CN103849620A - 一种taz敲低或过表达的pc9细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种TAZ因子敲低PC9细胞株的shRNA分子。还公开了shRNA分子的重组载体。本发明还公开了一种TAZ因子过表达PC9细胞株的重组载体。本发明还公开了TAZ敲低和过表达的PC9细胞株的建立方法。具体是通过应用shRNA技术，利用TAZ-shRNA转染PC9细胞，建立TAZ敲低PC9细胞株；利用TAZ过表达载体转染PC9细胞，建立TAZ过表达的PC9细胞株。应用免疫细胞荧光、RT-PCR和Western blot技术检测细胞株中TAZ，证明细胞株建立成功。并测定细胞生长曲线和倍增时间。TAZ敲低和过表达PC9细胞株的建立为研究TAZ在肺癌靶向治疗敏感性中的作用提供了有力的实验材料。

Description

一种TAZ敲低或过表达的PC9细胞株及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种TAZ敲低PC9或过表达细胞株及其构建方法和应用。 

背景技术

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的75%-85%，确诊时多属中晚期（Ⅲb和Ⅳ期），失去手术时机，经过综合治疗，5年生存率仅为5%-10%。目前，针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）不仅口服方便、毒性低、耐受性良好，而且提高患者的生活质量、延长选择性患者的生存时间，在晚期肺癌的治疗中发挥了重要作用。然而，临床研究发现，EGFR-TKIs治疗的原发性耐药以及所有接受治疗患者最终发生的获得性耐药，成为限制药物疗效的瓶颈。 

肺癌EGFR-TKIs耐药的分子机制多重复杂。EGFR基因自身的突变或扩增、其他受体酪氨酸激酶活化、EGFR信号下游信号分子改变等，这些效应的多样性使得逆转耐药治疗异常复杂且难以实现。近年来，随着具有特异表面标志肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）的发现，CSCs在肺癌发生发展、侵袭衍进、治疗疗效和肿瘤耐药方面的根源作用被不断证实。研究提示肿瘤细胞“干性（stemness）”的获得，如肿瘤球（tumorsphere）的形成以及上皮细胞间质改变（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等，是EGFR-TKIs耐药和肿瘤复发的始作俑者。进一步研究提示：调节肿瘤干细胞自我更新相关的信号通路——如Notch，Wnt，Sonic hedgehog和Hippo——异常激活和/或转录因子异常表达在肿瘤耐药的调控中发挥重要的作用。 

新近的研究提示：在细胞增殖凋亡、组织稳态维持及干细胞的自我更新等过程发挥重要作用的抑癌通路——Hippo，调控多种CSCs形成，并与EGFR信号通路在肿瘤发生过程中存在紧密联系的交互作用。Hippo通路是首先在果蝇中发现的一个新的信号转导通路，是细胞增殖和凋亡的控制开关；其核心部分由一个级联的激酶系统构成，通过转录共活化因子Yorkie的磷酸化调节基因表达，从而在果蝇发育过程中发挥控制细胞数量和器官大小的关键作用；该机制的失效将诱发组织过度生长和肿瘤形成。在哺乳动物细胞中存在和果蝇高度保守的Hippo通路，构成该信号通路的各编码基因在多种人类肿瘤 组织中存在异常表达或突变。小鼠模型中，干扰Hippo或EGFR信号产生类似的组织过度增长效应，两种效应的重叠表明Hippo和EGFR通路的紧密联系。有研究发现，EGFR下游两个效应旁路MAPK和PI3K间接控制Hippo信号级联上游激酶Mst1/2的活性。同时，Hippo下游关键转录因子，即具有PDZ-结合模序的转录共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ又称WWTR1）和Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP），诱导EGFR配体表达，激活EGFR信号，影响EGFR-TKIs药物敏感性。 

