CN104531760A

CN104531760A - Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒及其应用方法

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Publication number: CN104531760A
Application number: CN201410829769.4A
Authority: CN
Inventors: 谭斯品; 谭思创; 陈志康; 谭晶; 文俏程
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: CN104531760B

Abstract

本发明公开了一种Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒及其应用方法。首次成功构建了Dp71蛋白的短发夹RNA(Dp71-shRNA)干扰质粒，将其转染至肺腺癌细胞株A549中，构建稳定转染Dp71-shRNA质粒的细胞株。发现削减A549细胞中的Dp71蛋白可以抑制A549细胞的增殖，浸润，侵袭迁移，在体肺腺癌细胞株裸鼠移植动物模型也证实，削减A549细胞中的Dp71蛋白的表达，可以从在体水平抑制A549移植瘤的生长。而且发现削减Dp71蛋白的表达可能是通过降低laminB1,Bcl-2和MMP-2蛋白来达到抑制A549细胞的恶性程度。本发明将为肺癌的治疗提供新线索和途径，具有重大意义。

Description

Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒及其应用方法

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学的技术领域，具体涉及Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒及其应用方法。

背景技术

Dystrophin(肌营养不良蛋白)基因是哈佛大学Kunkel教授在1986年通过定位克隆技术克隆出来的，定位于人类Xp21.1-21.3，引起杜氏肌营养不良的致病基因。Dp71是Dystrophin在非肌肉组织中表达最广泛的一类剪切本，它是由Dystrophin基因从位于62号外显子和63号外显子中的启动子区始动基因的转录，翻译的蛋白。关于Dp71的研究表明，在胚胎发育的多能干细胞中可以检测到Dp71的表达，Dp71是胚胎发育期间首批可以检测到的该基因家族成员。近年来的研究表明：Dp71除了分布在细胞膜外，还在细胞核和细胞浆内有一定量的表达。Dp71不同剪切本蛋白的研究及其DAPC复合物在核内定位的证实表明Dp71蛋白还具有更多的生物学功能涵待研究。

近年来，关于Dp71的研究主要集中于PC12细胞，Dp71表达量的改变对于其他细胞的生物学功能有何影响，尚没有任何研究。PC12细胞的细胞核组成研究表明，Dp71和核纤层蛋白B，核膜蛋白emerin结合，形成细胞核相关结构，敲除Dp71可抑制PC12细胞的增殖。Dp71还参与PC12细胞的细胞黏附等生物学行为。本发明通过使用Dp71发夹干扰RNA(shRNA)质粒，转染A549肺腺癌细胞系,建立Dp71稳定削减的肺癌细胞系，通过研究发现，A549-Dp71AS细胞系表现为细胞增殖减慢，克隆形成率减低，浸润与侵袭能力下降。裸鼠A549异体移植瘤实验结果显示，和转染了空白质粒的A549细胞株和空白A549细胞株相比，A549-Dp71AS细胞系裸鼠异体移植成瘤率大大降低。本发明从细胞功能学水平和在体动物水平证实了，削减A549肺腺癌细胞中的DP71蛋白的表达，可以从离体和在体水平降低A549细胞的恶性度，抑制A549细胞体外的成瘤能力。

发明内容

本发明的目的是通过探讨Dp71蛋白削减A549细胞在体与离体的生物学特性，进而构建一种Dp71蛋白的发夹短发夹RNA干扰质粒，用于制备抑制肺癌的制剂。

一种Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，根据Dp71的序列设计能够产生干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段，插入到短发夹RNA干扰载体中构建而成。

上述质粒以人Dp71的mRNA序列为模板，以及载体启动子启动表达siRNA对序列的要求，设计合成能够产生干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段。

siRNA干扰的目标基因Dp71序列如下：

siRNA-1：CTTTAGCTGACCTGAATAA；

siRNA-2：GCACTTTAATTATGACATC；

siRNA-3：CCATGGATATCCTGCAGAT。

优选为siRNA-2：GCACTTTAATTATGACATC。

上述质粒选用的原始质粒表达载体优选为pRNAT-U6.1/Neo。

DNA片段插入到载体时的酶切位点为BamH I和Hind III。

根据Dp71的序列设计能够产生干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段，具体序列如下：Dp71-shRNA-1a链序列：

