药性，为研究结直肠癌化疗药耐药机制提供材料；所述人结肠癌细胞系DXH‑1保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，编号CCTCC No:C201543。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种来源于乙状结肠癌病灶的人类结肠癌细胞系DXH-1及其培养方法与用途。
(二)背景技术
结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近几年来我国发病率呈持续升高趋势。目前公认正常肠黏膜-腺瘤-癌的演变史为肠癌发生演变过程，APC、K-Ras、TP53、C-MYC等众多基因参与肠癌的发生发展机制，但是目前肠癌发生发展的具体机制尚需进一步研究。
目前手术、放化疗这些传统的治疗方案仍然是治疗结直肠癌的主要途径，随着人类对结直肠癌发生发展研究进一步深入，生物靶向治疗为结直肠癌患者带来新的希望，但是大多数晚期患者手术治愈率低，传统治疗预后不佳，因而，寻求更多更完善的结直肠癌治疗手段显得尤为重要。
近年来，结肠癌细胞作为结直肠癌发生发展机理，免疫治疗及药物研究开放的生物学实验材料已经被广泛利用，现有的细胞系在使用过程中经历反复传代后，细胞特性与原始肿瘤细胞相比已产生明显差异。现有的人类肠癌细胞系及其特性尚不能完全满足关于结直肠癌发生发展的机制，仍需要更多不同特性的原代肠癌细胞株用来研究大肠癌的发生发展机制，而目前我国至今为之尚未报道过直接从肠癌病灶培养得到的原代肠癌细胞系。针对日前国内结直肠癌发病率日趋升高，建立我国自己的结肠癌细胞系具有更显著的科学意义和社会意义。
本发明运用临床手术切除标本直接体外培养细胞系，利用胰酶时间差异消化法分离纯化出原代肿瘤细胞系，该细胞系呈典型的恶性肿瘤表现，可在体外稳定传代，接近于肿瘤的临床生物学特征，是研究结直肠癌发生发展转移机制和抗肿瘤免疫治疗及药物筛选的理想实验材料。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种来源于人类乙状结肠癌病灶的人类结肠癌细胞系DXH-1，为大肠癌的发生发展转移机制，免疫治疗及药物筛选等研究提供新的人类原代细胞模型，有助于对大肠癌的发生机制、药物研究进行深入的研究。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于乙状结肠癌病灶的人类结肠癌细胞系DXH-1，所述人类结肠癌细胞系DXH-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No:C201543，保藏日期：2015年5月13日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
本发明所述人类结肠癌细胞系DXH-1原代细胞由如下方法获得：取病人手术新鲜手术标本乙状结肠癌病灶组织，0.5％聚维酮碘浸泡消毒10分钟，眼科剪剪碎至1mm3左右，使用胶原酶/透明质酸酶消化成单细胞后，40μm孔径滤器过滤后，直接置入DMEM/F12完全培养基内培养原代细胞。
本发明所述人类结肠癌细胞系DXH-1建系及传代方法如下：原代细胞培养一周后获得大肠癌肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞混合的细胞群，使用胰酶时间差消化法，即0.025％胰酶消化5分钟后去除肿瘤相关成纤维细胞，重新加入胰酶消化30分钟后获取纯化的大肠癌肿瘤细胞DXH-1，此后每3-4天传代一次。
本发明还涉及构建所述人类结肠癌细胞系DXH-1的方法，所述方法包括：取乙状结肠癌原位灶组织，剪碎后用胶原酶/透明质酸酶消化成单个细胞，培养一周后获得大肠癌肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞混合的细胞群。使用胰酶时间差消化法，即0.025％胰酶消化5分钟后去除肿瘤相关成纤维细胞，重新加入胰酶消化30分钟后获取纯化的人类结肠细胞系DXH-1，可在体外继续培养到50代以上。
