CN105385781B

CN105385781B - Lce3e在诊治口腔癌中的应用

Info

Publication number: CN105385781B
Application number: CN201511009921.5A
Authority: CN
Inventors: 宋宏涛; 靳晓霞; 杨承刚
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2019-08-13
Anticipated expiration: 2035-12-29
Also published as: CN105385781A

Abstract

本发明涉及LCE3E在诊治口腔癌中的应用。发明人通过高通量测序平台进行转录组深度测序分析，初步筛选出在口腔鳞状细胞癌组织和正常组织中差异表达明显的基因LCE3E，进一步RT‑PCR实验证实了LCE3E基因在口腔鳞状细胞癌组织高表达，siRNA干扰实验显示干扰LCE3E基因的表达能够有效抑制口腔癌细胞增殖，本发明的口腔癌分子标记具有重要的临床实际应用价值。

Description

LCE3E在诊治口腔癌中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地，涉及LCE3E在诊治口腔癌中的应用，更具体的涉及LCE3E在诊断和治疗口腔鳞状细胞癌诊断中的应用。

背景技术

当今社会，癌症是威肋、人类健康及生命的重要致死因素之一。据最新的《世界癌症报告》统计，2014年全球新增癌症病例1400万，其中中国有307万，占21.8％，癌症死亡人数全球约820万，其中中国有220万，占26.9％，而统计的中国患癌症占全球比例时，食道癌的新增病例与死亡人数均占到全球50％，是危害我国人群身体健康的头号杀手，在食管癌中口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最为常见的类型，预后较差。尤其是晚期口腔鳞状细胞癌患者，因其晚期阶段易淋巴转移及远处转移，且原发灶局部涉及多个重要器官，使肿瘤扩大切除的安全缘受限，即便通过手术、放疗、化疗及生物治疗的综合序列治疗，其5年生存率仍然很低。肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程，口腔鳞状细胞癌亦如此，环境对机体的作用及机体自身的变化导致了口腔黏膜从正常口腔鳞状上皮细胞到过角化、不同程度的异常增生，再到原位癌、侵袭性癌的演变过程。口腔鳞状细胞癌发生发展过程中涉及多种不同基因的改变，然而其确切的发生发展机制还不明确，通过分析筛选出的生物分子标记物的表达与肿瘤的相关性，分析其作为诊断或预后预测标记物的可行性，有望更早的发现肿瘤或指导制定针对患者个体的个性化治疗方案。

发明人通过高通量测序平台选取2例口腔鳞状细胞癌癌组织及3例健康的正常组织的转录组深度测序分析，初步筛选出在口腔鳞状细胞癌组织和正常组织中差异表达明显的基因LCE3E，进一步RT-PCR实验证实了LCE3E基因在口腔鳞状细胞癌组织高表达，干扰LCE3E基因的表达能抑制口腔癌细胞的增殖，本发明的分子标志物具有重要的临床实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种口腔癌诊断制剂，所述口腔癌诊断制剂检测LCE3E基因和/或LCE3E基因的表达产物。

进一步，口腔癌为口腔鳞状细胞癌。

进一步，口腔癌诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测口腔癌组织中LCE3E基因的表达，优选的，荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增LCE3E基因的引物；基因芯片中包括与LCE3E基因的核酸序列杂交的探针，更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测LCE3E基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。

进一步，直接检测组织中LCE3E基因和/或基因的表达产物。

进一步，口腔癌的诊断制剂采用免疫方法检测口腔癌组织中LCE3E基因的表达产物，优选的，免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。

进一步，检测LCE3E表达产物的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采用市售的LCE3E单克隆抗体。进一步，试剂盒包括：包被LCE3E单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。

进一步，检测LCE3E蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，抗体可采用市售的LCE3E单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗LCE3E单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。

本发明的目的在于提供上述口腔癌诊断制剂在制备口腔癌诊断工具中的应用。

本发明的目的在于提供一种治疗口腔癌的制剂，制剂中含有抑制LCE3E基因的转录或表达的试剂或化合物。优选的，制剂中含有药剂学可接受的载体。

进一步，治疗口腔癌的制剂中含有激活LCE3E的抑制基因、激活抑制LCE3E表达的蛋白、导入抑制LCE3E转录或表达的siRNA、激活促进LCE3E mRNA降解的microRNA、导入促进LCE3E蛋白降解的分子、抑制促进LCE3E表达的因子及蛋白的表达。