TAZ是Hippo信号通路下游重要的转录共激活因子，是果蝇Hippo通路转录共活化因子Yorkie在哺乳动物中的同源蛋白之一，也是Wnt信号重要的调节因子。TEAD是细胞核内与TAZ结合的最主要转录因子，TAZ与TEAD结合后，依赖TAED中TAE功能结构域，启动下游基因转录。临床研究发现TAZ蛋白水平增高与乳腺癌、胶质瘤、直肠癌、乳头状甲状腺癌及肺癌的发病和低分化程度相关。Cordenonsi等对乳腺癌的研究提示，TAZ通过调节细胞极性“开关（gatekeeper）”Scribble蛋白，诱导肿瘤球的形成和EMT，增加肿瘤起始细胞（tumor-initiating）和具有干细胞表型的肿瘤细胞数，诱发多耐药蛋白（multidrug resistance，MDR）表达，引起化疗耐药。Lai等进一步的研究揭示：TAZ-TEAD-Cyr61/CTGF信号调节乳腺癌对紫杉醇的敏感性(Lai D,Ho KC,Hao Y,et al.Taxol resistance in breast cancer cells is mediated by the hippo pathway component TAZ and its downstream transcriptional targets Cyr61and CTGF.Cancer Res2011,71:2728-38.)。还有研究发现，TAZ旁系同源物YAP通过TAZ和YAP共有的WW结构域结合PTPN14蛋白PPXY基序，具有调节顺铂、厄洛替尼以及survivin抑制剂治疗乳腺癌和卵巢癌抗肿瘤敏感性的作用(Hong W,Guan KL.The YAP and TAZ transcription co-activators:key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway.Semin Cell Dev Biol2012,23:785-93.)。新近的研究提示，具有多重致癌活性、能诱发EGFR信号自分泌环形成和诱导EGFR-TKIs耐药的EGFR激活型配体——AREG也是TAZ的重要转录靶点。乳腺上皮细胞中，TAZ同源物YAP诱导AREG表达，AREG以非细胞自主方式（non-cell-autonomus）促进细胞增殖及迁移，发挥生理调节作用。有关肺腺癌H460及食道腺癌细胞的研究发现，腺癌相关基因AGR2通过YAP激活诱导AREG表达，AREG进一步特异激活EGFR信号，促进肿瘤形成。Yang等研究提示，在乳腺上皮细胞，TAZ通过TEAD转录因子激活诱导AREG分泌，AREG以非细胞自主方式激活独立于EGF的细胞生长和恶性转化，且乳腺癌患者样本的免疫组化结果也提示TAZ和AREG蛋白表达有显著相关性(Huang JM, Nagatomo I,Suzuki E,et al.YAP modifies cancer cell sensitivity to EGFR and survivin inhibitors and is negatively regulated by the non-receptor type protein tyrosine phosphatase14.Oncogene2013,32(17):2220-9.)。我们研究提示：TAZ在人支气管上皮细胞HBE154中不表达，吉非替尼敏感NSCLC细胞PC-9及其耐药细胞PC-9/GR中TAZ表达水平呈升高趋势并有显著性差异，且AREG的表达和TAZ有相关性。因此，通过干预TAZ基因表达水平，研究其在肺癌靶向治疗耐药中的分子机制，为寻求减少靶向治疗耐药的方法提供了新思路。 

肿瘤基因治疗领域的新技术——RNA干扰（RNA interference，RNAi），是由双链RNA引发的转录或转录后基因沉默现象（post-transcriptional gene silencing，PTGS），因其抑制效果确切、高特异性、高效性等特点而被广泛应用。以病毒载体形式表达的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），通常是利用RNA聚合酶Ⅲ启动子（人或鼠U6或人H1启动子）转录下游反向重复DNA序列，形成小发夹结构，被Dicer等酶识别而切割成小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），进而稳定而特异地沉默基因，是发挥RNAi的有效方式。目前，以慢病毒或逆转录病毒为载体的RNAi技术显示，TAZ基因的沉默抑制乳腺癌和直肠癌的形成、侵袭和转移；同时可增加乳腺癌对紫杉醇的药物敏感性。作为新发现的癌基因，Hippo通路关键因子TAZ可能通过CSCs形成以及TAED-AREG途径参与肺癌细胞EGFR-TKIs治疗的耐药，而对于其在EGFR敏感或耐药的肺腺癌中的表达及功能的研究目前还未见报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种TAZ因子敲低PC9细胞株的shRNA分子。 

