CN105200156B

CN105200156B - 长链非编码rna基因loc553103的应用

Info

Publication number: CN105200156B
Application number: CN201510727895.3A
Authority: CN
Inventors: 李桂源; 曾朝阳; 熊炜; 石磊; 李夏雨; 李小玲; 张文玲; 龚朝建; 何宝玉; 孛昊; 周鸣; 唐珂
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: CN105200156A

Abstract

本发明公开了一个长链非编码RNA基因LOC553103的应用。基因LOC553103用于制备监测胃癌复发转移和预后预测的制剂；胃癌组织中基因LOC553103的表达水平与胃癌的复发和转移呈正相关关系；该基因在NCBI中的序列号：NR_110997。LOC553103表达高的患者生存时间更短，提示LOC553103可作为胃癌复发和转移的预测分子标志。本发明为胃癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

长链非编码RNA基因LOC553103的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及利用长链非编码RNA基因LOC553103制备监测胃癌复发转移和预后预测制剂的方法。

背景技术

EB病毒(Epstein Barr virus,EBV)是一种普遍存在的人类疱疹病毒，可以感染全球95％左右的成人人口，除偶尔有一小部分人会引起传染性的单核细胞增多症外，大部分被感染者不会出现任何的临床症状，绝大多数情况下EBV可以在宿主体内长期潜伏感染。然而，在某些情况下潜伏感染的EBV会导致恶性肿瘤的发生，包括B细胞来源的伯基特和何杰金氏淋巴瘤，以及上皮细胞来源鼻咽癌和胃癌等。EBV导致恶性肿瘤发生的机制目前尚未完全明了，可能与EBV本身编码一系列基因的表达有关，如EBV编码的潜伏膜蛋白1(LatentMembrane Protein1，LMP1)作为一种致瘤蛋白，能激活许多宿主细胞内癌基因的表达，抑制抑瘤基因的结构和功能。

EBV作为双链DNA病毒其基因组大小约为170kb，除了可转录一系列蛋白编码基因外，最近还发现EBV也可编码一类微小RNA(microRNA，miRNA)分子。miRNA是一种长约20～25nt的调控型非编码RNA，与mRNA不同，miRNA不是DNA和蛋白质之间的“桥梁”，而是通过与目的基因靶向结合，调控基因的表达水平。EBV是第一个被发现可编码miRNA的病毒，进入宿主后EBV即开始表达产生miRNA，发挥生物学作用。目前已发现EBV可编码25个miRNAs前体，加工成44个成熟的miRNAs，且EBV编码的miRNAs在EBV基因组上成簇分布，可以分为BART和BHRF1两组。EBV编码的miRNAs可能通过调控EBV本身编码的基因或者宿主细胞内的基因，从而参与了EBV介导的肿瘤恶性转化，影响包括鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤等在内的多种肿瘤的发生发展。然而目前对于EBV编码miRNAs的研究还不是很透彻，44个成熟的EBV miRNAs中大部分还没有功能研究的报道，比如有关EBV编码的miRNA BART6-3p的作用及机制的研究就很少。迄今为止有关BART6-3p在鼻咽癌、胃癌等实体瘤发生发展中的作用的关系及其在实体瘤病人的早期筛查、辅助诊断或者疗效预测等方面均没有文献报道。

我们通过研究表明，BART6-3p在鼻咽癌和胃癌组织中的表达均显著升高，但是非常有意思的是在鼻咽癌和胃癌组织中BART6-3p的表达水平与鼻咽癌和胃癌患者的复发转移呈负相关关系，低表达BART6-3p的患者比高表达BART6-3p的患者更容易发生复发和转移，预后更差。这表明尽管EBV是比较明确的致瘤性病毒，但并非EBV编码的基因全部都具有促进肿瘤发生发展的作用，部分基因，包括BART6-3p可能具有抑瘤功能，这也表明EBVmiRNAs的表达水平与肿瘤复发、转移预后等临床表型的关系不能推测，只能通过具体而细致的实验研究才能确定。因此，针对BART6-3p设计专用原位杂交探针及检测试剂盒，或者利用BART6-3p特异性引物进行实时荧光定量PCR等技术检测鼻咽癌和胃癌组织中BART6-3p的表达水平有望为临床上对肿瘤进行复发和转移的预测提供参考。

我们在鼻咽癌及胃癌细胞中转染人工合成的BART6-3p，证实在EBV阴性的鼻咽癌和胃癌细胞中表达BART6-3p可以明显抑制肿瘤细胞的生长增殖以及侵袭转移能力。因此，BART6-3p又可以用于制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和预防肿瘤细胞侵袭转移的制剂。

我们还设计了一系列的实验检测了BART6-3p在鼻咽癌和胃癌细胞中发挥生物学功能的分子机制，我们发现BART6-3p可抑制细胞内一个长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)基因LOC553103的表达(Reference Sequence：NR_110997)，我们设计了针对LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)转染鼻咽癌和胃癌细胞，抑制LOC553103的表达后，细胞出现类似转染BART6-3p的细胞生物学表型，即抑制肿瘤细胞生长和增殖以及抑制肿瘤细胞侵袭与转移能力。因此，针对LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)也可以用于制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和预防肿瘤细胞侵袭转移的制剂。此前，有关LOC553103的功能未见任何文献报道。