优选的，治疗口腔癌的制剂含有下列中的一组或几组siRNA：SEQ ID NO.1和SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。更优选的，治疗口腔癌的制剂含有siRNA序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

本发明的目的在于提供上述治疗口腔癌的制剂在制备口腔癌治疗药物或试剂中的应用。

本发明的目的在于提供上述治疗口腔癌的制剂在制备抑制口腔癌细胞增殖制剂中的应用。

为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基因LCE3E基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了LCE3E基因与口腔癌的关系：LCE3E基因在癌组织中高表达，与口腔癌具有很好的相关性，抑制CE3E基因的表达能够抑制癌细胞增殖。

本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。

RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。

荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。

基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。

本发明的目的在于提供一种检测口腔癌的基因检测试剂盒，试剂盒检测基因LCE3E的表达，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ ID NO.10。

进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR反应液。所述内参为ACTIN。

所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。

本发明目的是提供了一种口腔癌蛋白检测试剂盒，检测试剂盒检测LCE3E蛋白情况。进一步的，试剂盒还包括检测所需的其他检测试剂。

本发明目的是提供了一种检测口腔癌的基因芯片，基因芯片包括与LCE3E基因的核酸序列杂交的探针。

本发明的药剂学上可接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。

本发明的药剂学可接受的载体除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。

本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。

本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。

附图说明

图1RT-PCR检测口腔癌组及正常对照组LCE3E基因表达情况

图2转染siRNA后口腔癌细胞LCE3E基因的表达情况

图3干扰LCE3E基因的表达后口腔癌细胞生长曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1

收集口腔癌及正常组织，对其进行分组及编号：3例正常组织块(编号为N1、N2、N3)和2例癌组织块(C1、C2)。

对三组样品进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳。从电泳结果初步认为提取的RNA样品质量合格，可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，结果如表1所示。每个样品体积均为30μl。RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为1.8-2.2。RIN(RNA integrity number)指的是RNA完整性指数,是RNA质量的重要指标。从表1可以看出,本研究的样品均达到转录组测序的要求。

表1 口腔癌RNA样品的分光光度检测

分组	浓度(ng/μl)	OD(260/280)	体积(μl)	总量(μg)	RIN值	质量类型
							癌组织	1274.6	2.01	30	38.2	8.7	类型Ⅰ
正常组织	277.2	1.99	30	8.3	8.7	类型Ⅱ

实施例2高通量转录组测序及分析

测序平台：Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台

转录组测序和匹配：

我们进行分析的癌变组织及正常组织两组样品来自于2例口腔癌患者和3例健康人群。将这两组样品进行高通量cDNA测序。从这两个组织中我们分别得到4.85×10⁷,4.46×10⁷个读段对。我们利用TopHat将读段匹配到UCSC参考人基因组(hg19)，唯一匹配的读段对范围在4.04×10⁷到4.49×10⁷之间，匹配到Ensembl参考基因的读段比例在81％到89％之间。我们测序深度的平均覆盖度大概为人类基因组的130倍(按照Ensembl数据库唯一注释的外显子区域的总长度，约为1.13×10⁸)，另外只有1％的读段定位到rRNA，表明我们的数据库构建合理，较可靠地表现带有ployA尾巴的RNA的表达。

差异表达基因的分析：

为了计算基因的表达从而鉴定出不同样品间的差异表达基因，我们利用Cuffdiff方法估计基因的表达，从而鉴定表达失调的基因。每个基因的标准化的表达水平按照每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目(FPKM)计算。将FPKM设计定为＞1，分别在癌变组织、正常组织，我们检测到14854–15168个表达基因，其中包括大部分注释的人类参考基因。我们进一步分析不同样品之间基因表达的相关性。总体基因表达普遍与Pearson关联系数高度相关。我们检测到癌变与正常组织之间有234个差异表达基因。

差异表达基因的功能富集分析：

为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对表达失调的基因进行GeneOntology的功能富集分析。为了鉴别癌症特异的功能目录，我们利用在线工具DAVID比较癌变组织、正常组织的表达显著变化的基因进行功能富集分析。我们选择了在癌变与正常组织比较中表达失调的基因的显著富集的GO目录，我们将癌变组织与正常组织之间的差异表达基因归类为33个功能目录。