5’-GATCCCGTCTTTAGCTGACCTGAATAACTCGAGTTATTCAGGTCAGCTAAAGAC

TTTTTGGAT-3’

Dp71-shRNA-1b链序列：

5’-AGCTATCCAAAAAGTCTTTAGCTGACCTGAATAACTCGAGTTATTCAGGTCAGCTAAAGAC GG-3’

Dp71-shRNA-2a序列：

5’-GATCCCAAGCACTTTAATTATGACATCCTCGAGGATGTCATAATTAAAGTGCTT

TTTTTGGAT-3’

Dp71-shRNA-2b序列：

5’-AGCTATCCAAAAAAAGCACTTTAATTATGACATCCTCGAGGATGTCATAATTAAAGTGCTTGG-3’

Dp71-shRNA-3a序列:

5’-GATCCCGCCCATGGATATCCTGCAGATCTCGAGATCTGCAGGATATCCATGGGCTTTTTGGAT-3’

Dp71-shRNA-3b序列:

5’-AGCTATCCAAAAAGCCCATGGATATCCTGCAGATCTCGAGATCTGCAGGATATCCATGGGC GG-3’。

对照shRNA a链序列:

5’-GATCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAT-3’

对照shRNA b链序列:

5’-AGCTATCCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAAGG-3’。

构建的三个Dp71短发夹干扰质粒载体的序列见SEQ NO:12-14。优选见SEQ NO:13。

所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒的应用方法，用于制备抑制肺癌的制剂。

本发明通过在线生物信息学软件选择设计Dp71的干扰序列，按照RNA干扰的原则构建Dp71的短发夹RNA干扰质粒。质粒的构建及筛选含有Dp71的siRNA序列的短发夹RNA干扰质粒采用氨苄青霉素(ampicilin,Amp)抗性基因做为筛选标志。采用新霉素(G418)筛选方法构建稳定转染Dp71-shRNA和其空白对照质粒的A549细胞株。CCK8法检测A549-Dp71AS(转染干扰质粒)，A549(空白对照)，A549-Dp71E(转染空白对照质粒)细胞株的增殖，克隆形成实验监测三组细胞株的克隆形成能力。划痕试验检测三组细胞的迁移能力，Transwell实验检测其浸润能力。A549移植性裸鼠动物模型检测其体外成瘤能力。免疫印迹检测靶点分子LaminB1，Bcl-2和MMP2的表达。

结果是本发明成功的构建了Dp71发夹干扰质粒(Dp71-shRNA)。并将其转染A549细胞，建立稳转细胞株A549-Dp71AS；CCK8实验数据表明，A549-Dp71AS细胞株生长较A549，A549-Dp71E细胞显著减慢；细胞克隆形成能力较空白对照A549组和空白对照质粒组A549-Dp71E组减弱；划痕实验表明：和A549细胞，A549-Dp71E稳转细胞株相比，A549-Dp71AS细胞株的迁移距离在24小时，48小时明显降低；Transwell侵袭实验结果表明：A549-Dp71AS细胞株细胞侵袭能力较A549组和空白对照质粒组A549-Dp71E组减弱。移植性裸鼠动物模型结果表明，A549-Dp71AS细胞株裸鼠移植瘤不生长。免疫印迹结果显示：A549-Dp71AS细胞中的laminB1,Bcl-2和MMP-2蛋白的表达较A549，A549-Dp71E细胞株明显降低。这为肺癌的治疗提供了新的途径和思路。

