CN109030835B - 一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，包括分析Rab8通过翻译后环节对调节膜表面Klotho表达的作用、分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路及EMT中的作用以及分析Rab8调控Klotho膜表面表达在非小细胞肺癌细胞功能学方面的作用。本发明首次发现，Rab8与Klotho结合，通过蛋白生物合成后途径促进其向膜表面转运，提高Klotho膜表面分布水平，抑制Wnt/β‑catenin信号激活，抑制细胞发生上皮‑间质转化，从而抑制肺癌细胞迁移、侵袭。因此，Rab8具有主动调节Klotho功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白相互作用及相关作用机制的分析方法，具体为一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，属于生物学应用领域。
背景技术
近年来研究者对于Rab8的相关研究兴趣日增。Rab8最初从黑色素瘤细胞中被发现，被认为是转化基因。目前认为Rab8参与了极性化细胞中新合成蛋白的转运，从而参与了细胞形状的调节，以及响应不同的细胞信号。Rab8通过重组肌动蛋白和微管，在膜转运和细胞骨架动力学方面起到串联作用，从而在细胞形态学方面具有重要影响。有报道认为Rab8参与了初级纤毛的形成及物质转运。最近有报道Rab8参与了MT1-MMP的促侵袭活性的调控。有研究发现，Rab8在乳腺癌和转移淋巴结中表达上调，可能与Rab8可以通过MT1-MMP促进细胞迁移有关。也有人报道Rab8在化疗药物顺铂耐药的细胞中表达明显升高，并发现它参与了TMEM205相关的药物抵抗。Rab8调节膜再循环通路，与Arf6，EHD1，Myo5和Rab11相关。有假说认为Rab8在细胞表面结构域形成中具有重要作用。另有研究发现，Rab8激活诱导Rac1和Tiam1，介导皮质肌动蛋白聚合和RhoA依赖性弹性纤维分解。Rab8激活增加Rac1活性，而其缺失时将激活RhoA，导致肌动蛋白细胞骨架的重组。Rab8还和黏着斑、细胞迁移等相关。Rab8的这些功能牵涉到calpain，MT1-MMP和Rho GTP酶等。这些数据表明Rab8通过Rho GTP酶依赖和非依赖两种方式驱动细胞活性，从而调节细胞极性的建立，黏着斑的翻转，以及肌动蛋白细胞骨架重排，决定了细胞迁移的方向。此外，多个Rab8相互作用蛋白被证实与不同疾病相关。
目前对于Rab8功能以及Rab8相关的信号通路仍有很多未知。关于Rab8调控哪些运输通路，Rab8通路的cargo蛋白如受体和接头蛋白，以及Rab8相互结合蛋白方面的信息仍较匮乏。通过免疫共沉淀联合质谱分析，我们发现并证实在非小细胞肺癌中Rab8与Klotho存在相互结合及亚细胞共定位，且Rab8可以促进Klotho蛋白膜表面表达，有必要对Rab8调控Klotho膜表面表达的机制，以及在非小细胞肺癌中的相关作用进一步研究。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，包括以下步骤：
(1)分析Rab8通过翻译后环节对调节膜表面Klotho表达的作用，包括插入和内吞两个相反的受体转运过程的分析，利用切割表面生物素标记技术检测Klotho内化，同时利用一种基于荧光的活细胞比率循环分析方法，以测量Klotho的再循环利用，结果表明Rab8并不参与Klotho内化；
(2)分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路及EMT中的作用，包括利用Western blot检测、免疫细胞化学方法和定量RT-PCR检测分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路中的作用，利用Western blot检测分析Rab8调控Klotho膜表面表达在EMT中的作用；
(3)分析Rab8调控Klotho膜表面表达在非小细胞肺癌细胞功能学方面的作用，包括CCK8检测实验、细胞集落形成实验、划痕实验、Transwell侵袭实验和移植瘤实验。
优选地，所述基于荧光的活细胞比率循环分析方法如下：
(1)表达FLAG-Klotho的A549细胞在含有结合Alexa-488的抗FLAG抗体M1的DMEM培养基中4℃下培养30分钟，然后在37℃温暖环境中培养30分钟以促进内化；