本发明还要解决的技术问题是提供上述shRNA分子的重组载体。 

本发明还要解决的技术问题是提供一种TAZ因子过表达PC9细胞株的重组载体。 

本发明还要解决的技术问题是提供一种TAZ因子敲低或过表达PC9细胞株的构建方法。 

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组表达载体在TAZ因子敲低或过表达肺癌细胞的应用。 

针对上述问题，发明人通过TAZ敲低和过表达的PC9细胞系的建立，通过应用基因工程技术，利用TAZ-shRNA和TAZ或过表达质粒转染PC9细胞，建立TAZ敲低的或过表达的PC9细胞株，再利用免疫细胞荧光、RT-PCR和Western blot技术对细胞株 进行检测，证明细胞株建立成功；利用TAZ-shRNA和TAZ过表达载体分别下调和上调TAZ基因在肺癌吉非替尼敏感细胞株的表达，建立TAZ敲低的和过表达的PC9细胞模型，为探讨TAZ在肺癌细胞靶向治疗耐药中的作用提供可行的细胞材料。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 

一种TAZ因子敲低PC9细胞株的shRNA分子，所述shRNA分子的DNA片段的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。 

一种重组载体，其含有上述的TAZ因子敲低PC9细胞株的shRNA分子。 

其中，上述重组载体是将上述的DNA片段插入pGPU6/GFP/Neo载体的多克隆位点构建成的重组表达载体pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA。 

一种TAZ因子过表达PC9细胞株的重组载体，是将TAZ因子的基因片段插入到pEX-2载体的多克隆位点构建成重组表达载体pEX-2-TAZ-over。 

一种重组细胞，含有上述的重组表达载体pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或pEX-2-TAZ-over。 

其中，上述重组细胞为人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA或人肺癌细胞PC9/TAZ-Over。一种TAZ因子敲低PC9细胞株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏编号为CCTCC NO:C2013194，分类命名：人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA，Homo sapiens，human carcinoma of lung。保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。 

一种TAZ因子过表达PC9细胞株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏编号为CCTCC NO:C2013178，分类命名：人肺癌细胞PC9/TAZ-Over，Homo sapiens，human carcinoma of lung。保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。 

一种TAZ因子敲低或过表达PC9细胞株的构建方法，包括以下步骤： 

a）将上述的重组表达载体pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或上述的重组表达载体pEX-2-TAZ-over分别转染PC9细胞得到重组细胞株； 

b）将步骤a）得到的重组细胞株分别经过G418筛选培养基培养，2～3天换一次液，筛选培养21天，获得阳性细胞株；其中，所述的G418筛选培养基10%胎牛血清的DMEM中，加入G418使其终浓度为600μg/ml； 

c）将步骤（d）筛选得到的阳性细胞株，消化成单个细胞后计数，分别取1000个种入10cm的培养板上，G418继续筛选2周后，可在显微镜下观察到转染含目的基因重组载体的细胞长成单克隆细胞团，低倍镜下在培养板底部用记 号笔标出单细胞克隆，将其转入预先加入含600μg/ml G418的DMEM完全培养基的24孔板中，每个转染体系挑取9个单克隆细胞团； 

d）步骤（c）筛选所得的单克隆细胞团，24孔板中细胞生长至80%～90%汇合率时，传代至细胞培养瓶中培养，收集细胞，提取RNA和蛋白质，利用免疫细胞荧光、PCR和Western blot方法检测TAZ的表达阳性细胞株。 

上述的重组载体在TAZ因子敲低或过表达肺癌细胞的应用。 

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：TAZ敲低和过表达的PC9细胞系的建立，为研究TAZ在肺癌靶向治疗敏感性中作用提供了有力的实验材料。构建的TAZ敲低的即已经保藏的人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA和TAZ过表达即已经保藏的人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER，分别有98%以上的细胞表达绿色荧光蛋白，经基因工程技术分别敲低了内源性的TAZ表达量72%，而过表达TAZ为原有水平1.63倍。与母细胞PC9相比，人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA细胞生长缓慢，倍增时间延长，而人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER细胞生长加速，倍增时间缩短。 

附图说明

图1：pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA表达载体的构建示意图； 

图2：TAZ过表达载体的构建示意图； 

图3：为建立TAZ敲低的和过表达的PC9细胞株荧光显微图； 

图4：RT-PCR法对细胞株中的TAZ进行检测图； 

图5：Western blot法对细胞株中的TAZ进行检测图； 

图6：人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA、人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER和母细胞PC9的生长曲线图。 