附图说明

图1.Dp71-shRNA-1a链测序结果；

图2.Dp71-shRNA-2a链测序结果；

图3.Dp71-shRNA-3a链测序结果；

图4.HBE细胞转染Dp71-shRNA质粒后Dp71蛋白表达；

图5.HBE细胞转染Dp71-shRNA质粒后Dp71蛋白表达统计学分析,*和空白细胞对比，#和空白对照质粒相比，P＜0.05；

图6.A549细胞转染Dp71-shRNA质粒后Dp71蛋白表达；

图7.A549细胞转染Dp71-shRNA质粒后Dp71蛋白表达统计学分析，*和空白细胞对比，#和空白对照质粒相比，P＜0.05；

图8.Western blot检测A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞中Dp71蛋白的表达；

图9.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞中Dp71蛋白表达的统计学分析结果；

图10.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株细胞生长曲线图，*和A549-Dp71E组比，#和空白A549细胞比，p＜0.05；

图11.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株克隆形成图；

图12.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株克隆率统计学分析结果；*和A549-Dp71E组比，#和空白A549细胞比，p＜0.05；

图13.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株Transwell染色图；

图14.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株Transwell侵袭试验统计学分析结果；*和A549-Dp71E组比，#和空白A549细胞比，p＜0.05；

图15.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株24h,48h迁移图谱；

图16.A549-Dp71AS2，A54-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株划痕实验数据统计学分析结果；

图17.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞裸鼠成瘤实验结果；

图18.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株肿瘤生长曲线；

图19.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株肿瘤重量比较；

图20.A549-Dp71AS2，A549-Dp71E稳转细胞株和空白A549细胞株蛋白表达检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

材料和方法：

材料：人肺腺癌细胞株A549购自中南大学细胞分子中心，正常生长培基为1640+10％FBS，细胞呈长梭形，贴壁生长。

质粒表达载体pRNAT-U6.1/Neo,全长6380bp(见序列表中SEQ NO.16),包含绿色荧光蛋白(Geenfluorescentprotein,GFP)做为检识标记,氨苄青霉素(ampicilin,Amp)抗性基因做为原核筛选标志,用来筛选已经成功把shRNA片段克隆入pRNAT-U6.1/Neo质粒，新霉素(neomycin,又被称为G418)抗性基因做为真核筛选标志,用于筛选稳定转染了Dp71shRNA质粒的细胞。克隆酶切位点BamH I和Hind III。保证插入片段的方向正确,防止载体自体连接。此载体购于上海吉凯基因化学技术有限公司。

BALB/C雌性裸鼠30只,4周龄,体重16-18g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲养于中南大学湘雅动物实验中心SPF条件下的超净层流笼中,恒温22℃-25℃,恒湿50％-65％,定期喂水和饲料,饮用水、饲料及实验用品均经高压灭菌消毒处理,供动物自由摄入,实验操作遵守无菌原则。

方法：

1.Dp71干扰位点的选择及寡脱氧核苷酸的设计

在NCBI数据库中查找人Dp71的mRNA完整序列,以此为模板,同时参考siRNA设计原则。根据干扰载体pRNAT-U6.1/Neo启动子启动表达siRNA对序列的要求,利用在线siRNATatgetfinder软件(http://genomics.jp/sidirect/)设计合成3条针对人Dp71序列的siRNA的DNA片段。在线输入Dp71mRNA1序列(NM_004018)分析获得的序列,选择GC含量在40％～55％之间的靶基因序列作为潜在优选,并在GenBank表达序列标签(EsT)数据库中用BLAsT检索,将选定的序列和相应的基因组数据库进行比较,排除和其他编码序列同源的序列,以确定其为特异性序列。

为了提高序列正确退火成为双链DNA分子的效率,将包含能够产生干扰目的基因表达的siRNA序列的DNA按照以下原则设计为a链和b链寡核苷酸序列,在a链和b链序列加入间隔序列CTCGAG,以避免形成终止信号,使其能形成发夹结构,a链模板的5'端添加了GATCCC，b链模板的3’端添加了GG，与BamH I切后形成的粘性末端互补，a链3’端添加了TTTTTGGAT，b链模板的5'端添加了AGCTATCCAAAAA，与Hind III酶切后形成的粘性末端互补。针对Dp71的3个siRNA的a链和b链由上海吉凯基因有限公司合成。作为Dp71的短发夹RNA干扰质粒的对照质粒的shRNA序列(shRNA-Con)的a链和b链由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