(2)迅速用含1mM EDTA的冰PBS洗涤细胞3次，以分离与未发生内化的Klotho结合的Alexa-488抗FLAG抗体M1；
(3)更换含有结合Alexa-594的抗鼠IgG二抗的新鲜培养基，37℃下培养30分钟，以标记循环回细胞表面的Klotho蛋白；
(4)每组实验设立两组平行对照，立即用含4％多聚甲醛的PBS固定细胞；
根据对照组红/绿光比率计算回收蛋白质的百分比，公式如下：
回收蛋白质的百分比＝(E-Z)/(C-Z)×100，
其中E代表回收组平均比率，
Z代表0％回收对照组平均比率，
C代表100％表面对照组比率。
优选地，所述含有结合Alexa-488的抗FLAG抗体M1的型号规格为A488-M1。
优选地，所述基于荧光的活细胞比率循环分析方法的每个实验中，包括两个平行的对照组，其中一组在没有经过EDTA处理，孵育15分钟固定，作为100％表面对照，另一组是EDTA处理后立即固定细胞作为0％回收对照，利用荧光显微镜Nikon Eclipse TE 2000-U捕捉图像，通过MetaMorph软件循环回收蛋白进行定量。
优选地，所述Western blot检测中的抗体包括Wnt3兔单克隆抗体、Beta-catenin抗体和抗-Active-Beta-Catenin抗体。
优选地，所述定量RT-PCR引物如下：
Cyclin D1-322bp
正义：5’-CCGCTGGCCATGAACTACCT-3’，
反义：5’-ACGAAGGTCTGCGCGTGTT-3’；
C-myc-110bp
正义：5’-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3’，
反义：5’-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3’。
本发明的有益效果是：本发明首次发现，过表达Rab8可以提高Klotho膜表面分布水平，抑制Wnt/β-catenin信号激活，抑制细胞发生上皮-间质转化，从而抑制肺癌迁移、侵袭；当Rab8被沉默后，Klotho对Wnt/β-catenin信号的抑制作用，以及细胞、迁移等效应均被阻断。因此，Rab8具有主动调节Klotho的作用。
附图说明
图1为本发明A549细胞转染Rab8后采用切割表面生物素标记技术观察Klotho内化比率分析图；
图2为本发明采用荧光活细胞比率循环分析方法检测Klotho蛋白的再循环情况分析图；
图3A为本发明采用Western blot检测分析Rab8在Klotho调节Wnt信号通路中发挥作用情况图；
图3B为本发明采用免疫细胞化学方法观察A549细胞中beta-catenin的核内定位情况图；
图3C为本发明采用定量RT-PCR观察Wnt信号通路靶基因c-myc和cyclin D1的表达水平变化图；
图4为本发明采用Western blot检测EMT相关标记物分布情况图；
图5为本发明采用CCK8检测实验结果分析图；
图6为本发明细胞集落形成实验结果分析图；
图7为本发明划痕实验结果分析图；
图8为本发明Transwell侵袭实验结果分析图；
图9为本发明移植瘤实验结果分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
前期研究我们证实，在非小细胞肺癌中Rab8与Klotho存在相互结合，在亚细胞中存在共定位，且Rab8可促进Klotho蛋白膜表面表达，接下来，我们想进一步探讨Rab8调控Klotho转运代谢的具体机制，以及由此引发的非小细胞肺癌生物学行为的变化。
一种分析Rab8调节Klotho表达机制的方法，包括以下步骤：
1、分析Rab8通过翻译后环节对调节膜表面Klotho表达的作用
Rab8对Klotho转运代谢的作用分析包括插入和内吞两个相反的受体转运过程的分析，利用切割表面生物素标记技术检测Klotho内化，同时利用一种基于荧光的活细胞比率循环分析方法，以测量Klotho的再循环利用。
以密度为1×106细胞/ml种植，按照既往生物素标记实验步骤进行，具体操作如下：
冰PBS清洗细胞两次，4℃下PBS中磺化N-羟基琥珀酰亚胺-生物素孵育细胞在孵化PBS 45分钟生物素化细胞表面蛋白，Tris缓冲液去除未反应的生物素，生物酰化细胞在提取缓冲液中溶解，12000g×15分钟对提取物离心,然后通过链霉亲和素结合琼脂糖珠沉淀方法可以从细胞提取物中分离细胞生物素化的蛋白质，用SDS样品缓冲液洗脱清洗过的小珠，再通过SDS-PAGE分离蛋白。所有实验至少重复三次。
