CN107385081A

CN107385081A - 一种与肾癌相关的基因及其应用

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Publication number: CN107385081A
Application number: CN201710774433.6A
Authority: CN
Inventors: 马翠; 任静
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2037-08-31
Also published as: CN107385081B

Abstract

本发明公开了一种与肾癌相关的基因及其应用，所述基因为ATP8B3，ATP8B3基因及其编码的蛋白在肾癌患者中表达上调，通过检测ATP8B3的表达水平可以判断患者是否患有肾癌；通过下调ATP8B3的表达可以抑制癌细胞的增殖以及迁移，从而为肾癌的治疗提供了新的靶标。

Description

一种与肾癌相关的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种与肾癌相关的基因及其应用，具体的所述基因为ATP8B3。

背景技术

肾细胞癌是在肾实质中泌尿小管上皮系统来源的恶性肿瘤，简称肾癌。肾癌在肾脏所有恶性肿瘤中占90％左右。流行病学调查显示肾癌患病率有逐年上升的趋势，在泌尿系统肿瘤中居第二位，其中男性高于女性，好发年龄在50-70岁。根据肾癌病理组织学分类，可分为肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)，肾乳头状腺癌、肾嫌色细胞癌及肾梭形细胞癌等，其中RCCC占肾癌的60％～85％，是肾癌中最常见的恶性肿瘤。目前在临床上，肾癌的检查主要通过彩超、螺旋CT及核磁共振。在治疗上，转移性肾癌对放化疗不敏感，外科手术只能作为转移性肾癌的辅助治疗，免疫治疗有效率较低，即使是分子靶向治疗(如阿西替尼、索拉菲尼和坦西莫司等)有效率也仅为10％-40％，况且远期疗效不佳。因此，探求RCCC的发病机制并找到新的早期诊断和治疗途径刻不容缓。

在分子学中，随着对转录组测序的不断深入，探寻与疾病相关的基因已成为当前抗肿瘤靶点研究的有效途径。相关基因标志物的发现不仅有助于肾癌患者的预后评估，同时也有助于临床上对肾癌的诊断、术后局部复发或远处转移的预测、也有望成为分子靶向药物研发的靶点，应用于临床。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与肾癌发生发展相关的基因，通过检测样本中该基因的表达水平，可以判断患者是否患有肾癌或者患肾癌的风险的大小，通过靶向于该基因，改变该基因的表达水平或活性，可以实现肾癌患者的精准靶向治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测ATP8B3表达水平的试剂在制备诊断肾癌的产品中的应用。

进一步，所述试剂包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原味杂家或芯片技术检测ATP8B3表达水平用试剂。

进一步，所述试剂包括针对ATP8B3基因的引物和/或探针，或针对ATP8B3蛋白的抗体和/或配体。

本发明提供了一种诊断肾癌的产品，所述产品包括样本中检测ATP8B3表达水平的芯片、制剂或试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括至少一对特异性扩增ATP8B3基因的引物；优选的，所述引物具有SEQ ID NO.1～2所示的序列。

本发明提供了ATP8B3在筛选预防或治疗肾癌的候选化合物中的应用。

进一步，筛选候选化合物的步骤如下：

用候选物质处理表达或含有ATP8B3基因或其编码的蛋白的体系；和

检测所述体系中ATP8B3基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低ATP8B3基因或其编码的蛋白的表达或活性优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是预防或治疗肾癌的候选化合物。

在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。所述候选化合物包括(但不限于)：针对ATP8B3基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物。

在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选化合物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选化合物中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗肾癌有用的物质。

本发明提供了ATP8B3功能性表达的抑制剂在制备预防或治疗肾癌的药物组合物中的应用。所述ATP8B3功能性表达的抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。其中核酸抑制物选自：以ATP8B3或其转录本为靶序列、且能够抑制ATP8B3基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。蛋白结合分子选自：与ATP8B3蛋白特异性结合的物质，如能够抑制ATP8B3蛋白活性的抗体或配体。

进一步，所述抑制剂为siRNA；优选的，所述siRNA序列如SEQ ID NO.9～10所示。在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肾癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA(在本发明中，最佳siRNA序列如SEQ ID NO.9～10所示)。

本发明中的核酸抑制剂如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明提供了一种治疗肾癌的药物组合物，所述药物组合物包括ATP8B3功能性表达的抑制剂，和/或与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