具体的，所述构建所述人类结肠癌细胞系DXH-1的方法如下：
(1)取乙状结肠癌原位灶组织，0.5％聚维酮碘浸泡消毒10分钟，PBS冲洗二次去除消毒液；
(2)将消毒后的组织置于洁净的培养皿，用眼科剪将其剪碎至大小1mm左右碎块，加入至胶原酶/透明质酸酶消化液中消化；
(3)将上述消化液置于37℃孵箱，150rpm振荡消化1小时获得单细胞悬液；
(4)将步骤(3)消化获取的单细胞悬液，经40μm孔径滤器过滤后，接种至DMEM/F12培养基中，培养24小时后，将培养基吸去后，重新加入新鲜DMEM/F12培养基继续培养约一周；
(5)当培养至所有混合细胞群长至瓶底80％时，吸去培养基，加入0.025％胰酶消化5分钟后，弃去此时消化下来的肿瘤相关成纤维细胞，重新加入胰酶消化剩余贴壁细胞30分钟后，加入培养基中和，1000g 5分钟离心，再种入新的培养瓶中贴壁培养，此即人类结肠细胞系DXH-1，标记传代次数为P0；
(6)DXH-1细胞按照1：3传代，每3-4天传代一次，细胞生长稳定，体外可继续传代50次以上。
本发明还提供所述的人类结肠癌细胞系DXH-1在作为人结直肠癌发生、人结直肠癌发展或人结直肠癌转移的细胞模型中的应用。
本发明涉及所述的人类结肠癌细胞系DXH-1在建立人结直肠癌动物模型中的应用。
本发明涉及所述的人类结肠癌细胞系DXH-1在研究人结直肠癌发生机理和/或治疗人结直肠癌药物中的应用。
本发明所述的人类结肠癌细胞系DXH-1的用途，是指肿瘤基础科学研究，临床应用研究以及创新治疗的研发等方面，包括但不限于：
(1)研究人结直肠癌发生发展的生物学机制；
(2)研究人结直肠癌耐药机制；
(3)筛选人结直肠癌相关生物标志物；
(4)构建人结直肠耐药细胞模型；
(5)构建人结直肠癌动物模型；
(6)筛选人结直肠癌的抗癌药物；
(7)筛选开发人结直肠癌免疫治疗疫苗。
本发明所述人类结肠癌细胞系DXH-1的生物学相关特性，其主要特性体现在：
1、DXH-1细胞是从乙状结肠癌病灶取材建立的细胞系，在体外一般培养条件就能使细胞存活并传代，现已稳定传代50代以上，为大肠癌机制及药物筛选提供适宜材料；
2、DXH-1在体内裸鼠实验中有较强的成瘤能力，1*106细胞种入裸鼠皮下，35天即可(5/5)100％成瘤；
3、DXH-1细胞系为MMR突变细胞系，TP53(-)，K-RAS、B-RAF、PTEN、TP53等相关基因的突变情况详见实验结果；
4、DXH-1细胞对结直肠癌化疗药物(5FU，奥沙利铂和伊立替康等)有一定的耐药性，为研究结直肠癌化疗药耐药机制提供材料。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供一种来源于乙状结肠癌病灶的人类结肠癌细胞系DXH-1及其作为人结直肠癌发生、人结直肠癌发展或人结直肠癌转移的细胞模型中的应用，在建立人结直肠癌动物模型中的应用，在研究人结直肠癌发生机理和/或治疗人结直肠癌药物中的应用；本发明人类结肠癌细胞系DXH-1能够稳定传代50代以上，为大肠癌机制及药物筛选提供适宜材料；在体内裸鼠实验中有较强的成瘤能力，1*106细胞种入裸鼠皮下，35天即可(5/5)100％成瘤；DXH-1细胞对结直肠癌化疗药物(5FU，奥沙利铂和伊立替康等)有一定的耐药性，为研究结直肠癌化疗药耐药机制提供材料。
(四)附图说明
图1：分离出稳定传代第15代原代人结肠癌细胞系DXH-1在DMEM/F12培养基下生长第3天，克隆球形成。
图2：裸鼠体内实验，1*106细胞裸鼠皮下生长35天后即可(5/5)100％成瘤。
图3：裸鼠体内实验，DXH-1细胞体内生长曲线。
图4：裸鼠体内成瘤组织的病理照片。
图5：裸鼠移植瘤MMR相关基因免疫组化结果。