磺化N-羟基琥珀酰亚胺-生物素采购自Pierce公司，型号规格为300μg/ml。
提取缓冲液包括1.0％(v/v)Triton X-100,10mM Tris-HCl,pH 7.5,120mM NaCl,25mM KCl,1μg/ml亮抑肽酶，1μg/ml抑肽素，2μg/ml抑酶肽,0.5mM苯基甲基磺酰氟。
对于密度测定分析，使用NIH Image J对免疫反应带进行扫描和定量。
如图1所示,生物素标记后30分钟，40％±5％的表面Klotho发生内化,且并不受到Rab8的过表达影响，这些结果表明Rab8并不参与Klotho内化。
细胞发生内吞后有两种命运，被降解或循环回质膜，蛋白质再循环回质膜可引起功能性的再敏化。因此，我们利用一种基于荧光的活细胞比率循环分析方法，观察了Rab8是否可以调节Klotho的再循环环节。
基于荧光的活细胞比率循环分析方法如下：
(1)表达FLAG-Klotho的A549细胞在含有结合Alexa-488的抗FLAG抗体M1的DMEM培养基中4℃下培养30分钟，然后在37℃温暖环境中培养30分钟以促进内化；
(2)迅速用含1mM EDTA的冰PBS洗涤细胞3次，以分离与未发生内化的Klotho结合的Alexa-488抗FLAG抗体M1；
(3)更换含有结合Alexa-594的抗鼠IgG二抗的新鲜培养基，37℃下培养30分钟，以标记循环回细胞表面的Klotho蛋白。
(4)每组实验设立两组平行对照，立即用含4％多聚甲醛的PBS固定细胞。
在每个实验中，包括两个平行的对照组，其中一组在没有经过EDTA处理，孵育15分钟固定，作为100％表面对照，另一组是EDTA处理后立即固定细胞作为0％回收对照，利用荧光显微镜Nikon Eclipse TE 2000-U捕捉图像，通过MetaMorph软件回收Klotho蛋白进行定量。
根据对照组红/绿光比率计算回收蛋白质的百分比，公式如下：
回收蛋白质的百分比＝(E-Z)/(C-Z)×100，
其中E代表回收组平均比率，
Z代表0％回收对照组平均比率，
C代表100％表面对照组比率。
如图2所示，实验结果表明Rab8不影响Klotho的再循环环节。
上述结果表明，Rab8不影响Klotho的内吞作用。因此，Rab8可以通过生物合成后途径调节Klotho的膜表面水平，而不是内吞途径。
2、分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路及EMT中的作用
Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路及EMT中的作用分析包括Westernblot检测和定量RT-PCR检测。
Western blot检测包括Wnt3兔单克隆抗体、Beta-catenin抗体和抗-Active-Beta-Catenin抗体，定量RT-PCR使用Bio-rad 480PCR仪，定量RT-PCR引物如下：
Cyclin D1-322bp
正义：5’-CCGCTGGCCATGAACTACCT-3’，
反义：5’-ACGAAGGTCTGCGCGTGTT-3’；
C-myc-110bp
正义：5’-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3’，
反义：5’-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3’。
Western blot操作步骤如下：
等量样品上样至SDS聚丙烯酰胺凝胶，并将其转移到PVDF膜上。5％w/v脱脂奶粉、1×TBS、0.05％Tween-20封闭1h，4℃下一抗封闭过夜。然后，TBS-T洗膜3次，室温下加入辣根过氧化物酶标记的二抗封闭孵育1h主要抗体结合膜在TBS-T中清洗3次，在室温下孵育1h，二次抗体与horseradish过氧化物酶结合，工作浓度为1:10000。最后，ECL发光。所有实验重复三次。
二抗的型号规格为santacruz,sc2004，1:10000。
horseradish过氧化物酶型号规格为santacruz,sc2004。
RNA提取试剂盒提取总RNA，然后用cDNA合成试剂盒将RNA转化为cDNA。qRT-PCR反应条件为95℃5分钟,95℃30秒,继以40个循环60℃45秒、72℃3分钟。每个反应重复三次。利用2-△Ct方法计算Rab8,cyclin D1,c-Myc和KL等基因定量表达。
RNA提取试剂盒和cDNA合成试剂盒型号规格均为CoWin Bioscience,Beijing,China。