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 

pGPU6-GFP-Neo及pEX-2：购自上海吉玛公司； 

感受态E.coli DH5α：TaKaRa Code：D9057； 

SOC培养基：1ml2M葡萄糖，过滤灭菌将Bacto胰蛋白胨、Bacto酵母抽提物、NaCl及KCl加到97ml的去离子水中，搅拌溶解，高压灭菌并冷却到室温，加入2M Mg²⁺母液和2M葡萄糖至终浓度20mM，补加消毒蒸馏水至100ml，完全培养基用0.2μm的滤 膜过滤灭菌，最终pH值为7.0； 

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L根据经验值用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4； 

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L； 

普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：天跟生化科技有限公司，DP209-02； 

PC9细胞株：拥有EGFR基因活性突变伴突变P53蛋白表达的人肺腺癌PC9细胞由本实验室保存； 

6孔及12孔培养板：美国Corning公司； 

RPMI DMEM培养基：美国Gibco公司； 

Opti-MEM：美国Invitrogen公司； 

Lipofectamine2000转染试剂盒：美国Invitrogen公司； 

胎牛血清：美国Gibco公司； 

G418：美国Amresco公司； 

胰酶：美国Amresco公司； 

浓缩型DAB试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司； 

TAZ抗体：美国Cell Signaling公司； 

β-actin抗体：美国Cell Signaling公司； 

HRP标记的山羊抗兔二抗：美国Cell Signaling公司； 

质粒提取试剂盒：德国QIAGEN公司； 

实施例1质粒pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA的获得 

1、用Designer3.0（Genepharma）软件进行shRNA设计及合成 

1.1根据上述软件设计并合成针对GENE-BANK上的人类TAZ序列的shRNA DNA片段，shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G。以下是1对TAZ序列的shRNA特异性位点、寡核苷酸链序列，以及阴性对照和阳性对照的寡核苷酸链序列。 

（1）来自genebank的人类TAZ序列的DNA片段： 

5'-AGGTACTTCCTCAATCACA-3' 

TAZ序列shRNA DNA正义链：见SEQ ID NO.1 

5'-CACCGAGGTACTTCCTCAATCACATTCAAGAGATGTGATTGAGGAAGTACCTTTTTTTG-3' 

shRNA DNA反义链：见SEQ ID NO.2 

5'-GATCCAAAAAAAGGTACTTCCTCAATCACATCTCTTGAATGTGATTGAGGAAGTACCTC-3' 

Transcripts：见SEQ ID NO.3 

AGGTACTTCCTCAATCACATTCAAGAGATGTGATTGAGGAAGTACCTTT 

（2）阴性对照 

Negative Control-S:见SEQ ID NO.4 

5'-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3' 

Negative Control-AS:见SEQ ID NO.5 

5'-GATCCAAAAAA 

TTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3’ 

shNC Transcripts Structure:见SEQ ID NO.6 

GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATT 

（3）阳性对照： 

shhGAPDH-S:见SEQ ID NO.7 

5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA 

CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3' 

shhGAPDH-AS:见SEQ ID NO.8 

5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3' 

shhGAPDH Transcripts Structure:见SEQ ID NO.9 

GTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTT 

1.2shDNA模板的退火 

将上述DNA寡核苷酸分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100uM。取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系。 

在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min;85℃5min;75℃5min;70℃5min;4℃保存。退火处理后得到浓度为10μM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200nM，用于连接反应。 

1.3pGPU6/GFP/Neo载体的线性化 

取10ugpGPU6/GFP/Neo载体，按照如下体系进行酶切处理： 

37℃酶切1小时，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng/ul。 

1.4pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA表达载体的构建 

（1）按照如下体系进行载体的连接反应： 

22℃连接2h；获得连接产物。 

（2）转化 

取步骤（1）的5μl连接产物，转化100μl感受态E.coli DH5α，缓慢混匀，冰浴30min，42℃水浴90秒，冰浴2min，加入900μl的SOC培养基，37℃下150转/min摇床培养1h；收集菌液，分100μl和900μl涂布加入100μg/ml Amp的LB固体培养基，37℃过夜培养。 