图6：DXH-1细胞系的基因突变检测。
图7：DXH-1细胞系对5FU、奥沙利铂(Oxaliplatin)及伊立替康(Irrinotecan)等临床常用结直肠癌药物的药敏实验结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
一、材料：
1、细胞培养液的配置方法
1.1培养液，DMEM/F12完全培养基组成如下：10％(v/v)胎牛血清(澳洲Gibico公司)，100U/ml丙酮酸，100U/ml非必需氨基酸，100U/ml谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素(杭州吉诺公司)，溶剂为DMEM/F12(1：1)培养基(美国Gibico公司)；
1.2消化液：含1mg/ml胶原酶和1mg/ml透明质酸酶IV(美国sigma公司)的RPMI1640培养基。
2、其他细胞培养材料
胰酶：0.025％(w/v)胰酶溶液；细胞冻存液(胎牛血清：DMSO＝9：1，v/v)；PBS缓冲液。
3、标本来源
浙江大学医学院附属第二医院肿瘤外科患者李某某，83岁，男性，术前征求患者本人同意，签署知情同意书，术中切除的乙状结肠癌病灶标本。术后病理诊断为乙状结肠低分化腺癌，临床病理分期T4bN2M1。
4、实验动物
NOD/SCID裸鼠，鼠龄为4-5周，饲养于浙江省中医药大学动物实验中心。
5、分子生物学实验相关材料
DNA提取试剂盒(日本Takara公司)。
二、方法
1、乙状结肠癌病灶细胞获取
将新鲜结肠癌病灶组织用眼科剪去除坏死组织及脂肪组织，用含有稀释后的PVP碘(PVP碘：PBS缓冲液＝5：1)浸泡15分钟，用含5倍浓度双抗(添加500U/ml青霉素和500U/ml链霉素)PBS缓冲液冲洗3次后剪成1mm3左右，用含1mg/ml胶原酶和1mg/ml透明质酸酶IV(美国sigma公司)的RPMI1640培养基在37℃消化2小时，先后用100μm和40μm孔径的细胞筛过滤，除去未消化组织，将滤液，1000g，离心5分钟，弃去上清，沉淀用PBS缓冲液清洗一次后再次离心后加入DMEM/F12完全培养基，置入37℃恒温孵箱培养。
2、胰酶时间差消化法获得单一原代肠癌细胞
步骤1中细胞培养24小时后，将培养基吸去，重新加入新鲜DMEM/F12完全培养基继续培养，当培养至所有混合细胞群长至瓶底80％时，吸去培养基，加入含0.02％EDTA的胰酶消化5分钟后，弃去此时消化下来的肿瘤相关成纤维细胞，剩余贴壁细胞置于37℃孵箱中继续消化30分钟后，加入DMEM/F12完全培养基中和，1000g，5分钟离心获得纯化的肿瘤原代细胞，此即人类结肠癌细胞系DXH-1，标记传代次数为P0，再种入新的培养瓶中培养。人类结肠癌细胞系DXH-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No:C201543，保藏日期：2015年5月13日。
根据细胞的状态及培养基颜色的变化，每隔2-3天更换一次培养基，细胞长满瓶底的80-90％即应及时消化，传代比例1：4～1：2。
三、实验结果
(一)来源于乙状结肠癌病灶的结肠癌细胞系DXH-1细胞，在体外连续稳定传代，目前已传至50多代。采用传代至约15代DXH-1细胞进行相关的生物学、遗传学和组织学来源鉴定。经实验观察验证，体外生长的细胞具有典型的上皮样形态，外形呈多边状，失去接触生长抑制，呈恶性生长，遗传学研究证实该细胞为多倍体，大部分细胞为65条的复杂的异常核型，同时伴多个染色体的缺失，易位等变异，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该DXH-1细胞以2*106细胞种植于裸鼠皮下40天时即可100％成瘤，具有高度致瘤性。该DXH-1细胞经基因测序证实为K-RAS，G13D位点突变，N-RAS，B-RAF，EGFR野生型，P53和PTEN点突变型细胞。该DXH-1可以作为研究体内外临床结直肠癌发生、发展、转移机制，免疫治疗研究及相关药物敏感性和耐药性筛选提供新的试验材料。