细胞骨架是真核细胞中由微管、微丝和中间纤维三种蛋白纤维搭建而成的存在于胞浆内的网络结构，三种成分高度协调分布，将胞核、质膜、各细胞器连在一起，构成了细胞形态维持和运动协调的支持系统。近年来的研究表明肿瘤细胞运动迁移和侵袭能力与细胞骨架的动态调控密切相关，靶向细胞骨架的药物也可以诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤细胞的增殖。我们通过系列实验证实了BART6-3p可通过靶向抑制宿主细胞中LOC553103的表达，影响肿瘤细胞中微管微丝的组装，调控细胞骨架的重构，最终导致肿瘤细胞生长、增殖、侵袭、转移等表型的变化。因此，BART6-3p和针对LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)还可以用于制备抑制肿瘤细胞骨架组装和重构的制剂。

另外，我们又在鼻咽癌和胃癌的临床样本中检测LOC553103的表达状况，发现其在癌旁对照组织中高表达，而在大部分肿瘤组织中低表达，且与BART6-3p的表达呈负相关，LOC553103的表达可以作为患者预后的指标，因此，针对LOC553103设计专用的实时荧光定量PCR引物及检测试剂盒或原位杂交探针及检测试剂盒，用于检测鼻咽癌和胃癌组织LOC553103的表达水平有望为临床上对这两种肿瘤进行复发转移及预后预测提供参考。

总之，我们的研究揭示了BART6-3p及一个新的lncRNA基因LOC553103在鼻咽癌和胃癌等恶性肿瘤发病过程中的功能，为BART6-3p和LOC553103的应用方法提供了实证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA基因LOC553103的应用，具体是利用基因LOC553103的序列制备用于监测胃癌复发转移和预后预测的制剂，包括：实时荧光定量PCR引物及试剂、原位杂交探针及原位杂交检测试剂盒等。

长链非编码RNA基因LOC553103的应用，LOC553103用于制备监测胃癌复发转移和预后预测的制剂；胃癌组织中LOC553103的表达水平与胃癌的复发转移呈正相关关系，且与胃癌患者的不良预后密切相关；该基因在NCBI中的序列号：NR_110997。

所述的监测胃癌复发转移和预后预测的制剂为实时荧光定量PCR检测制剂或原位杂交检测制剂。

所述的实时荧光定量PCR检测制剂包括：

LOC553103正向引物：5’-ACAGTAGTGCGATCAAGGCT-3’；

LOC553103反向引物：5’-TCACCACCTCCCTGTTCTTC-3’。

所述的实时荧光定量PCR检测制剂还包括：内参基因GAPDH特异性PCR引物：

正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

所述的原位杂交检测制剂包括：

LOC553103探针序列-1：5'-CAGAAAAUAAAGUCACAGAGCUCCUGGAAC-3'

LOC553103探针序列-2：5'-ACUGUUUCCUCUCUGCCUUGAUUGAAAUUC-3'

LOC553103探针序列-3：5'-ACACUUUGAAAUUUUUGUCACCUCCCUUGA-3'。

所述的原位杂交检测制剂还包括：阳性对照探针：

GAPDH探针序列-1：5'-CCACUUUACCAGAGUUAAAAGCAGCCCUGG-3'

GAPDH探针序列-2：5'-CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCUGGAGAG-3'

GAPDH探针序列-3：5'-GUCAGAGGAGACCACCUGGUGCUCAGUGUA-3'。

所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。

试剂盒还包括：

地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、DAB染色试剂；其它常规生物化学试剂，包括20x SSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚脱氧腺苷酸，变性剪切的鲑精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts’s solution，PBS buffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐，

TNB缓冲液：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.5％阻断试剂；

TNT缓冲液：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.05％Tween 20。

我们通过实时荧光定量PCR检测，以及原位杂交在存档的胃癌石蜡组织标本中发现LOC553103的表达与胃癌患者的预后密切相关，在胃癌组织中检测到LOC553103的表达水平与胃癌患者的转移呈正相关关系，LOC553103表达高的患者生存时间更短，提示基因LOC553103可作为监测胃癌复发转移和预后预测的分子标志。本发明为胃癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR技术检测BART6-3p在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中的表达情况，

BART6-3p在鼻咽癌(T)中的表达比正常鼻咽上皮(N)中显著提高(P<0.001)。

图2为原位杂交检测BART6-3p在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况，

左边为一例鼻咽癌活检标本，BART6-3p在癌组织中高表达，而在癌旁(Adjacency)正常鼻咽上皮中低表达；右边为另一例癌旁正常鼻咽上皮标本，BART6-3p在癌旁组织中基本检测不到。

图3为鼻咽癌及癌旁上皮中BART6-3p原位杂交数据的统计结果，

在40例鼻咽癌癌旁正常上皮(Adjacency of NPC)中有34例BART6-3p的表达低，甚至基本检测不到(negative)，而在115例鼻咽癌(NPC)中57例检测到有BART6-3p的高表达(high)，其余58例为低表达(low)，P<0.001。

图4为BART6-3p的表达与鼻咽癌远处转移的相关性，

在115例鼻咽癌标本中，92例发生了复发转移，其中31例为原位复发(localrelapse)，61例为远处转移(distance Metastasis)，从统计结果中可以看出远处转移的患者中BART6-3p高表达的比例更低(P<0.05)，表明BART6-3p的表达与肿瘤复发转移呈负相关。