其中，感受态制备方法及具体转化方法如下： 

感受态细胞的制备：（氯化钙法），参考：分子克隆实验指南第二版55页。 

从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时（旋转摇床，300转／分）。在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。于4℃，以4000转／分离心10分钟，回收细胞。倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。以10ml用冰预冷的0.1mol／L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。于4℃，以4000转／分离心10分钟，回收细胞。倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2（含20%甘油）重悬每份细胞沉淀。将细胞分装成小份（100μl/支），放于-70℃冻存。将连接产物转化感受态细胞，从-70℃中取出感受态细胞，将装有感受态细胞的离心管冰上放置4分钟，待感受态细胞解冻后，加入10μl 连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置30分钟。将离心管放到预加温到42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置90秒，不要摇动离心管。快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟。向每支离心管加入800μl LB培养基（不含抗生素），然后将离心管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45分钟使细菌复苏。取200μl培育后的细胞均匀涂布于含50μg/mlKanamycin LB平板上。等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。 

（3）阳性克隆的鉴定与测序 

每块平板上挑取5个菌落，接种到含50ug/ml Kanamycin的LB培养基中，37℃培养16小时。 

使用碱裂解法抽提质粒，用质粒小提试剂盒（天根生化，DP104-02）抽提质粒，（质粒抽提步骤详见质粒小提试剂盒说明书）。 

所得质粒用BamH I，Pst I分别酶切鉴定。阳性重组载体应该可以被BamH I切开，而不能被Pst I切开。酶切结果正确的挑两个送去测序。送去凯基公司测序，测序结果正确，证明最终获得阳性质粒，将其命名为pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA。 

实施例2.质粒pEX-2-TAZ-over的获得 

1.用PCR方法得到TAZ序列片段 

oligo设计，目的基因TAZ上下游引物分别加上EcoRI和BamHI及保护碱基，用于载体的亚克隆，oligo序列如SEQ ID NO:10～63中的B775-1～B775-54。 

引物由上海吉玛制药技术有限公司合成，将上述oligo溶解成50μM，将oligo分别取相同体积至一1.5ml离心管，混合均匀，配成oligo mix。 

用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，PCR体系如下： 

循环条件： 

用B775-1和B775-54进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物。 

PCR体系如下： 

第一轮PCR产物	1μl
		10×Pfu Buffer(＋Mg2＋)	5μl
dNTP	1μl
		B775-1	1μl
B775-54	1μl
		ddH2O	41μl
Pfu DNA聚合酶	0.3μl

反应条件与第一轮相同。第一轮PCR可得到混有目的基因条带的非单一条带PCR产物混合物，再用第一轮的PCR产物为模板，通过第二轮PCR则可获得单一的目的基因条带。PCR反应完成后，利用琼脂糖凝胶电泳并切胶回收TAZ基因片段。 

2.目的基因TAZ克隆到载体pEX-2中 

用EcoRI和BamHI对TAZ基因片段进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下： 

10×Buffer	5μl
		DNA	15μl
EcoRI	1μl
		BamHI	1μl
ddH2O	28μl

用EcoRI和BamHI对载体pEX-2进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下： 

10×Buffer

5μl

pEX-2	5μl
		EcoRI	1μl
BamHI	1μl
		ddH2O	38μl

电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收TAZ基因片段和载体pEX-2。用T4DNA ligase连接双酶切得到的TAZ基因片段和线性化的载体，22℃连接2小时，连接体系如下： 

T4DNA ligase buffer	2μl
		pEX-2	2μl
TAZ	5μl
		T4DNA ligase	1μl
ddH2O	10μl

感受态细胞的制备：（氯化钙法），见实施例1。将连接产物转化感受态细胞，见实施例1。从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆。从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml（含50μg/mlKanamycin）LB培养基的试管中。将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250转/分钟，培养16小时。将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒（天根生化，DP104-02）抽提质粒，（质粒抽提步骤详见质粒小提试剂盒说明书）。将抽提好的质粒进行双酶切鉴定，每管反应体系如下： 