候选基因的选择：从上述RNA-seq测序及深度分析结果中筛选差异表达基因的候选基因(正常组vs癌变组)，排序依据为p-value大小，LCE3E基因进入我们的研究视野。

实施例3癌组织及正常组织LCE3E基因表达情况

一材料和方法

1、材料

口腔癌自于2010年-2014年住院病例，分别取49例口腔癌患病病人的癌组织和23例健康人群正常组织做对照。

2、方法

2.1口腔癌组及正常组总RNA的提取

按康为世纪超纯RNA提取试剂盒(Ultrapure RNA Kit(DNase I)，货号CW0597)说明书提取口腔癌组及正常组的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。

采用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取，主要操作步骤如下：

1.样品处理，30-50mg组织在液氮中充分研磨后加入1ml Buffer RLT，或在组织样品中加入1ml Buffer RLT后匀浆处理。

2.样品中加入Buffer RLT后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

3.以每1ml Buffer RLT加入200μl氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。

4.4℃12,000rpm离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管(自备)中。

5.在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase的水配制)，颠倒混匀。

6.将上步所得溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube 2ml)的吸附柱(Spin Column RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8.配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1U/μl)，混匀，配制成终体积为80μl的反应液。

9.向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15分钟。

10.向吸附柱中加入350μl Buffer RW1,10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

11.向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

12.重复步骤11。

13. 12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

14.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管(Collection Tube 1.5ml)中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

15.总RNA完整性鉴定：取2μl RNA样品在1.5％琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)，分出区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。

16.用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。

2.2 LCE3E检测引物设计与合成

根据PCR引物设计原则，应用Premier 5.0和增强版的OligoArchitect^TM软件进行LCE3E引物设计(XM_011509484.1)。

LCE3E的上、下游引物序列分别为：

上游引物：5'-TTAGAGACGTTGGACTGTAGA-3'；SEQ ID NO.9

下游引物：5'-CTTGGCAGGAGTTGAGATG-3'；SEQ ID NO.10

产物长度为79bp。

内参β-actin上、下游引物序列分别为：

上游引物：5'-TAATCTTCGCCTTAATACT-3'；SEQ ID NO.7

下游引物：5'-CCTTCATACATCTCAAGT-3'；SEQ ID NO.8

产物长度为103bp。

2.3定量标准曲线的建立

标准DNA模板的制备

按照说明书，从口腔癌组织中，利用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取总RNA，接着用康为世纪SuperRT cDNA第一链合成试剂盒(货号CW0741)进行逆转录反应，具体步骤如下：1.将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。

2.配置反应体系，总体积为20μl：终浓度为50pg-5μg的RNA模板、2μl Primer Mix、4μl dNTP Mix、4μl RT Buffer、1μlSuperRT，加RNase-Free Water补平到20μl。

3.涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

4.42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

将逆转录反应得到的cDNA用康为世纪2×Taq MasterMix(货号CW0682)进行常规PCR，反应体系和条件如下：2×Taq MasterMix 25μl、上下游引物各2μl、cDNA0.5μg、补平至50μl。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；最后72℃延伸2min。取样5μL，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化，将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到DH5α感受态细胞中。通过序列为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在10⁸-10²copies/μl)。

2.3敏感性实验

取重组质粒按比例稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²个拷贝/μL，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为10⁸-10²copies/μL，最小检出浓度为100copies/μL。

2.4 qRT-PCR检测LCE3E基因表达量

取上述49例口腔癌组和23例正常组超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取总RNA，进而用UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号CW0660)进行RT-PCR。具体步骤：

1.将RNA模板、引物、2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)、SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。

2.RT-PCR反应体系(25μl)：2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffer(With ROX)12.5μl、上游引物(10μM)0.5μl、下游引物(10μM)0.5μl、SuperEnzyme Mix 0.5μl、加RNA模板(终浓度为10pg–100ng)、RNase-Free Water补平至25μl。

3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。

4.将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应：反转录：45℃10min；95℃5min预变性，接35个循环：95℃10s，55℃30s。