图5为BART6-3p的表达与鼻咽癌患者预后的关系，

鼻咽癌中BART6-3p的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，即BART6-3p高表达(High)的患者生存时间要明显长于BART6-3p低表达(Low)的患者(P<0.05)。

图6为原位杂交检测BART6-3p在胃癌及癌旁上皮中的表达情况，

左边为一例胃癌活检标本，BART6-3p在癌组织中高表达；右边为癌旁正常组织标本，BART6-3p在癌旁组织中基本检测不到。

图7为BART6-3p的表达与胃癌患者预后的关系，

BART6-3p的表达与胃癌患者的预后密切相关，即BART6-3p高表达(High)的患者生存时间要明显长于BART6-3p低表达(Low)的患者(P＝0.04)。

图8为在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入BART6-3p寡核苷酸序列，BART6-3p在肿瘤细胞中的表达显著升高，

在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入BART6-3p寡核苷酸序列后，实时荧光定量PCR方法检测了肿瘤细胞中BART6-3p的表达情况，BART6-3p的表达显著升高。阴性对照(NC)为导入scramble序列。

图9为在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入BART6-3p寡核苷酸序列后细胞的增殖能力降低，生长速度减慢。

图10为在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入BART6-3p寡核苷酸序列后细胞迁移能力降低，

细胞划痕实验证实，在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入BART6-3p寡核苷酸序列，人为促进BART6-3p的表达后，肿瘤细胞从划痕两边往划痕中央迁移速度明显减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低，阴性对照(NC)为导入scramble序列。

图11为在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入BART6-3p寡核苷酸序列后细胞的侵袭能力降低，

细胞穿膜(transwell)实验证实，在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入BART6-3p寡核苷酸序列，人为促进BART6-3p的表达后，能穿过基质胶膜的肿瘤细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力降低，阴性对照(NC)为导入scramble序列。

图12为BART6-3p可下调细胞中lncRNA基因LOC553103的表达，

在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入BART6-3p寡核苷酸序列后实时荧光定量PCR检测发现lncRNA基因LOC553103的表达均显著下调(P<0.05)。

图13为特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)可有效抑制细胞中LOC553103的表达，

我们设计了3条特异性针对LOC553103的RNA干扰序列(siRNA1，siRNA2和siRNA3，简写为S1，S2和S3)转染到EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F(左)、HNE2(中)和胃癌细胞AGS(右)中后实时荧光定量PCR检测发现lncRNA基因LOC553103的表达均显著下调。

图14为在鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入为特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)后细胞的增殖能力降低，生长速度减慢。

图15为在鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)后细胞迁移能力降低，

细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)，人为抑制LOC553103的表达后，肿瘤细胞从划痕两边往划痕中央迁移速度明显减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低，阴性对照(NC)为导入scramble序列。

图16为在鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)序列后细胞的侵袭能力降低，

细胞穿膜(transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞5-8F、HNE2和胃癌细胞AGS中导入特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)序列，人为抑制LOC553103的表达后，能穿过基质胶膜的肿瘤细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力降低，阴性对照(NC)为导入scramble序列。

图17为裸鼠尾静脉注射肺转移成瘤实验进一步证实在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F中导入BART6-3p或特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)均可以抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力。

在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F中导入BART6-3p或特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siLOC)，人为过表达BART6-3p或抑制LOC553103的表达后，将处理过的细胞经尾静脉注射到裸鼠体内，随后继续饲养40天，最后处死裸鼠，观察各组裸鼠肺脏中的转移瘤形成的情况，箭头所示为转移瘤。转染BART6-3p或特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列的两组裸鼠肺组织中的转移瘤数目明显少于阴性对照组，进一步证实了过表达BART6-3p或抑制LOC553103的表达均可以抑制肿瘤细胞侵袭与转移。

图18为裸鼠尾静脉注射肺转移成瘤实验结果统计。

图19为裸鼠皮下成瘤实验进一步证实在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F中导入BART6-3p或特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)均可以抑制肿瘤细胞的生长、增殖，

在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F中导入BART6-3p或特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siLOC)，人为过表达BART6-3p或抑制LOC553103的表达后，将处理过的细胞注射到裸鼠皮下，随后继续饲养30天，最后处死裸鼠，观察各组裸鼠皮下移植瘤的大小。转染BART6-3p或特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列的两组裸鼠皮下移植瘤明显比阴性对照组小，进一步证实了过表达BART6-3p或抑制LOC553103的表达均可以抑制肿瘤细胞的生长与增殖。

图20为裸鼠皮下移植瘤实验结果统计；

在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F中导入BART6-3p或特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siLOC)，人为过表达BART6-3p或抑制LOC553103的表达后，将处理过的细胞注射到裸鼠皮下，随后继续饲养30天，每5天测量皮下移植瘤的大小，统计结果表明过表达BART6-3p或抑制LOC553103的表达均可以抑制肿瘤细胞的生长与增殖。

图21为BART6-3p可影响肿瘤细胞中细胞骨架结构，

在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F中导入BART6-3p人为过表达BART6-3p后，特异性标记细胞骨架(F-actin)，通过细胞免疫荧光实验，在荧光显微镜下观察发现过表达BART6-3p后细胞骨架结构发生了明显的改变，表明BART6-3p的过表达影响了肿瘤细胞中微管微丝的组装。(DAPI为细胞核特异性染料)