10×Buffer	1μl
		质粒	1μl
EcoRI	0.5μl
		BamHI	0.5μl
ddH2O	7μl

酶切37℃，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆质粒pEX-2-TAZ-over。 

实施例3质粒pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA及pEX-2-TAZ-over分别转染PC9细胞 

（a）转染前一天将对数期生长的细胞接种入6孔板中，根据细胞形态及生长速度，每孔种3×10⁵个细胞，置于10%胎牛血清RPMI DMEM完全培养基中，37℃，5%CO₂ 饱和度培养箱中过夜培养20h～24h，使转染时每孔细胞汇合率约70%～90%。 

（b）按照Lipofectamine2000Reagent试剂进行转染①将5μl转染试剂加入145μlOpti-MEM培养基中，枪头混匀，②将2.5μg质粒加入150μl Opti-MEM培养基中，枪头混匀，将②加入到①中，混匀后静置20min，以允许DNA-脂质体复合物形成。用Opti-MEM培养基洗涤细胞一次，每孔加入1.7ml无血清和抗生素的DMEM培养基，再逐滴加入300μl上述混合物，轻轻混匀，37℃，5%CO₂，培养48h。荧光显微镜下观察GFP表达。 

实施例4阳性细胞株的筛选 

G418筛选：转染细胞系加入含600μg/mL G418，10%胎牛血清的DMEM培养基，2d～3d换一次液，筛选培养21d，直至出现抗性克隆，换不含G418的正常培养基。 

将筛选得到的多克隆细胞，消化成单个细胞后计数，取1000个种入10cm的培养板上，G418继续筛选2周后，可在显微镜下观察到转染含目的基因重组载体的细胞长成单克隆细胞团。低倍镜下在培养板底部用记号笔标出单细胞克隆。 

在超净台内，弃去培养皿内的培养基，用PBS清洗后加入胰酶消化，待观察到细胞变圆后，吸走胰酶，并再用PBS洗一遍，然后倾斜培养板，用10μl移液器吸取10μl胰酶点在细胞团上，反复吹打，待细胞吹下来后，将其转入24孔板中（预先加入含600μg/mlG418的RPMI DMEM完全培养基），每个转染体系挑取9个左右的单克隆细胞团。 

待24孔板中细胞生长至80%～90%汇合率时，传代至细胞培养瓶中培养。 

实施例5.阳性细胞株的检测 

1.免疫细胞荧光对细胞株中TAZ进行检测 

细胞荧光检测：由于转染的质粒中带有绿色荧光蛋白（GFP）基因，转染成功后即可以在荧光显微镜下观察到GFP。 

荧光显微镜下观察PC9细胞、以及分别经pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA及pEX-2-TAZ-over质粒转染的PC9细胞的情况，从图3中可见，图3中左上为PC9细胞， 即对照组细胞没有转染质粒，因此无GFP表达，图3中右上为成功转染了空载体pEX-2-TAZ-over的PC9细胞，发现转染的细胞株中有GFP表达，荧光显微镜下呈现绿色荧光；图3中左下为转染pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA质粒的PC9细胞，发现细胞株中有GFP表达，荧光显微镜下呈现绿色荧光，证明转染成功。 

2.RT-PCR技术检测TAZ基因表达 

（a）RNA的提取：将受试样品细胞直接加1ml TRIzol进行吹打，直至细胞充分裂解。然后，将裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；12,000g，4℃离心10min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中。裂解液中加入氯仿（每使用1ml TRIzol加0.2ml氯仿），盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s，溶液呈乳白状，无分层现象，室温静置3min；12,000g，4℃离心15min；取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相移至另一EP管，向得到的上清水相中加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；12,000g，4℃离心10min；小心去除上清，缓慢沿管壁加入1ml75％的乙醇（用DEPC处理过的水配制），轻轻混匀。每使用1ml Trizol试剂至少加1ml75％的乙醇；12,000g，4℃离心10min；小心吸尽上清；室温干燥沉淀2～5min，加入30～50μl的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70℃保存。 

（b）RNA浓度和纯度的测定：取RNA样品用1×TE Buffer稀释样品100倍或适当的倍数，测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。按以下计算：RNA的浓度=OD₂₆₀×稀释倍数×0.04μg/μl，OD_260/280在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度较高。 