2.Dp71siRNA干扰片段合成

将合成的八条Oligo片段先稀释成100μM，两两配对各吸5μL混在一管中，混匀后置于PCR仪中95℃,5min，室温静置20min，形成双链Oligo片段。然后再将双链Oligo DNA片段稀释成10μM，用于插入到pRNAT-U6.1/Neo双酶切产生的载体酶切片段中。

3.shRNA载体的构建

使用BamH I和Hind III对pRNAT-U6.1/Neo载体进行酶切消化，将消化后的产物置于37℃，4h，经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离,胶回收试剂盒回收纯化大片段备用。按Takara公司说明书，将载体与插入子按照一定的比例匹配，设置连接反应，16℃反应过夜。将连接产物转化至感受态的大肠杆菌DH5α菌种中,氨苄青霉素筛选,挑取阳性克隆,摇菌、小提质粒，构建的3个Dp71shRNA真核载体分别命名为Dp71-shRNA1,Dp71-shRNA2,Dp71-shRNA3，无意对照shRNA真核载体被命名Con-shRNA。构建的载体还需后继进行测序，进行验证。

4.shRNA载体的鉴定

抽提质粒后送上海申工公司测序。(所测序列见序列表SEQ NO:12-15)

5.干扰质粒的削减效率的鉴定

将1×10⁵个A549细胞接种至已用0.1％明胶包被过的6孔板中，铺板48小时后转染。细胞转染共分成5组：空白细胞组，转染三个shRNA组和空白对照shRNA组，细胞转染按照LipofectaminTM2000说明书操作，所有细胞均放在37℃，5％CO₂恒温培养箱中进行培养，48小时后收取总蛋白。通过检测Dp71蛋白的表达来确定3个发夹短发夹RNA干扰质粒的削减效率。最终定下2号质粒Dp71-shRNA2为最佳备选质粒。

6.稳定转染Dp71-shRNA2载体的A549细胞株的建立

①细胞准备培养A549细胞至80～90％满瓶，消化收集细胞，以1×10⁵个/mL的细胞密度接种2个6孔细胞培养板，每孔接种2mL细胞悬液，每株细胞接种1孔，37℃、5％CO₂细胞培养箱培养24小时至细胞80％满孔时开始转染。

②质粒转染种板后次日，各取4μg质粒(将空白载体编号为Dp71-E、上述的2号质粒编号为Dp71AS2)分别用0.25mL无血清培养基稀释，充分混匀5min。取20μL(10μL×2)lipo2000转染试剂，用0.5mL(0.25mL×2)无血清培养基稀释，充分混匀5min。6孔板细胞弃完全培养基，用无血清培养基洗涤2次，同时补加0.5mL无血清培养基。分别取0.25mL两种质粒悬液加入转染试剂的2个离心管中，混匀。室温静置20min，并在30min内加入六孔板中。

③细胞筛选A549细胞G418预筛选：培养A549细胞至80～90％满瓶，消化收集细胞，以1×10⁴个/ml的细胞密度接种24孔板中，调整G418浓度为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000g/ml加入24孔中，观察细胞。最终挑选600μg/mL，为G418筛选浓度。稳株筛选：将上述已经转染Dp71-E、Dp71AS2的A549细胞标记为A549-Dp71E、A549-Dp71AS2。转染48h后，加入600μg/mL的G418到六孔板中，观察细胞，每两天换液，7天后A549组细胞基本死亡，调整G418浓度为200μg/mL为维持浓度，继续培养，扩增细胞：10天培养后A549组细胞全部死亡，其他组(即转染了Dp71-E和Dp71AS2的A549细胞组)降低G418浓度至200μg/mL，维持200μg/mL的G418浓度扩增细胞至满瓶。