图22为干扰lncRNA基因LOC553103的表达可影响肿瘤细胞中细胞骨架结构，

在鼻咽癌细胞5-8F中导入特异性针对lncRNA基因LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)人为降低LOC553103的表达后，特异性标记细胞骨架(F-actin)，通过细胞免疫荧光实验，在荧光显微镜下观察发现干扰LOC553103表达后细胞骨架结构发生了明显的改变，表明LOC553103调控肿瘤细胞中微管微丝的组装。(DAPI为细胞核特异性染料)

图23为实时荧光定量PCR技术检测LOC553103在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中的表达情况；

LOC553103在鼻咽癌(NPC)中的表达比正常鼻咽上皮(N)中显著降低(P<0.001)，且与BART6-3p的表达呈负相关。

图24为实时荧光定量PCR技术检测LOC553103在胃癌和癌旁正常对照组织中的表达情况；

LOC553103在胃癌(T)中的表达比癌旁对照组织(N)中显著降低(P<0.001)。

图25为原位杂交检测LOC553103在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况；

左边为一例鼻咽癌癌旁对照组织标本，LOC553103在癌旁上皮组织中高表达；右边为一例鼻咽癌组织标本，LOC553103在鼻咽癌组织中基本检测不到，LOC553103在鼻咽癌组织中的表达与BART6-3p显著的呈负相关。

图26为LOC553103的表达与鼻咽癌患者预后的关系

LOC553103的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，与BART6-3p刚好相反，即LOC553103高表达(High)的患者生存时间要明显短于LOC553103低表达(Low)的患者(P<0.05)。

图27为原位杂交检测LOC553103在胃癌及癌旁对照组织中的表达情况；

左边为一例胃癌癌旁对照组织标本，LOC553103在癌旁组织中高表达；右边为一例胃癌组织标本，LOC553103在鼻咽癌组织中表达较低。

图28为LOC553103的表达与胃癌患者预后的关系

LOC553103的表达与胃癌患者的预后密切相关，与BART6-3p刚好相反，即LOC553103高表达(High)的患者生存时间要明显短于LOC553103低表达(Low)的患者(P<0.05)。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1，实时荧光定量PCR法检测证实BART6-3p在鼻咽癌中表达上调

1.材料与方法：

收集5例正常鼻咽上皮组织和18例鼻咽癌组织，用Trizol(invitrogen公司产品)抽提总RNA，2μg RNA用miScript逆转录试剂盒(Qiagen公司产品)逆转录成cDNA后，用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen公司产品)进行实时荧光定量PCR检测BART6-3p及内参基因RNU6B的表达。microRNA的公用引物(Universal Primer)及BART6-3p和RNU6B的特异性引物均由Qiagen公司设计并合成。

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(RNU6B)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

BART6-3p在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在鼻咽癌组织中高表达P<0.001(图1)

实施例2，原位杂交检测发现BART6-3p在鼻咽癌和胃癌中的表达与患者预后相关

1.材料方法

1.1设计并合成杂交探针

为了采用原位杂交方法检测BART6-3p的表达情况，我们设计了针对原位杂交检测BART6-3p表达的寡核苷酸探针及阳性对照原位杂交寡核苷酸探针。

BART6-3p探针：UCUAAGGCUAGUCCGAUCCCCG

阳性对照探针(检测看家基因GAPDH)：

GAPDH探针：CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCU

采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列，合成过程中探针序列中尿嘧啶已标记生物素(bio-U)。

1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂

地高辛寡核苷酸加尾试剂(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2^ndGeneration，Roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(Anti-Digoxigenin-POD，Fabfragments，Roche公司)，增强原位表达检测信号的TSA信号放大系统(TSA^TM BiotinSystem，NEL700试剂盒，PerkinElmer公司)，DAB染色试剂盒(北京中山公司)，20x柠檬酸钠缓冲溶液(saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的鲑精DNA(denatured and shearedsalmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5％BlockingReagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)，醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent，Roche公司)。

1.3其他主要试剂和材料

无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、PBS缓冲液(pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L)；3％甲醇-双氧水溶液(80％甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer,CB，pH 6.0±0.1，9ml 0.1M柠檬酸溶液和41ml 0.1M柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液pH值)；0.1％胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精(1ml浓盐酸+99ml 70％酒精配置)；封片胶(PTS Cure MountⅡ)。Leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/L,pH7.4，DEPC双蒸水和PBS缓冲液配制)，苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。

1.4标记探针

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH₂O＝9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ddH₂O 4μl)

混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2μl EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反应。

1.5寡核苷酸探针标记后纯化

为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：

1)探针反应混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCl+75μl 100％冷乙醇(-20℃).

2)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

3)13.000×g 4℃离心15min。

4)弃上清，用50μl冰冷的70％(V/V)乙醇洗涤。

5)13.000xg 4℃，离心5min。

6)弃上清，真空4℃干燥。

7)用无菌双蒸水重溶探针。

1.6原位杂交检测存档石蜡切片中BART6-3p的表达

石蜡切片杂交前处理

1)4℃保存的石蜡切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。

2)二甲苯依次脱蜡3×5min。

3)梯级酒精洗涤，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→DEPC水洗涤2×3min→DEPC-PBS洗涤2×5min。

4)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。

6)切片入0.2N HCL，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。

7)切片用4％多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室温。

8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25％乙酸酐BufferⅠ(0.1M三乙醇胺)，室温10min。