（c）RT-PCR反应实验：RT反应（25μl体系）：①取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，依次加入RNA（2μg）、OligodT（10μM）1μl、无核酸酶的双蒸水至总体积15μl；②75℃保温5min，然后冰浴5min；③往步骤①中的0.2ml PCR管依次加入下列组份：RNase抑制剂（40u/μl）0.5μl、10×AMV Reaction Buffer2μL、dNTPs（10mM）1.5μl、DTT（200uM）1μl、逆转录酶（AMV）1μl、无核酸酶的双蒸水至总体积25μl，轻轻混匀后，然后2000rpm离心20s；④先在42℃保温1h，然后85℃保温10min，然后置于冰上5min；上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。 

（d）PCR反应：①引物序列：TAZ Forward：AGTACCCTGAGCCAGCAGAA，TAZReverse：GATTCTCTGAAGCCGCAGTT，PCR产物大小为：127bp；GAPDH Forward：CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA，GAPDH Reverse：GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC，PCR产物大小为：251bp。②取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，在冰上依次加入：灭菌双蒸水至总体积50μl、10×Taq Buffer5μl、dNTPs（10mM）1μl、引物Forward（10μM）2μl、引物Reverse（10μM）2μl、cDNA（RT 反应产物）模板2μl、Taq DNA Polymerase0.5μl、MgCl₂（25mM）4μl。③PCR扩增条件：TAZ：第一阶段：95℃×5min；第二阶段：95℃×40s、58℃×30s、72℃×35s，32个循环；第三阶段：72×10min。GAPDH：第一阶段：95℃×5min；第二阶段：95℃×40s、56℃×30s、72℃×35s，32个循环；第三阶段：72×10min。反应结束后，取反应液5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。 

图4为PCR检测转染后PC9细胞中TAZ的表达，pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA转染组细胞中TAZ的表达低于对照组，TAZ表达量为母细胞PC9细胞42%；pEX-2-TAZ-over转染组细胞中TAZ的表达高于对照组，TAZ表达量为母细胞PC9细胞1.48倍。 

3.Western Blot检测基因表达变化 

利用Western Blot检测发现有蛋白印迹的条带，即为细胞株中存在TAZ表达，蛋白印迹的条带变淡即为TAZ敲低成功。不同组细胞分别用PBS冲洗两次，加入细胞裂解液（1×10⁷个细胞/500μl），得到细胞全蛋白，采用Bradford法测定全细胞蛋白质的浓度。10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，加入相应一抗：TAZ（1：500）、β-actin（1：8000）4℃，过夜，室温TBST洗PVDF膜，与含HRP标记的二抗，于室温平缓摇动孵育60min，HRP标记羊抗鼠IgG用TBST溶液以1：3000稀释，HRP标记的羊抗兔IgG用TBST溶液以4000稀释；TBST溶液洗PVDF膜10次，ECL显色，进行X光胶片感光，冲洗胶片。扫描仪和凝胶成像系统记录相应条带的透色光积分吸光度值。 

图5为Western Blot检测转染后PC9细胞中TAZ的表达，pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA转染组细胞中TAZ的表达低于对照组，TAZ表达量为母细胞28%；pEX-2-TAZ-over转染组细胞中TAZ的表达高于对照组，TAZ表达量为母细胞1.63倍；提示TAZ敲低的PC9细胞株人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA和过表达的人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER建立成功，可以用于其他实验研究。 

4.不同TAZ表达的PC9细胞株的生长曲线图 

接种对数生长期的细胞以1×10⁴个/ml于24孔细胞培养板中，利用DMEM+10%NCS培养基在37℃的5%CO₂培养箱中培养，每天对细胞进行计数，每次三个平行孔。每次先弃去培养基，用PBS缓冲液以500μl/孔的量清洗细胞两次，再加500μl/孔的胰蛋白酶消化细胞，利用血球计数板对细胞进行计数，绘制生长曲线。 

建立TAZ敲低的和过表达的PC9细胞株；人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA代表了转染 pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA质粒的PC9细胞株，人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER代表转染了pEX-2-TAZ-over质粒的PC9细胞株； 

图6见人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER生长曲线区别于PC9细胞，增殖速度增加；人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA生长曲线也区别于PC9细胞，增殖速度减慢。 