7.细胞增殖能力检测

①CCK法

分别收集各组对数期A549稳定株细胞，调整细胞悬液浓度；取3块96孔板，每孔加入100μL细胞悬液，铺板使待测细胞为3×10³cell/孔(边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应)，每组设置5个复孔；5％CO₂，37℃培养箱培养，分别于24h，48h，72h后取出一块96孔板检测：检测时每孔加入10μL CCK溶液，细胞培养箱继续培养3h；用酶标仪检测各孔波长450nm的吸光值。

②克隆形成实验

取对数生长期的各组A549细胞(共3组)，用胰酶消化液消化并用1640完全培养基制成单细胞悬液，使单个细胞百分率在95％以上。细胞计数，并用含10％FBS的1640培养基调整细胞浓度至1×10⁴个/ml备用；接种35mm细胞培养皿，200cells/孔，每组细胞重复种3个孔，以确保实验数据的可靠性。补足3ml完全培养基，充分混匀后置于5％CO₂，37℃培养箱培养。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。固定与染色：弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。每孔加2mL 4％多聚甲醛固定细胞15min。去固定液，加1ml GIMSA染色液染色20min，流水缓慢冲洗去除多余染色液，空气干燥。计数克隆：将平板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆数量。结果计算采用如下公式：克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。

8.浸润功能检测(Transwell侵袭实验)

分别消化收集各组A549细胞，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁶cells/ml。吸掉已充分浸润基底层膜后的侵袭小室内的培养基；加500μL的含有10％FBS的培养基至下室(侵袭小室外，24孔板孔内)；加200μL已调节好细胞密度的细胞悬液至侵袭小室内；37℃、5％CO₂细胞培养箱孵育24h；用棉签轻柔擦拭以去除侵袭小室内未侵过基底层膜的细胞，以及基底层(ECMatrix gel)，小心操作以免刺穿底层聚碳酸酯膜；在新的24孔板孔中加500μL染色液，分别将侵袭小室浸入染色20min；将侵袭小室在有水的烧杯中浸没几次冲洗掉多余的染料，然后在空气中干燥；通过显微镜随机取不同视野拍照采集；然后用10％的乙酸溶解膜上的染料，500μL/孔，再转至96孔板中(150μL/孔)，检测570nm波长下各孔OD值。

9.迁移能力检测(划痕实验)

分别消化收集各组A549细胞，用含10％FBS的培养基将各组细胞配成单个细胞悬液，以每孔3×10⁵个细胞接种到6孔板；待细胞铺满孔底，用20μL的tip头垂直板面划痕，用无血清培养基洗涤2次，将脱落下来的细胞洗去；用无血清培养基培养细胞，24h后更换成含3％FBS培养基继续培养；以划痕时间为起点，每隔24h拍摄各组细胞图片。

10.裸鼠移植瘤动物模型制备

①30只裸鼠随机数字表法分为3组:A549细胞组、A549-Dp71AS2细胞组和A549-Dp71E细胞组,每组各10只；

②将处于对数生长期癌细胞培养液丢弃,用无菌中性PBS洗涤细胞2次,用0.25％的胰蛋白酶消化,从培养瓶洗脱下,吹打成单细胞悬液,1000转/min离心smin,收集细胞,用0.9％的生理盐水悬浮细胞,定容,并将细胞密度调至注射的细胞量为2×10⁶个细胞/ml.

③对超净台紫外灯照射30分钟,75％酒精擦拭台面；用75％酒精擦培养笼,其它用具均高压灭菌处理。注射细胞悬液前用75％酒精局部皮肤消毒裸鼠接种处皮肤,每只裸鼠接种0.2ml细胞悬液,用无菌一次性注射器分别接种于裸鼠颈背部或腋下皮下。

④接种后每3天密切观察成瘤情况及肿瘤的生长情况。裸鼠致瘤成功后每5天测量肿瘤体积并记录,绘制各组种植瘤生长曲线。第35日实验结束,以脱颈法处死所有裸鼠,解剖取出肿瘤组织,测量肿瘤最长径和横径,称取肿瘤质量。用公式分别计算肿瘤体积。