所述ATP8B3功能性表达的抑制剂是指任何可降低ATP8B3蛋白的活性、降低ATP8B3基因或蛋白的稳定性、下调ATP8B3蛋白的表达、减少ATP8B3蛋白有效作用时间、或抑制ATP8B3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调ATP8B3有用的物质，从而可用于预防或治疗肾癌。例如所述的抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。

进一步，所述抑制剂为siRNA；优选的所述siRNA具有如SEQ ID NO.9～10所示的序列。

所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂。

附图说明

图1是利用QPCR检测ATP8B3基因在肾癌组织中的表达情况图；

图2是利用western blot检测ATP8B3蛋白在肾癌组织中的表达情况图；

图3是检测ATP8B3在细胞中的表达情况图；其中图A是利用QPCR检测ATP8B3mRNA在肾癌细胞中的表达情况图；图B是利用Western blot检测ATP8B3蛋白在肾癌细胞中的表达情况图；

图4是检测siRNA对肾癌细胞中ATP8B3表达的干扰效果图；其中图A是检测siRNA对细胞中ATP8B3mRNA的干扰效果图；图B是检测siRNA对细胞中ATP8B3蛋白的干扰效果图；

图5是用MTT法检测ATP8B3基因对肾癌细胞增殖的影响图；

图6是检测ATP8B3对肾癌细胞凋亡的影响图；

图7是利用细胞划痕实验检测ATP8B3对肾癌细胞迁移的影响图；

图8是利用Transwell小室检测ATP8B3对肾癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测肾癌标本中基因在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的基因，探讨其与肾癌的发生之间的关系，从而为肾癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肾癌中ATP8B3显著性上调。实验证明，通过降低ATP8B3的表达水平，能够有效地抑制肾癌细胞的生长、凋亡和侵袭，提示检测ATP8B3基因的表达水平可成为肾癌早期诊断的辅助诊断指标之一，干扰ATP8B3基因表达可成为预防或治疗肾癌或肾癌转移的新途径。

ATP8B3基因

ATP8B3是位于人19号染色体短臂1区3带上，本发明中的ATP8B3包括野生型、突变型或其片段。一种代表性的ATP8B3基因序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中ATP8B3基因(NC_000019.10)所示；本发明的人ATP8B3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本发明的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、基因芯片技术、免疫检测技术。本领域技术人员应该理解，所有的检测技术都可作为本发明的辅助手段以实现本发明的技术方案。

芯片、试剂盒

在本发明中，“芯片”、“微阵列”、“阵列”可以等同替代，包括但不限于：DNA微阵列(例如，cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)、蛋白质微阵列、组织微阵列、转染或细胞微阵列、化学化合物微阵列和抗体微阵列。通常称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片的DNA微阵列是微观DNA点的集合，这些点连接到固体表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)上，形成用于对数千种基因同时进行表达谱分析或表达水平监测的阵列。固定的DNA片段称为探针，其数千个可用于单个DNA微阵列中。微阵列可用于通过比较疾病和正常细胞中的基因表达而识别疾病基因或转录本(例如，ncRNA)。微阵列可使用多种技术加以制造，包括但不限于：用细尖针印刷到载玻片上、使用预制的掩模进行光刻、使用动态微镜器件进行光刻、喷墨印刷或微电极阵列上的电化学方法。

本发明中的试剂盒可用于检测ATP8B3的表达，优选的，所述的试剂盒包括检测有效量的检测ATP8B3基因的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测ATP8B3：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。

抑制剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种ATP8B3的抑制剂的用途，用于制备抑制肾癌的药物组合物。如本文所用，所述的ATP8B3的抑制剂包括但不限于抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。

所述的ATP8B3基因或蛋白的抑制剂是指任何可降低ATP8B3蛋白的活性、降低ATP8B3基因或蛋白的稳定性、下调ATP8B3蛋白的表达、减少ATP8B3蛋白有效作用时间、或抑制ATP8B3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明。

作为本发明的一种选择方式，所述的ATP8B3的抑制剂是一种特异性与SPOCD结合的抗体。所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体；本发明不仅包括完整的抗体分子，也包括抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与ATP8B3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体

作为本发明的一种优选方式，所述ATP8B3的抑制剂是一种ATP8B3特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肾癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，它们分别具有SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞试验而言抑制效率非常高。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