我们探索了Rab8是否在Klotho调节Wnt信号通路中发挥作用。Westernblot结果显示，过表达Klotho可显著抑制A549和H1299细胞中active-beta-catenin和Wnt3a的表达，而当Rab8沉默后，Klotho不再具有这一功能，如图3A所示。
此外,我们利用免疫细胞化学方法观察了A549细胞中beta-catenin的核内定位情况。结果如图3B所示，过表达Klotho后，A549细胞中beta-catenin向核内易位受到明显抑制，而当Rab8沉默后，Klotho不再具有这种抑制效应。
最后，我们利用定量RT-PCR观察了Wnt信号通路靶基因c-myc和cyclin D1的表达水平变化。结果如图3C所示，过表达Klotho可以抑制A549细胞中c-myc和cyclin D1的表达，而Rab8沉默后，Klotho此种抑制作用被废除。
上述结果表明，Rab8参与Klotho依赖的Wnt/beta-catenin信号通路抑制效应，Rab8在保证Klotho有效调节Wnt信号通路过程中起着至关重要作用。
利用Western blot对EMT相关标记物进行了检测，结果如图4所示，过表达Klotho后肺腺癌细胞A549和H1299细胞中E-cadherin表达上升，N-Cadherin和Vimentin则表达下降。然而，当Rab8被沉默后，Klotho的上述功能则被阻断。因此，Klotho可以抑制肺癌细胞上皮-间质转化，而Rab8在Klotho正常功能发挥中起重要作用。
3、分析Rab8调控Klotho膜表面表达在非小细胞肺癌细胞功能学方面的作用
(1)CCK8检测实验
细胞转染24小时，铺96孔板，细胞密度为1×104/孔。分别在细胞种植后0h、24h、48h、72h，选取特定孔加入10ul/孔CCK8，孵育30分钟，然后450nm波长下观察，具体实验步骤按照CCK8说明书执行。实验重复三次，求平均值。
CCK8型号为Lot#EX783,Dojindo Laboratories,Tokyo,Japan。
通过CCK8检测实验研究Rab8是否参与了Klotho对肺癌细胞增殖的影响，如图5所示，CCK8检测结果显示，Klotho抑制A549和H1299细胞的增殖，并不随Rab8的表达改变而改变，提示Rab8并不参与Klotho对肺癌细胞增殖的影响。
(2)细胞集落形成实验
A549或H1299细胞以100个细胞/孔密度种植于六孔板中，37℃下培养，每两天更换培养基。培养14天，4％多聚甲醛固定细胞克隆10分钟，室温下用结晶紫染色20分钟。在光学显微镜下计数细胞集落数，并用数码相机拍照。实验重复三次。
如图6所示，集落形成实验结果表明，Rab8表达变化不参与Klotho对肺癌细胞集落形成的影响。
(3)划痕实验
A549或H1299细胞以2×105个细胞/孔密度种植于六孔板中，37℃、5％二氧化碳湿润环境下培养24h，待细胞完全融合。使用无菌移液器枪头在每孔细胞层中划出一条直线。细胞再用含2％血清的新鲜培养基孵育48小时，然后利用Image J软件对未愈合的划痕区域进行测量定量。实验重复三次。
通过划痕实验研究Rab8是否参与Klotho对肺癌细胞的迁移侵袭过程的影响，如图7所示，划痕实验结果显示，Klotho过表达明显抑制肺癌细胞迁移，但当Rab被沉默后，Klotho即不再具有抑制肺癌迁移作用。
(4)Transwell侵袭实验
将2×105个细胞/孔密度A549或H1299细胞悬液以种植于24孔transwell培养板上室中，该层具有8μm孔径聚碳酸酯过滤器。然后下室除了对照组外，其余各组各加入500μL含10％胎牛血清DMEM培养基，培养箱中培养24h。移除培养基，用棉签刮除过滤层上的细胞，迁移到下室面的细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，然后0.1％结晶紫染色5分钟。迁移细胞在显微镜下200倍下随机挑选五个视野，进行计数。实验重复三次。
8μm孔径聚碳酸酯过滤器型号规格为Costar,Corning,NY,USA。
Transwell侵袭实验结果如图8所示，Klotho可有效抑制肺癌细胞侵袭，但当Rab8被沉默后，Klotho则不再具有抑制肺癌细胞侵袭能力。
综上所述，我们的研究结果表明，Rab8在klotho介导非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭中具有关键作用。
(5)移植瘤实验