计算公式如下:肿瘤体积＝肿瘤长径×肿瘤短径²×0.5。

结果：

1.Dp71-shRNA质粒的鉴定

挑选阳性菌落，抽提质粒，以T7为测序引物，对构建载体进行序列通测，通过测序峰图进行核对分析，证实插入片段为FoxA1shRNA DNA片段，且无碱基突变(图1-图3)，说明shRNA载体构建成功，符合预期设计,能够表达siRNA，预期能对Dp71蛋白的表达予以消减。

2.Dp71-shRNA对A549细胞和HBE细胞中Dp71蛋白表达的抑制作用

Western blotting检测转染sh短发夹RNA干扰质粒后A549细胞和HBE细胞Dp71蛋白表达量的变化，结果发现：在A549细胞和HBE细胞中，收集空白对照组、Dp71d-con组和Dp71shRNA 1、Dp71shRNA 2、Dp71shRNA 3总共5组的标化细胞总蛋白进行检测，在两组细胞中，结果均显示Dp71-shRNA1、Dp71-shRNA 2、Dp71-shRNA3组蛋白表达条带比空白对照组和空白质粒组条带明显减弱(图4，图5)，统计学分析证实这三组质粒在A549细胞和HBE细胞中的干扰效果都具有显著性差异(图6，图7)，在两组细胞中，Dp71-shRNA2的干扰效率都是最佳的，被确定为可用于后继实验的干扰质粒。

3.稳定转染Dp71-shRNA2质粒及对照质粒的A549细胞株的建立与鉴定

按照前述稳转细胞株建立的方法，筛选A549稳转细胞株的最佳G418浓度为600ug/ml，获得稳转细胞株后，维持培养浓度为200ug/ml。最终建立的稳转细胞株被命名为A549-Dp71AS2(转染Dp71-shRNA2号质粒组),A549-Dp71E(空白对照质粒组)。收集A549-Dp71AS2，A549-Dp71E和空白细胞蛋白，进行Western blot检测，将胶片进行扫描，用图像分析软件IPP6.0对图像进行灰度分析(图8)。统计学分析结果表明(图9)，Dp71-shRNA2质粒能够削减90％的蛋白表达，且差异具有统计学意义。

4.A549-Dp71AS2细胞增殖能力减弱

采用基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的细胞计数试剂盒检测三株细胞的增殖能力。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，可以检测被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)，从而间接地反应细胞的增殖。0小时，24小时，48小时与72小时450mM波长处的OD值见表1，曲线分析表明：细胞A549细胞转染质粒Dp71-E后，稳定株细胞生长较A549细胞稍有减慢；A549细胞转染质粒Dp71AS2后，稳定株细胞生长较A549细胞显著减慢(图10)，差异具有统计学意义。

表1 A549各组稳定株细胞CCK8不同时间点数据

5.稳转细胞株A549-Dp71AS2克隆形成能力降低

克隆形成试验是测定细胞增殖能力的有效方法之一，克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。A549细胞转染质粒Dp71-shRNA2后，细胞克隆形成能力较A549组减弱，较对照质粒组A549-DP71E组减弱(图11，表2)。克隆形成的差异具有统计学意义(图12)。

表2.A549各组克隆形成率数据

	A549	A549-DP71E	A549-DP71AS2
				Percentage(％)	47.25％±0.02	46.25％±0.01	31.00％±0.01

6.稳转细胞株A549-Dp71AS2浸润与迁移能力降低

采用划痕试验与transwell侵袭试验检测Dp71的表达改变是否能够影响A549细胞的侵袭能力。Transwell侵袭试验实验结果采用醋酸洗脱液在酶标仪上570nm的OD值来间接代表穿过Transwell小室的细胞数，结果表明：A549细胞在转染了Dp71的短发夹RNA干扰质粒后，其侵袭能力下降，具体表现为570nm波长时吸光值下降了25％(图13，表3)。实验结果表明：稳转细胞株A549-Dp71AS2，细胞侵袭能力较A549组减弱，较对照质粒组A549-DP71E组减弱，且差异具有统计学意义(图14)。