作为本发明的一种可选方式，所述的ATP8B3的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的ATP8B3的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肾癌。任何前述的ATP8B3的抑制剂均可用于组合物的制备。所述载体包括(但不限于)稀释剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的ATP8B3基因的抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。

本发明的药物组合物还可以与其他治疗肾癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将ATP8B3的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带ATP8B3的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的ATP8B3抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。意欲包括任何源自活或死亡的人的组织或材料，其可包括本发明的标志物。在本发明的具体实施例中，样品可以是肿瘤或肺肿瘤组织，并且可包括例如含有来自其的与肾组织相关的细胞或标志物的任何组织或材料。

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，配对样本采用t检验，多样本采用均数的方差检验(ANOVA)进行分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肾癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集6例肾透明细胞癌组织及相对应的癌旁组织，所有患者术前均未行放化疗，术后行病理切片检查明确诊断。组织样本的取得获得患者的知情同意，并且取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

1)加入液氮研磨组织至粉末，加入1ml TRIzol(Invitrogen)溶液，吹打混匀，使组织充分裂解，静置5min；

2)12000rpm 4℃离心5min，将上清液转移至1.5ml RNase free EP管中；

3)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；

4)4℃环境中12000g离心15min，溶液离心为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；

5)加入0.5ml异丙醇，轻柔充分混匀，室温静置10min；

6)4℃下，12000g离心10min，加入与RNAiso Plus等体积的75％乙醇沉淀RNA，7500g 4℃离心5min，去上清；

7)用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入30μl DEPC水溶解沉淀。

8)RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

4、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

5、上机测序

使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

6、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.001，|log2(Fold_change)normalized|>1时，认为mRNA显著差异表达。

7、结果

RNA-seq结果显示，ATP8B3在肾癌组织中的表达量显著高于正常癌旁组织中的表达量。

实施例2 QPCR测序验证ATP8B3基因的差异表达

1、对ATP8B3基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肾癌患者癌旁组织和肾癌组织各50例。

2、RNA提取具体步骤如实施例1所述。

3、逆转录：采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录。具体步骤如下：

(1)加入5×gDNA Buffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min；

(2)构建20μl反应体系，10×Fast RT Buffer 2.0μL，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl混合后加入(1)中的混合液中混匀；

(3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。

4、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genebank中ATP8B3基因和管家基因GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德公司合成。其中，ATP8B3基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示；GAPDH基因的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。

(2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各0.6μl，2×SuperReal PreMix Plus10μl，DNA模板2μl，ddH₂O 7.4μl，50×ROX Reference Dye^△2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。

(3)PCR反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

结果如图1所示，与肾癌癌旁组织相比，ATP8B3在肾癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致。

实施例3蛋白免疫印记实验检测ATP8B3蛋白的差异表达

1、组织总蛋白的提取

用剪刀剪碎组织后将其放入置于冰内的玻璃匀浆器内，RIPA裂解液和PMSF以100:1的比例混匀，按照每20mg组织标本加入100μl裂解液的比例加入相应量的RIPA裂解液，玻璃匀浆器碾碎组织直至其充分裂解，将裂解后的液体吸至EP管中，4℃下14000rpm离心5min，收集上清。

2、总蛋白浓度测定

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

3、SDS-PAGE电泳

按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的说明书配制8％的分离胶和5％的浓缩胶并进行电泳。

4、western检测

1)电转移

将PVDF膜放入甲醇溶液中激活5min，放入转膜缓冲液中平衡20min。取出PAGE胶放入转膜缓冲液中，切下相应的PAGE胶，按照由下到上依次为滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸的顺序放到半干的转膜仪中，恒压25V转膜1.5h；

2)免疫杂交

取出PVDF膜，PBS冲洗后置于5％BSA溶液中室温下摇动封闭2h，将PVDF膜放入杂交袋中，加入一抗过夜，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，再加入相应的二抗，室温下孵育2h，TBST缓冲液洗涤。

3)DAB显色

PVDF膜稍干后滴加新鲜配制的DAB显色液，PVDF膜显色后扫描记录。以GAPDH作为内参照，采用Quantity One凝胶成像分析系统对条带进行半定量灰度分析，实验重复3次，结果取平均灰度值；