9)1M PBS洗涤2×5min。

预杂交和杂交

预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为50μl，石蜡膜履盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2XSSC，10％Dextransulphate，1X Denhardt’s solution，50mM Phosphate Buffer(PH 7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47％Deionized formamide)。

1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×SSC中5min。

2)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验所用杂交液中探针的终浓度为500ng/ml。

3)杂交后洗涤，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×SSC(0.5％SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5％SDS)，2×15min。

杂交后显色检测反应

1)采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。

2)切片转至TNT缓冲液中，3×5min。

3)滴加TNB阻断缓冲液，300μl/TMAs，室温，30min。

4)吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％Triton X-100+1％阻断剂)，室温4小时。

5)TNT Buffer(0.1M Tris-CL，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)洗涤，3x5min。

6)切片上滴加信号放大试剂Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid贮存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释Biotinyl Tyramid贮存液)，室温10分钟。

7)TNT洗，3×5min。

8)切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/TMAs，室温30min。

9)TNT洗，3×5min。

10)蒸溜水洗涤，1×1min。

11)DAB显色，显微镜下控制显色反应。

12)苏木素复染，

13)酒精梯级脱水，切片干燥。

14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片1min。

1.7结果判断及标准

应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标RNA的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。

再分别以该检测RNA表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：(1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。(2)依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25％，记1分；c.25％＜阳性细胞数＜50％，记2分；d.阳性表达细胞数≥50％，记3分。

为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。

1.8分析和统计软件

应用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ²test或Fisherexact test，相关性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier method及log-rank test；多变量分析采用Cox’sproportional hazards model；P＜0.05即差异有统计学意义。

2结果

2.1BART6-3p在鼻咽癌中的表达比癌旁对照组织中的表达显著升高

在40例癌旁鼻咽上皮(Adjacent Epithelial of NPC)中有34例BART6-3p的表达低(Low)或者基本检测不到(negative)，而在115例鼻咽癌(NPC)中57例检测到有BART6-3p的低表达(Low)，其余58例为高表达(high)，P<0.001(图2和图3)。

2.2BART6-3p的表达水平与鼻咽癌转移密切相关性

我们查询了115例鼻咽癌患者的临床资料，比如发病年龄、性别、TNM分期等，并对他们进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态。我们发现在鼻咽癌组织中检测到BART6-3p的表达水平与鼻咽癌患者的远处转移(Distance metastasis)呈负相关关系，即远处转移组BART6-3p的表达水平比原位复发组(Local relapse)相对较低，(图4，P<0.05)。

2.3BART6-3p低表达的鼻咽癌患者预后较差

我们对鼻咽癌组织中BART6-3p的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现鼻咽癌中BART6-3p的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，BART6-3p高表达(High)的患者生存时间要明显长于BART6-3p低表达(Low)的患者(图5)。

2.4BART6-3p在胃癌中的表达比癌旁对照组织中的表达显著升高

在37例胃癌组织中29例检测到有BART6-3p的低表达(Low)，另外8例为高表达(high)，而在这些胃癌样本对应的癌旁组织中有35例BART6-3p的表达低(Low)或者基本检测不到(negative)，仅2例为BART6-3p阳性，P<0.05(图6)。

2.5BART6-3p低表达的胃癌患者预后较差

我们对胃癌组织中BART6-3p的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现胃癌中BART6-3p的表达与胃癌患者的预后密切相关，BART6-3p高表达(High)的患者生存时间要明显长于BART6-3p低表达(Low)的患者(图7)。

实施例3，过表达BART6-3p抑制肿瘤细胞的生长增殖及侵袭转移

1.材料方法

1.1细胞培养与转染

EBV阴性的鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2，胃癌细胞AGS均购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。

BART6-3p由Invitrogen公司通过化学合成法合成，序列为:

CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA

将生长状态良好的肿瘤细胞系按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始BART6-3p的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入8μl的Hiperfect转染试剂(Qiagen公司产品)于100μl无血清培养基中混匀静置5min；

将BART6-3p加入100μl无血清培养基中；然后与上述包含Hiperfect转染试剂100μl无血清培养基温和混匀，室温静置30分钟，使它们形成复合体；

用D-Hank's液洗涤细胞3次；

将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；

将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养48小时。

1.2实时定量PCR检测BART6-3p表达的效果：

细胞转染成功后，抽提总RNA，逆转录，实时荧光定量PCR法检测BART6-3p的表达，方法和步骤同实施例1。

1.3细胞增殖实验

MTT实验[3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2.5-dipheny-tetrazolium bromideassay]是检测肿瘤细胞增殖的常用手段，具体实验步骤如下：

1)将细胞消化，计数，每孔接种500个细胞于96孔板中，每天需要设置5个复孔最后求平均值，一共设置5天；

2)放置培养箱培养至少5小时，待细胞贴壁后，加MTT液(5mg/ml)20μl。继续培养4小时，弃去培养液。每孔加入200μl DMSO，摇床上放置10分钟；

3)选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上，测定各孔吸光度值并记录结果，此后每隔24小时重复步骤2，记录一次数值，共计检测5天；

4)实验重复三次。以各时间点为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制MTT曲线。

1.4细胞划痕实验

细胞划痕实验是验证肿瘤细胞迁移能力的实验方法。转染了BART6-3p或对照(scramble)序列的鼻咽癌或胃癌细胞接种于6孔板，待细胞密度达到90％时，用200ulpipet在每个6孔板中划一条直线(划痕)，随后在0、8、12、16、24、32、48小时等各个时间点(视不同细胞迁移能力而定)在显微镜下观察划痕愈合情况，拍照，并计算各组细胞迁移速度。