表3A549细胞各组Transwell侵袭实验结果

	A549	A549-DP71E	A549-DP71AS2
				OD	0.442±0.004	0.430±0.006	0.321±0.007

划痕实验(Scratching test)是一种用于检测细胞运动的实验方法，该实验可用于检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。在全部三组细胞细胞铺满孔底后，使用10ul枪头垂直板面划痕，以划痕时间为起点，每隔24h拍摄各组细胞图片，和A549细胞，A549-DP71E稳转细胞株相比，A549-Dp71AS2细胞株的迁移距离在24小时，48小时明显降低(表4，图15)，且差异具有统计学意义(图16)。

表4.A549质粒各组细胞划痕实验迁移距离(mm)

	A549	A549-Dp71E	A549-Dp71AS2
				0h	0.462±0.003	0.460±0.002	0.463±0.003
24h	0.356±0.004	0.358±0.005	0.422±0.007
				48h	0.198±0.008	0.196±0.007	0.297±0.009

7.裸鼠成瘤情况

用一次性注射器将三组细胞中的2×10⁶细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝，直至有肉眼可见的肿瘤出现。30只裸鼠在实验过程中无意外死亡,均存活。3组裸鼠接种细胞后,A549细胞组于接种细胞后第21天左右肉眼均可见局部肿瘤形成,成瘤率达100％；其余A549-Dp71E组接种细胞后第105天左右肉眼均可见局部肿瘤形成,成瘤率达100％；A549-Dp71AS2组没有肿瘤形成(见图17，图18，图19)。

8.A549三株细胞中的laminB1,Bcl-2和MMP2蛋白的表达

为了进一步探讨削减Dp71蛋白表达是如何引起A549细胞生长，增殖，浸润及侵袭能力的改变的，选择了核纤层蛋白laminB1,Bcl-21和MMP2三个蛋白为靶点分子进行检测，结果表明，和A549细胞及A549-DP71E细胞株相比，A549-Dp71AS2细胞株中的laminB1,Bcl-21和MMP2三个蛋白的表达明显降低(图20)，结果表明，削减A549三个细胞株中的Dp71蛋白极有可能是通过降低laminB1,Bcl-21和MMP2三个蛋白的表达来达到改变A549细胞的生物学特性，从而从在体(裸鼠)和体外细胞水平表现出削减其恶性程度的。

结论：

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。通过研究将目的基因沉默后对细胞或个体发育的影响，可以获得目的基因功能的相关信息。本发明构建的短发夹RNA干扰质粒为Short hairpin RNA(shRNA)短发夹RNA，是一种利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理构建的干扰质粒。在本发明中,我们首次根据人类Dp71转录起始的特点,在其mRNA的不同靶位点设计3个RNAi序列，并构建了3个shRNA的表达质粒,将构建成功的3个干扰质粒分别转染培养的A549细胞和HBE细胞后,Western blot结果显示转染Dp71-shRNA 1、Dp71-shRNA 2、Dp71-shRNA 3组的Dp71蛋白表达水平均明显降低，两组细胞都以Dp71-shRNA 2蛋白降低水平最为明显，其抑制表达的效率都超过了50％,有效的沉默了Dp71基因的表达。通过转染，G418筛选，最后构建了A549-Dp71AS2，A549-Dp71E(空白对照)两组稳转细胞株。

在癌症的发生发展过程中，肿瘤细胞通过多级发展获得了如下六个生物学特性：持续性的细胞增殖信号，对生长抑制剂的躲避，抵抗细胞死亡，使细胞无限制复制，诱导血管生成，以及增强细胞的转移与侵袭的能力。通过G418筛选，构建稳转Dp71的短发夹RNA干扰质粒，并进一步研究其生物学功能。结果表明，在A549细胞株中消减Dp71的表达，cck8和克隆形成实验显示A549细胞的增殖能力下降，侵袭能力降低，迁移能力下降。证实抑制Dp71的表达，可以从增殖，迁移与浸润等生物学特性改变A549细胞的生物学特性。