5、结果

结果如图2所示，ATP8B3蛋白在肾癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。

实施例4 ATP8B3基因在人肾透明细胞癌细胞中的差异表达

1、细胞培养

人肾透明细胞癌细胞株RLC-310、786-0、Caki-2、人胚肾细胞HEK293T，以含10％胎牛血清和1％P/S的DMEM培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，细胞生长良好，呈单层贴壁生长。使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、ATP8B3基因mRNA的检测

2.1 RNA的提取

取处于对数生长期细胞，根据细胞数量加入相应量的Trizol裂解细胞，吹打混匀并转移到无RNA酶的离心管中，充分匀浆，后续步骤同对组织标本的操作，提取细胞总RNA。

2.2逆转录及QPCR扩增

具体步骤同实施例2

3、ATP8B3蛋白的检测

3.1细胞蛋白的提取

收集处于对数期的不同处理组的细胞，用预冷的PBS洗涤细胞。将RIPA细胞裂解液和PMSF以100:1的比例混匀，向细胞中加入上述裂解液150μl，冰上放置30min，使用细胞刮刀将裂解的细胞刮下来，使用移液器将裂解后的液体吸至EP管中，4℃下14000rpm离心5min。小心收集离心后的上清。

3.2总蛋白浓度测定

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

3.3 SDS-PAGE及Western检测

具体步骤同实施例3

4、结果

结果如图3所示，ATP8B3基因在肾透明细胞癌细胞中的mRNA及蛋白表达水平显著高于HEK293T细胞，在RLC-310细胞系中表达水平最高。

实施例5 ATP8B3基因的沉默

1、细胞培养步骤同实施例4

2、转染

1)转染前细胞的处理

转染前一天，6孔培养板上种3～5×10⁵个细胞/孔，在无抗生素培养基中培养一天，转染时细胞密度为30～50％，于转染前换成无血清培养基。

2)siRNA的设计

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)的序列如SEQ ID NO.5～6所示，siRNA1序列如SEQID NO.7～8所示；siRNA2序列如SEQ ID NO.9～10所示；siRNA3序列如SEQ ID NO.11～12所示。

将实验分为三组：对照组(RLC-310)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，其中阴性对照组siRNA与ATP8B3基因的序列无同源性。

3)转染

a.取浓度为50pmol的siRNA 3μl加入47μl的无血清培养基，轻轻混匀，室温孵育5min；

b.取1μl Lipofectamine 2000加入49μl无血清培养基。轻轻混匀，室温孵育5min；

c.将上述两种混合物混合(总体积100μl)，轻轻混匀，室温下孵育25min，以使复合体形成；

d.在6孔板中每孔加入100μl的复合物及适量培养基，轻轻混匀；

e.孵育48～96h后观察基因的沉默效应。

5、QPCR检测ATP8B3基因的转录水平

5.1细胞总RNA的提取

采用Qiagen的细胞RNA提取试剂盒对细胞中的RNA进行提取，实验操作按照说明书进行。

5.2逆转录步骤同实施例2。

5.3 QPCR扩增步骤同实施例2。

6、Western blot检测ATP8B3蛋白的表达水平

具体步骤同实施例4

7、结果

结果如图4所示，与非转染组与转染siRNA-NC组相比，实验组siRNA2的干扰效果最好，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例6 ATP8B3基因对肾透明细胞癌细胞增殖的影响

采用MTT实验检测ATP8B3基因对肾透明细胞癌细胞增殖能力影响。

1、取生长状况良好的细胞，常规消化成单细胞悬液后，计数细胞，将细胞稀释成合适浓度的细胞悬液；

2、于96孔培养板中，将稀释后的不同处理组细胞每孔接种2000细胞，至少设3个平行孔，37℃、5％CO₂培养24h；

3、于接种后1、2、3、4、5天每天取出3孔细胞以MTT法检测其570nm的OD值，进行计数，计算平均值；

4、检测前弃去上清液，培养液洗3次，每孔加入MTT无血清培养基溶液(0.2mg/ml)100μl，37℃培养箱中继续培养4h；

5、终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μl DMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上用波长为570nm测定光密度(OD)值，以时间为横轴，光密度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

6、结果

结果如图5所示，与对照相比，实验组在转染siRNA2后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例7 ATP8B3基因对肾透明细胞癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测ATP8B3基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例3。

2、细胞转染步骤同实施例3。

3、步骤

1)将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化后吹打成细胞悬液并计数；取10⁶量的细胞悬液，1000rpm离心5min；