1.5细胞穿膜实验

细胞穿膜((transwell)实验是验证肿瘤细胞侵袭能力的实验方法。Transwell小室(孔径8μm)及基质胶(Matrigel)购自美国BD公司，4％多聚甲醛固定液、结晶紫染液(0.1％g/ml)购自Sigma公司。将Matrigel按1:8稀释，包被在Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30分钟使Matrigel聚合成凝胶。使用前按BD公司说明书进行基质胶膜水化。

在每个Transwell小室上层加入无血清培养基和1×10⁵个转染了BART6-3p或对照(scramble)序列的鼻咽癌或胃癌细胞，在Transwell小室下层加入含20％胎牛血清的培养基。细胞继续培养36小时后，用4％多聚甲醛固定液固定，结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。在显微镜下观察穿过基质胶膜的肿瘤细胞。

2.结果

2.1转染BART6-3p后，肿瘤细胞中BART6-3p的表达水平显著升高

在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2，胃癌细胞AGS中转染BART6-3p后，BART6-3p在鼻咽癌和胃癌细胞中的表达均显著升高(图8)，表明BART6-3p转染成功。

2.2转染BART6-3p后肿瘤细胞增殖速度减慢

MTT细胞增殖实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2，胃癌细胞系AGS中转入BART6-3p后，3株肿瘤细胞的生长增殖速度均明显减慢(图9)。

2.3转染BART6-3p后细胞迁移能力减弱

细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中转入BART6-3p后3株肿瘤细胞从划痕两边往划痕中央迁移的速度减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低(图10)。

2.4转染BART6-3p后细胞侵袭能力降低

细胞穿膜(transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中转入BART6-3p后，能穿过基质胶膜的肿瘤细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力减弱(图11)。

实施例4，过表达BART6-3p抑制肿瘤细胞中lncRNA基因LOC553103的表达

1.材料方法

1.1细胞培养与转染

BART6-3p由Invitrogen公司通过化学合成法合成，序列为:

CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA

在肿瘤细胞中转染BART6-3p的方法和步骤同实施例3。

1.2实时定量PCR检测转染BART6-3p后lncRNA基因LOC553103的表达：

细胞转染成功后，抽提总RNA，逆转录，实时荧光定量PCR法检测lncRNA基因LOC553103的表达，方法和步骤同实施例1，所用引物序列如下：

用于实时荧光定量检测LOC553103表达的引物序列：

LOC553103正向引物：5’-acagtagtgcgatcaaggct-3’

LOC553103反向引物：5’-tcaccacctccctgttcttc-3’

内参基因GAPDH特异性PCR引物：

正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

2.结果

转染BART6-3p后，肿瘤细胞中LOC553013的表达水平显著降低

在EBV阴性的鼻咽癌细胞5-8F、HNE2，胃癌细胞AGS中转染BART6-3p后，lncRNA基因LOC553103的表达均显著降低(图12)，表明BART6-3p可抑制LOC553010的表达，或者说lncRNA基因LOC553103是BART6-3p的靶基因。

实施例5，RNA干扰法抑制肿瘤细胞中LOC553103的表达可以抑制肿瘤细胞的生长增殖及侵袭转移

1.材料方法

1.1细胞培养与转染

鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2，胃癌细胞AGS均购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。

特异性针对LOC553103的RNA干扰序列(siRNA)如下：

siRNA-1：5’-AUAACAUGACAGCUUGCUUGUCUCC-3’

siRNA-2：5’-CUUCCAAGCUCACUCAAGGUUGUUG-3’

siRNA-3：5’-CUAAUAUUCCCUCAGAGCUGGGCUG-3’

上述特异性针对LOC553103的RNA干扰序列由Invitrogen公司合成，阴性对照(NC，scramble)序列也由Invitrogen公司合成并提供。

细胞转染的方法和步骤同实施例3.

1.2RNA干扰LOC553103的表达后，通过细胞增殖实验、细胞穿膜实验和细胞划痕实验检测了人为下调LOC553103表达后细胞的生长、增殖、侵袭和转移能力的变化。具体方法和步骤同实施例3.

2.结果

2.1转染特异性针对LOC553103的RNA干扰序列后，肿瘤细胞中LOC553103的表达水平显著降低

在鼻咽癌细胞5-8F、HNE2，胃癌细胞AGS中转染特异性针对LOC553103的RNA干扰序列后，LOC553103在上述细胞中的表达均显著降低(图13)，表明针对LOC553103的RNA干扰序列转染成功，抑制LOC553103表达的效果明显。

2.2干扰LOC553103表达后肿瘤细胞增殖速度减慢

MTT细胞增殖实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2，胃癌细胞系AGS中转入特异性针对LOC553103的RNA干扰序列后，3株肿瘤细胞的生长增殖速度均明显减慢(图14)。

2.3干扰LOC553103表达后细胞迁移能力减弱

细胞划痕实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中转入特异性针对LOC553103的RNA干扰序列后鼻咽癌和胃癌细胞从划痕两边往划痕中央迁移的速度减慢，划痕愈合的时间延长，表明细胞运动迁移能力降低(图15)。