通过使用裸鼠成瘤实验，我们从在体实验方面也证实了，敲除A549细胞中的Dp71蛋白，可以明显削弱A549细胞体外成瘤的能力。

前期过表达实验表明，通过转染Dp71真核表达质粒，增高HBE细胞株中的Dp71蛋白极有可能是通过增高核纤层蛋白lamin B1和抗凋亡蛋白Bcl2的含量来改变HBE细胞的生物学特性的，由于Dp71在A549细胞中的定位与分布和HBE细胞基本一致，所以推测稳定转染了Dp71干扰质粒的细胞株极有可能是通过同时消减核纤层蛋白lamin B1和抗凋亡蛋白Bcl2的含量，从而导致A549细胞的增殖，侵袭和迁移能力下降。Bcl-2有可能通过MMP2蛋白来参与调节乳腺癌癌症细胞MCF的浸润与侵袭能力。通过Western blot来检测lamin B1和Bcl2和MMP2这三个分子靶点在A549-Dp71AS2，A549-Dp71E和A549中的表达，我们已经证实在稳定转染Dp71shRNA质粒的A549细胞株中，lamin B1，Bcl2和MMP2蛋白的表达明显下降。从而从蛋白水平揭示了消减Dp71蛋白降低A549细胞在体与离体恶性的原因。

综上所述，本发明首次发现了Dp71表达量的改变可以导致肺腺癌细胞株A549恶性度降低，并成功构建了短发夹RNA干扰质粒，极有可能可以为肺癌的治疗寻找到新途径和新线索。

Claims

1.一种Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，根据Dp71的序列设计能够产生干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段，插入到短发夹RNA干扰载体中构建而成。

2.根据权利要求1所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，

以人Dp71的mRNA序列为模板，以及载体启动子启动表达siRNA对序列的要求，设计合成能够产生干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段。

3.根据权利要求2所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，siRNA干扰的目标基因Dp71序列如下：

siRNA-1：CTTTAGCTGACCTGAATAA；

siRNA-2：GCACTTTAATTATGACATC；

siRNA-3：CCATGGATATCCTGCAGAT。

4.根据权利要求3所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，siRNA干扰目标基因Dp71序列为siRNA-2：GCACTTTAATTATGACATC。

5.根据权利要求3所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，选用的原始质粒表达载体为pRNAT-U6.1/Neo。

6.根据权利要求5所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，DNA片段插入到载体时的酶切位点为BamH I和Hind III。

7.根据权利要求6所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，

根据Dp71的序列设计能够产生干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段，具体序列如下：

Dp71-shRNA-1a链序列：

5’-GATCCCGTCTTTAGCTGACCTGAATAACTCGAGTTATTCAGGTCAGCTAAAGACTTTTTGGAT-3’

Dp71-shRNA-1b链序列：

5’-AGCTATCCAAAAAGTCTTTAGCTGACCTGAATAACTCGAGTTATTCAGGTCAGCTAAAGAC GG-3’

Dp71-shRNA-2a序列：

5’-GATCCCAAGCACTTTAATTATGACATCCTCGAGGATGTCATAATTAAAGTGCTTTTTTTGGAT-3’

Dp71-shRNA-2b序列：

5’-AGCTATCCAAAAAAAGCACTTTAATTATGACATCCTCGAGGATGTCATAATTAAAGTGCTTGG-3’

Dp71-shRNA-3a序列:

5’-GATCCCGCCCATGGATATCCTGCAGATCTCGAGATCTGCAGGATATCCATGGGCTTTTTGGAT-3’

Dp71-shRNA-3b序列:

5’-AGCTATCCAAAAAGCCCATGGATATCCTGCAGATCTCGAGATCTGCAGGATATCCATGGGC GG-3’。

8.根据权利要求7所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，构建的三个Dp71短发夹干扰质粒载体的序列见SEQ NO:12-14。

9.根据权利要求8所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，构建的优选短发夹干扰质粒载体的序列见SEQ NO:13。

10.权利要求1-9任一项所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒的应用方法，其特征在于，用于制备抑制肺癌的制剂。