对qRT-PCR反应结果使用SPSS For Windows 11.5软件，相关数据采用χ2检验和Fisher确切概率法进行处理，P＜0.05有统计学意义；qRT-PCR反应利用MedCalc统计分析软件来计算。

根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较LCE3E基因在口腔癌组和正常组中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中LCE3E在癌组织中的表达水平明显高于正常组织中的表达，其中癌组织约为正常组织的5.5倍(具体见图1)，以上结果验证高通量分析结果中LCE3E在口腔癌组织中高表达。

实施例4细胞的培养

口腔鳞状癌细胞癌细胞株Tca8113细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，采用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，于含5％C0₂的37℃饱和湿度培养箱中培养。

细胞复苏：

首先将恒温水浴箱预热至37℃，细胞培养超净工作台台面用75％乙醇擦洗，然后紫外灯消毒30min。细胞复苏的原则是快速融化，这样可以保证细胞外结晶在很短时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。从液氮罐中取出冻存管，插入浮板并迅速置入37℃水浴箱中，不停摇动尽快使管中液体融化。一般约1min内融化，用乙醇消毒冻存管外壁及双手，在超净工作台内用吸管吸出细胞悬液，注入15ml离心管内并滴加10倍体积的新鲜培养液，吹打均匀后，800rpm离心5min，除去上清，再重复用新鲜培养液洗一次。用新鲜培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入5％CO₂的37℃饱和湿度培养箱中静置培养，第二天观察贴壁生长情况及细胞形态，更换培养液或传代。

细胞传代：

细胞传代待细胞生长至培养瓶底部80％-90％密度时，在超净工作台中将原来的培养液吸除，用PBS缓冲液轻缓漂洗细胞1-2次，尽量洗去残余血清，弃PBS平衡盐溶液。加入0.5-1ml0.02％EDTA+0.25％胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中，瓶口盖好，于室温或37℃条件下消化0.5-3min。倒置显微镜下观察消化细胞，随着时间的推移，原贴壁的细胞边黑，逐渐趋于圆形，细胞之间间隙增大不再连接成片，表示此时消化适度。在细胞还未飘起时立即加入适量含血清的新鲜培养液终止消化反应，并用吸管吸取培养瓶内培养液反复吹打培养瓶底壁，使已消化的细胞脱离培养瓶底壁。吹打过程须按一定顺序操作，即要从一边开始到另一边结束，尤其是培养瓶底壁四周的边缘地带，确保培养瓶底壁各处的细胞均被吹打脱落。吹打时动作要轻柔不要用力过猛，同时尽可能不要出现气泡，这些都对细胞有损伤。收集经吹打后得到的细胞悬液至15ml离心管内，800rpm离心5min，除去上清，立即加入含血清的新鲜培养液，轻缓吹打形成细胞悬液。按1:2或1:3分配传代培养，加入适量培养液后旋紧培养瓶盖，并在培养瓶侧面做好标记，置5％CO₂的37℃饱和湿度培养箱中继续培养。24-48h更换培养液，一般3-4天形成细胞单层即可传代，若不马上传代可更换培养液以供实验用。

细胞计数：

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示，其原理和方法与血细胞技术相同。首先将待测细胞制成均匀的细胞悬液，血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让细胞悬液流入旁边槽中。显微镜下观察，计算计数板4个大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的，然后按下式计算：(细胞悬液的细胞数)个/ml＝(4个大格子细胞数/4)×10⁴个/ml式中：除以4是因为计数了4个大格子的细胞数；乘以10⁴是因为计数板中每一个大格子的体积为：1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)＝0.1mm³，而1m1＝1000mm³。

细胞活力：

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。最常用的方法为台盼蓝排斥试验，细胞损伤或死亡时，台盼蓝能穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，即死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞和活细胞。配制0.4％台盼蓝溶液(台盼蓝0.4g加ddH₂0至100ml,4℃保存)，制备待测的细胞的单个细胞悬液，并作适当稀释(10⁶/ml)，用吸管取9滴细胞悬液移入小试管中，加一滴0.4％台盼蓝溶液，混匀，在3min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，注意时间不宜过长，否则，部分活细胞也会着色，从而干扰计数。显微镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，根据下式求细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100。

实施例5RNAi干扰LCE3E基因表达对口腔癌细胞的影响

一材料和方法

1、材料

口腔鳞状癌细胞癌细胞株Tca8113细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，脂质体(Lipofectamine^TM2000)购自Invitrogen公司,Opti-MEM低血清培养基购自美国Hyclone公司。