2.4干扰LOC553103表达后细胞侵袭能力降低

细胞穿膜(transwell)实验证实，在鼻咽癌细胞系5-8F、HNE2及胃癌细胞AGS中转入特异性针对LOC553103的RNA干扰序列后，能穿过基质胶膜的肿瘤细胞数目显著减少，表明细胞侵袭能力减弱(图16)。

实施例6，在动物模型中进一步证实过表达BART6-3p或用RNA干扰法抑制肿瘤细胞中LOC553103的表达可以抑制肿瘤细胞的生长增殖及侵袭转移

1.材料方法

1.1细胞培养与转染

鼻咽癌细胞系5-8F购自中南大学细胞中心，细胞培养所用RPMI 1640培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。

在5-8F细胞中过表达BART6-3p的方法同实施例3；

在5-8F细胞中转染特异性针对LOC553103的RNA干扰序列以抑制细胞内LOC553103表达的方法同实施例5。

1.2裸鼠“尾静脉注射-肺转移”模型检测BART6-3p和LOC553103的RNA干扰序列对鼻咽癌细胞转移能力的抑制作用

4周龄雄性裸鼠购自中南大学实验动物中心，分3组，每组10只，取对数生长期的转染了BART6-3p或RNA干扰序列以及Scramble序列(作为阴性对照，NC)的5-8F细胞(如前一步所述)，经胰酶消化后，在室温(15～25℃)下，1000rpm，离心分钟，弃去上清，1×PBS洗涤2次，然后重悬细胞并计数。取3.5×10⁶细胞/只，经尾静脉注射到裸鼠体内。继续常规饲养40天，处死裸鼠，观察裸鼠肺脏中转移瘤的大小和分布情况。

1.3裸鼠皮下移植瘤模型检测BART6-3p和LOC553103的RNA干扰序列对鼻咽癌细胞增殖能力的抑制作用

4周龄雄性裸鼠购自中南大学实验动物中心，分3组，每组4只，取对数生长期的转染了BART6-3p或RNA干扰序列以及Scramble序列(作为阴性对照，NC)的5-8F细胞(如前一步所述)，经胰酶消化后，在室温(15～25℃)下，1000rpm，离心分钟，弃去上清，1×PBS洗涤2次，然后重悬细胞并计数。取3.5×10⁶细胞/只，接种于裸鼠右侧腋部皮下。每天按时观察接种肿瘤细胞后裸鼠的一般情况和精神状态，称体重，记录移植瘤形成的时间及大小。用游标卡尺测移植瘤长(length,L)、宽(width,W)和高(height,H)，计算肿瘤体积(V)，V＝4π/3*(L/2*W/2*H/2)。根据肿瘤大小绘制移植瘤生长曲线。35天后处死裸鼠，取出移植瘤组织用10％的甲醛固定。

2.结果

2.1裸鼠“尾静脉注射-肺转移”模型进一步证实转染BART6-3p或特异性针对LOC553103的RNA干扰序列后，肿瘤细胞转移能力降低

在鼻咽癌细胞5-8F中转染BART6-3p或特异性针对LOC553103的RNA干扰序列后，与转染阴性对照(Scramble序列，NC)相比，在裸鼠“尾静脉注射-肺转移”模型中BART6-3p以及LOC553103两组裸鼠肺脏中转移瘤的数目明显减少(图17和图18)，表明过表达BART6-3p或抑制LOC553103的表达确实可以抑制肿瘤细胞的侵袭转移。

2.2裸鼠皮下移植瘤模型进一步证实转染BART6-3p或特异性针对LOC553103的RNA干扰序列后肿瘤细胞增殖速度减慢

在鼻咽癌细胞5-8F中转染BART6-3p或特异性针对LOC553103的RNA干扰序列后，与转染阴性对照(Scramble序列，NC)相比，BART6-3p以及LOC553103两组裸鼠皮下移植瘤的生长增殖速度明显减慢(图19，图20)。

实施例7，表达BART6-3p或用RNA干扰法抑制肿瘤细胞中LOC553103的表达可以改变肿瘤细胞中细胞骨架的完整性

1.材料方法

1.1细胞培养与转染

在5-8F细胞中过表达BART6-3p的方法同实施例3；

1.2免疫荧光实验

1)细胞接种：将消毒好的盖玻片(75％消毒酒精浸泡2小时，并在紫外照射1小时)置于六孔板的孔内，将过表达BART6-3p或转染特异性针对LOC553103的RNA干扰序列的5-8F细胞以及阴性对照细胞(转染Scramble序列)分别加到六孔板中的盖玻片上，后置于细胞培养箱培养24小时；取出细胞培养板，37℃预热的PBS温和地摇洗3次；自然风干；

2)37℃预热的4％多聚甲醛在37℃固定15min，预热的PBS温和摇洗3次，每次5min；

3)将FITC-phalloidin(购自Sigma公司，用于标记F-actin)1:500稀释，37℃孵育50min，预热的PBS洗三次；

4)DAPI染色5min，预热的PBS清洗3次；

5)清水洗3次去掉PBS，晾干封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

2.结果

免疫荧光结果显示FITC标记的F-actin(细胞骨架)呈绿色，分布在胞浆内，DAPI标记的核酸呈蓝色，分布在细胞核内。对照组细胞形状规则，细胞骨架清晰明亮，含量丰富，呈纤维放射状沿细胞长轴排列，应力纤维层次清晰，胞核被染成深蓝色；BART6-3p组(图21)及LOC553103干扰组(图22)细胞骨架解聚，细胞微丝变短，排列稀疏，应力纤维数目明显减少变细，细胞核暗淡无光，细胞皱缩变圆，细胞核暗淡无光，细胞间的桥梁状骨架连接纤维减少或消失，提示过表达BART6-3p或干扰LOC553103的表达后细胞骨架组装受到了明显抑制，并影响了肿瘤细胞的生长、增殖以及侵袭转移能力。