5.不同TAZ表达的PC9细胞倍增时间比较 

对通过上述方法检测得到的细胞数量和绘制的细胞生长曲线进行计算，利用倍增时间公式：T₄=T×lg₂/lg（N/N₀）计算，其中T_d为倍增时间，T为所取的对数生长期的天数，N₀为对数生长期首天的细胞数，N为对数生长期末天的细胞数。 

当利用免疫细胞荧光检测发现细胞呈现绿色荧光反应说明转染成功，利用RT-PCR和Western blot检测发现PC9细胞株中存在TAZ表达，且人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA细胞株中TAZ敲低成功，而人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER细胞株中TAZ过表达成功。 

发明人构建的TAZ敲低的即人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA和TAZ过表达的即人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER，分别有98%以上的细胞表达绿色荧光蛋白，经基因工程技术分别敲低了内源性的TAZ表达量72%，而过表达TAZ为原有水平1.63倍。与母细胞PC9相比，人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA细胞生长缓慢，倍增时间延长，而人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA细胞生长加速，倍增时间缩短。提示TAZ的表达可以对PC9细胞的增殖产生一定的影响，其应用方向： 

（1）研究Hippo信号关键转录因子TAZ对靶向治疗敏感肺癌细胞的生物学行为影响及其机制：观察TAZ敲低和过表达后，细胞的生长状况及其功能改变，探讨TAZ在靶向治疗敏感肺癌细胞的生长、增殖、分化中的作用及其机理。 

（2）研究TAZ在EGFR介导信号通路中的作用：探讨TAZ敲低和过表达后，EGFR信号通路的变化，寻找潜在的药物靶点。 

Claims (10)

1.一种TAZ因子敲低PC9细胞株的shRNA分子，其特征在于，所述shRNA分子的DNA片段的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。 

2.一种重组载体，其含有权利要求1所述的TAZ因子敲低PC9细胞株的shRNA分子。 

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将权利要求1所述的DNA片段插入pGPU6/GFP/Neo载体的多克隆位点构建成的重组表达载体pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA。 

4.一种TAZ因子过表达PC9细胞株的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将TAZ因子的基因片段插入到pEX-2载体的多克隆位点构建成重组表达载体pEX-2-TAZ-over。 

5.一种重组细胞，含有权利要求3或4所述的重组表达载体pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或pEX-2-TAZ-over。 

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA或人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER。 

7.一种TAZ因子敲低PC9细胞株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏编号为CCTCC NO:C2013194，分类命名：人肺癌细胞PC9/TAZ-shRNA。 

8.一种TAZ因子过表达PC9细胞株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2013年12月3日，保藏编号为CCTCC NO:C2013178，分类命名：人肺癌细胞PC9/TAZ-OVER。 

9.一种TAZ因子敲低或过表达PC9细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 

a）将权利要求3所述的重组表达载体pGPU6-GFP-Neo-TAZ-shRNA或权利要求4所述的重组表达载体pEX-2-TAZ-over分别转染PC9细胞得到重组细胞株； 

b）将步骤a）得到的重组细胞株分别经过G418筛选培养基培养，2～3天换一次液，筛选培养21天，获得阳性细胞株；其中，所述的G418筛选培养基10%胎牛血清的DMEM中，加入G418使其终浓度为600μg/ml； 

c）将步骤（d）筛选得到的阳性细胞株，消化成单个细胞后计数，分别取1000个种入10cm的培养板上，G418继续筛选2周后，可在显微镜下观察到转染含目的基因重组载体的细胞长成单克隆细胞团，低倍镜下在培养板底部用记号笔标出单细胞克隆，将其转入预先加入含600μg/ml G418的DMEM完全培养基的24孔板 中，每个转染体系挑取9个单克隆细胞团； 

d）步骤（c）筛选所得的单克隆细胞团，24孔板中细胞生长至80%～90%汇合率时，传代至细胞培养瓶中培养，收集细胞，提取RNA和蛋白质，利用免疫细胞荧光、PCR和Western blot方法检测TAZ的表达阳性细胞株。 

10.权利要求2或3或4所述的重组载体在TAZ因子敲低或过表达肺癌细胞的应用。 

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