2)弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；

3)加入5μl的Annexin V-FITC，轻柔混匀，室温下避光孵育10min；

4)1000rpm离心5min，弃上清，加入190μl的Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；

5)加入10μl碘化丙啶(PI)染色液，轻柔混匀，冰浴避光放置，进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况，所有实验均重复3次，结果取平均值。

4、结果：

结果如图6所示，实验组与对照组相比，细胞的凋亡率增加(P<0.05)，说明ATP8B3影响肾癌细胞的表达。

实施例8细胞划痕实验

1、向6孔板中每孔加入1ml 50μg/ml的纤连蛋白，并置于4℃冰箱中过夜；

2、弃去剩余的纤连蛋白溶液，用无血清培养基清洗，将处于对数生长期的不同处理组细胞经胰酶消化重悬后，接种于铺有纤连蛋白的6孔板中，每组细胞设2个复孔，每孔5×10⁵个细胞；

3、置入37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜；

4、待细胞长至约90％融合时，用10μl的Tip头划出一条无细胞的细痕，PBS溶液洗去脱落的细胞，加入无血清培养基继续培养；

5、分别于划痕后0h、48h观察细胞划痕处的愈合情况并拍照。实验重复3次，结果取平均值。

6、结果

结果如图7所示，转染siRNA2组的细胞相比对照组而言，细胞体外划痕后愈合率明显降低，而对照组之间无显著差异，说明ATP8B3影响肾癌细胞的迁移。

实施例9细胞侵袭实验

1、Transwell小室制备

将50mg/L的Matrigel胶用4℃预冷的无血清培养基以1:8的比例稀释、混匀，包被Transwell小室的底部膜的上室面，4℃风干。取60μl～80μl稀释的Matrigel胶(3.9μg/μl)置于孔径为8μm的Transwell上室的聚碳酸脂膜上，使膜上的所有的微孔均被Matrigel覆盖，置于37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

2、配置细胞悬液

将处于对数生长期的不同处理组的细胞经胰酶消化，无血清培养基重悬后，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml。

3、细胞接种

在Transwell上室加入2ml的细胞悬液，下室加入1ml的含10％胎牛血清的完全培养基，放置于配套的6孔板上，37℃、5％CO₂条件下培养20-24h；取出Transwell小室，棉签擦尽上室面的Matrigel胶和未穿透膜的细胞。

4、染色

细胞培养结束后，取出Transwell小室，棉签擦尽上室面的Matrigel胶和未穿透膜的细胞，下室面用95％酒精固定15min后，苏木素染色2min，倒置显微镜下随机取5个高倍镜视野观察、计数并拍照。计数小室下室面的细胞数即为穿透Matrigel胶的细胞数，取平均数作为实验结果，并以该细胞数代表肿瘤细胞的侵袭力，实验重复3次，每组细胞设3个复孔。

5、结果

结果如图8所示，与对照组相比，实验组的细胞穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数明显减少，而对照组之间无明显差异，结果说明ATP8B3影响肾癌细胞的侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 一种与肾癌相关的基因及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acacagacac ctgctatg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcttgccaca gttcttca 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ucaucuugga gaucuucucu c 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagaagaucu ccaagaugag g 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ugauguugcu cuucuugaga c 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cucaagaaga gcaacaucaa a 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agaaugagca uauucucuga c 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagagaauau gcucauucug g 21

Claims

1.检测ATP8B3表达水平的试剂在制备诊断肾癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片技术检测ATP8B3表达水平用试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括针对ATP8B3基因的引物和/或探针，或针对ATP8B3蛋白的抗体和/或配体。

4.一种诊断肾癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中ATP8B3表达水平的芯片、制剂或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括至少一对特异性扩增ATP8B3基因的引物；优选的，所述引物具有SEQ ID NO.1～2所示的序列。

6.ATP8B3在筛选预防或治疗肾癌的候选化合物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，筛选候选化合物的步骤如下：

检测所述体系中ATP8B3基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低ATP8B3基因或其编码的蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗肾癌的候选化合物。

8.ATP8B3功能性表达的抑制剂在制备预防或治疗肾癌的药物组合物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为siRNA；优选的，所述siRNA序列如SEQ ID NO.9～10所示。

10.一种治疗肾癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括ATP8B3功能性表达的抑制剂，和/或与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料，优选的所述抑制剂为siRNA；更为优选的，所述siRNA具有如SEQ ID NO.9～10所示的序列。