实施例8，实时荧光定量PCR法检测证实LOC553103在鼻咽癌和胃癌中表达下调

1.材料与方法：

收集5例正常鼻咽上皮组织和18例鼻咽癌组织以及18对胃癌组织及相应的癌旁对照组织用Trizol(invitrogen公司产品)抽提总RNA，2μg RNA用逆转录试剂盒(Qiagen公司产品)逆转录成cDNA后，用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen公司产品)进行实时荧光定量PCR检测LOC553103及内参基因GAPDH的表达。PCR引物及扩增方法同实施例4。

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

LOC553103在正常鼻咽上皮(图23)或胃癌癌旁对照组织中表达较高(图24)，而在鼻咽癌组织(图23)或胃癌组织(图24)中表达较低。

实施例9，原位杂交检测发现LOC553103在鼻咽癌和胃癌中的表达与患者预后相关

1.材料方法

1.1设计并合成杂交探针

为了采用原位杂交方法检测LOC553103的表达情况，我们设计了针对原位杂交检测LOC553103表达的寡核苷酸探针及阳性对照(GAPDH)原位杂交寡核苷酸探针。

LOC553103探针序列-1：5'-CAGAAAAUAAAGUCACAGAGCUCCUGGAAC-3'

LOC553103探针序列-2：5'-ACUGUUUCCUCUCUGCCUUGAUUGAAAUUC-3'

LOC553103探针序列-3：5'-ACACUUUGAAAUUUUUGUCACCUCCCUUGA-3'

阳性对照探针(检测看家基因GAPDH)：

GAPDH探针序列-1：5'-CCACUUUACCAGAGUUAAAAGCAGCCCUGG-3'

GAPDH探针序列-2：5'-CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCUGGAGAG-3'

GAPDH探针序列-3：5'-GUCAGAGGAGACCACCUGGUGCUCAGUGUA-3'

1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测方法、结果判定及统计方法等同实施例2

2结果

2.1LOC553103在鼻咽癌中的表达比癌旁对照组织中的表达显著降低

在40例癌旁鼻咽上皮(Adjacent Epithelial of NPC)中有36例LOC553103的表达较高(图25左)，而在115例鼻咽癌(NPC)中57例LOC553103的表达较低(图25右)P<0.001。LOC553103的表达与BART6-3p呈显著负相关。

2.2LOC553103表达高的鼻咽癌患者预后较差

我们对鼻咽癌组织中LOC553103的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现鼻咽癌中LOC553103的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，LOC553103低表达(Low)的患者生存时间要明显长于LOC553103高表达(high)的患者(图26，P＝0.03)。

2.3LOC553103在胃癌中的表达比癌旁对照组织中的表达显著降低

在37例胃癌组织中29例检测到有LOC553103的低表达(图27右)，其余8例为高表达，而在这些胃癌样本对应的癌旁组织中有35例LOC553103的表达较高(图27左)，P<0.05。

2.4LOC553103高表达的胃癌患者预后较差

我们对胃癌组织中LOC553103的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现胃癌中LOC553103的表达与胃癌患者的预后密切相关，LOC553103高表达(High)的患者生存时间要明显短于LOC553103低表达(Low)的患者(图28，P<0.05)。

Claims

1.检测长链非编码RNA基因LOC553103表达量的制剂在制备监测胃癌复发转移和预后预测的制剂中的应用；胃癌组织中LOC553103的表达水平与胃癌的复发转移呈正相关关系；长链非编码RNA基因LOC553103在NCBI中的序列号：

NR_110997。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的监测胃癌复发转移和预后预测的制剂为实时荧光定量PCR检测制剂或原位杂交检测制剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测制剂包括：

LOC553103正向引物：5’-ACAGTAGTGCGATCAAGGCT-3’；

LOC553103反向引物：5’-TCACCACCTCCCTGTTCTTC-3’。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测制剂还包括：内参基因GAPDH特异性PCR引物：

正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测制剂包括：

LOC553103探针序列-1：5'-CAGAAAAUAAAGUCACAGAGCUCCUGGAAC-3'

LOC553103探针序列-2：5'-ACUGUUUCCUCUCUGCCUUGAUUGAAAUUC-3'

LOC553103探针序列-3：5'-ACACUUUGAAAUUUUUGUCACCUCCCUUGA-3'。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测制剂还包括：

阳性对照探针：

GAPDH探针序列-1：5'-CCACUUUACCAGAGUUAAAAGCAGCCCUGG-3'

GAPDH探针序列-2：5'-CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCUGGAGAG-3'

GAPDH探针序列-3：5'-GUCAGAGGAGACCACCUGGUGCUCAGUGUA-3'。

7.根据权利要求2或5或6所述的应用，其特征在于，所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，试剂盒还包括：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、DAB染色试剂；

其它常规生物化学试剂，包括20x SSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚脱氧腺苷酸，变性剪切的鲑精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，

50xDenhardts’s solution，

PBS buffer，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐，

TNB缓冲液：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.5％阻断试剂；

TNT缓冲液：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.05％Tween 20。