具体如下：
1.形态学观察
将培养DXH-1细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行拍照，如图1所示，DXH-1细胞大多呈梭形，核大，核仁明显，细胞密度高时融合成一体，胰酶消化时间较长(30min以上)，细胞生长速度较快，稳定传代10代以后，1：2传代时3天即可长满一代。
2.冻存与复苏
细胞冻存后复苏，细胞70％存活，生长旺盛。
3.细胞的体内成瘤能力
体外培养大量DXH-1细胞后，以1*105和1*106细胞种植于裸鼠皮下时均可100％成瘤，具有高度致瘤性，见图3。以1*106细胞为例，将稳定传代的DXH-1细胞接种于裸鼠皮下后16天以后100％全部成瘤，移植瘤呈结节状，与皮肤粘连，质硬，结果见图2，移植瘤成瘤后生长曲线见图3。
4.肿瘤的病理学鉴定
将DXH-1细胞形成的移植瘤进行福尔马林固定，石蜡包埋及HE染色，结果见图4，临床手术标本镜下观察，肿瘤组织细胞异性型明显，胞核大，深染，核浆比例大，周围被间质细胞包围，形成大量腺管样结构；裸鼠移植瘤标本镜下观察，细胞异性型明显，细胞生长旺盛，细胞核增大深染。它们的临床病理诊断均为低分化腺癌。
5.DXH-1细胞移植瘤免疫组化检测
将小鼠移植瘤进行福尔马林固定，石蜡包埋后采用Envision二步法做免疫组化方法检测MMR突变情况，DXH-1细胞裸鼠移植瘤MLH1(－)，MSH2(－)，MSH6(+)，PMS(+)，如图5。
6.DXH-1细胞基因突变检测
利用DNAiso Reagent(takara公司)试剂提取DXH-1细胞DNA，并检测浓度，使用Sanger测序法检测K-RAS,N-RAS,B-RAF和EGFR基因突变情况，检测发现该细胞K-RAS 13位点G13D突变，N-RAS,B-RAF和EGFR基因未发生突变，同时进行PTEN和TP53的SNP检测，发现PTEN发生第301位和2370位点突变，TP53发生第119位，第140位，167位点突变，见图6。
7.DXH-1细胞系对5FU、奥沙利铂及伊立替康等临床常用结直肠癌药物的药敏实验
我们测试了DXH-1细胞对临床常用的结直肠癌化疗方案中的主要化疗药物(5FU、奥沙利铂及伊立替康)的敏感性检测，结果显示，这三种化疗药物对DXH-1细胞生长虽然有不同程度的抑制作用，且随着作用时间增加，药物毒性加大，但是对比科学研究中常用的SW620细胞而言，DXH-1细胞对这三种化疗药物呈现出不同程度的耐药，提示DXH-1细胞可以用于这些研究结直肠癌药物耐药的研究，帮助筛选结直肠癌抗癌药物，见图7。
以上所述仅是本发明的优选实验方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以作出若干改造和补充，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种人类结肠癌细胞系DXH-1，其特征在于，所述人类结肠癌细胞系DXH-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No:C201543，保藏日期：2015年5月13日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
2.如权利要求1所述的人类结肠癌细胞系DXH-1在作为人结直肠癌发生、人结直肠癌发展或人结直肠癌转移的细胞模型中的应用。
3.如权利要求1所述的人类结肠癌细胞系DXH-1在建立人结直肠癌动物模型中的应用。
4.如权利要求1所述的人类结肠癌细胞系DXH-1在研究人结直肠癌发生机理和/或治疗人结直肠癌药物中的应用。
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