2、方法

2.1 siRNA设计与合成

siRNA设计与合成依据在线设计软件，根据基因序列，设计相应的siRNA，具体序列见表2。设计后送往合成公司合成，由公司提供siRNA阴性对照。

表2 siRNA序列表

2.2转染

细胞分组：

A组：对照组(仅转染脂质体)；B组：阴性对照组(转染非特异性siRNA)；S1组：转染特异性的LCE3E-siRNA1，S2组：转染特异性的LCE3E-siRNA2，S3组：转染特异性的LCE3E-siRNA3。

细胞转染：

1)转染前一天，在不包含抗生素的含10％小牛血清的DMEM培养基中接种适量的Tca8113细胞，转染前更换成无血清培养基，转染时细胞的汇合度要达到30-50％；

2)每一个转染样品都要按照如下的方法准备寡聚物Lipofectamine^TM 2000复合物：

a.用适量的Opti-MEM低血清培养基稀释siRNA寡聚物，轻轻混匀，室温静置5分钟；

b.用适量的Opti-MEM低血清培养基稀释Lipofectamine^TM 2000，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟；

c.孵育5分钟后，混合稀释的siRNA寡聚物和稀释的Lipofectamine^TM 2000，在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。

3)将寡聚物-Lipofectamine^TM 2000复合物加入到每一个孔中，轻轻地前后摇动培养板混匀；

4)放入5％CO₂,37℃培养箱中孵育，在转染后4-6小时换成含10％小牛血清的DMEM培养基；

5)转染后24-72小时，在荧光显微镜下观察细胞转染数量，检测转染效率，并用于实验分析。

2.3应用Real-time PCR方法检测转染前后LCE3E基因表达的变化

(1)标准曲线的构建：选取在50mI培养瓶中正常培养的细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于10⁴-10⁰copies/ul的DNA模板，分别加入LCE3E基因引物和内参引物，配制25u1反应体系，使用Real-timePCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到LCE3E和内参的标准曲线。

(2)Real-time PCR方法检测转染前后LCE3E基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进LCE3E和内参的Real-timePCR反应，实验重复三次。

(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

2.4 MTT法测定细胞增殖

(1)96孔板中接种细胞，每个时间点每组细胞各设3个复孔，每孔接种细胞量为1.5×10³个，培养液用量为每孔200μl,37℃,5％CO₂培养箱中孵育；

(2)培养细胞到达设计时间点时，在待测孔中，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml),混匀后37℃，5％C0₂培养箱中再孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，在96孔板水平振荡仪上温和缓慢振荡10min；

(3)待96孔培养板内溶液降至室温后，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定样本吸光度OD₄₉₀mm；

(4)连续测量5d，绘制细胞增殖的生长曲线。

二实验结果

分别观察各组siRNA转染细胞，结果显示在大量Tca8113细胞内发现绿色荧光，证明细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察细胞数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到80％以上。

Real-time PCR结果显示，转染脂质体的对照组和转让非特异性的siRNA的阴性对照组对Tca8113细胞中LCE3E基因表达无明显抑制作用，二者无统计学差异，转染3个LCE3E基因siRNA组都对细胞中LCE3E基因表达起到一定抑制作用，其中LCE3E-siRNA1抑制率达40％，具体见图2。

用MTT法检测Tca8113细胞增殖情况，经过连续5天的检测，与阴性对照组相比转染LCE3E-siRNA1组的细胞生长受到一定抑制，二者具有差异(具体见图3)，即抑制LCE3E基因的表达能够有效抑制口腔癌细胞增殖。

Claims

1.检测LCE3E基因和/或基因的表达产物的试剂在制备口腔癌诊断制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述口腔癌诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测口腔癌组织中LCE3E基因的表达。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩增LCE3E基因的引物；基因芯片中包括与LCE3E基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测LCE3E基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9，下游引物序列为SEQ IDNO.10。

5.抑制LCE3E基因的转录或表达的试剂在制备口腔癌治疗制剂中的应用，其特征在于，抑制LCE3E基因的转录或表达的试剂为抑制LCE3E基因的转录或表达的siRNA, siRNA的序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。