为了进一步验证体外实验结果，我们制备了裸鼠移植瘤模型。实验分三组，对照组A549、Klotho感染组Klotho-A549和Klotho/Rab8共感染组Klotho/Rab8-A549。
与体外实验结果一致，动物实验结果如图9所示，Klotho组肿瘤生长速度明显慢于对照组，表现为肿瘤体积和重量明显小于对照组。同时，Klotho/Rab8共感染组肿瘤体积和重量则明显小于Klotho感染组。
因此，上述结果表明，Klotho显著抑制体内的非小细胞肺癌肿瘤的发生，而Rab8可显著提高Klotho的抑癌功能。
上述实验采用A549和H1299细胞，所述A549和H1299细胞为人非小细胞肺癌细胞株，所述A549和H1299细胞均在含有DMEM+10％胎牛血清以及37℃、5％二氧化碳的孵育箱中培养。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)分析Rab8通过翻译后环节对调节膜表面Klotho表达的作用，包括插入和内吞两个相反的受体转运过程的分析，利用切割表面生物素标记技术检测Klotho内化，同时利用一种基于荧光的活细胞比率循环分析方法，以测量Klotho的再循环利用，结果表明Rab8并不参与Klotho内化；
(2)分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路及EMT中的作用，包括利用Westernblot检测、免疫细胞化学方法和定量RT-PCR检测分析Rab8调控Klotho膜表面表达在Wnt信号通路中的作用，利用Western blot检测分析Rab8调控Klotho膜表面表达在EMT中的作用；
(3)分析Rab8调控Klotho膜表面表达在非小细胞肺癌细胞功能学方面的作用，包括CCK8检测实验、细胞集落形成实验、划痕实验、Transwell侵袭实验和移植瘤实验。
2.根据权利要求1所述的一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述基于荧光的活细胞比率循环分析方法如下：
(1)表达FLAG-Klotho的A549细胞在含有结合Alexa-488的抗FLAG抗体M1的DMEM培养基中4℃下培养30分钟，然后在37℃温暖环境中培养30分钟以促进内化；
(2)迅速用含1mM EDTA的冰PBS洗涤细胞3次，以分离与未发生内化的Klotho结合的Alexa-488抗FLAG抗体M1；
(3)更换含有结合Alexa-594的抗鼠IgG二抗的新鲜培养基，37℃下培养30分钟，以标记循环回细胞表面的Klotho蛋白；
(4)每组实验设立两组平行对照，立即用含4％多聚甲醛的PBS固定细胞；
根据对照组红/绿光比率计算回收蛋白质的百分比，公式如下：
回收蛋白质的百分比＝(E-Z)/(C-Z)×100，
其中E代表回收组平均比率，
Z代表0％回收对照组平均比率，
C代表100％表面对照组比率。
3.根据权利要求2所述的一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述基于荧光的活细胞比率循环分析方法的每个实验中，包括两个平行的对照组，其中一组在没有经过EDTA处理，孵育15分钟固定，作为100％表面对照，另一组是EDTA处理后立即固定细胞作为0％回收对照，利用荧光显微镜Nikon Eclipse TE 2000-U捕捉图像，通过MetaMorph软件循环回收蛋白进行定量。
4.根据权利要求1所述的一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述Western blot检测中的抗体包括Wnt3兔单克隆抗体、Beta-catenin抗体和抗-Active-Beta-Catenin抗体。
5.根据权利要求1所述的一种分析Rab8调节Klotho表达在非小细胞肺癌中的作用的方法，其特征在于：所述定量RT-PCR引物如下：
Cyclin D1-322bp
正义：5’-CCGCTGGCCATGAACTACCT-3’，
反义：5’-ACGAAGGTCTGCGCGTGTT-3’；
C-myc-110bp
正义：5’-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3’，
反义：5’-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3’。
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