CN103215268B

CN103215268B - 一种针对人fascin-1基因的siRNA及其应用

Info

Publication number: CN103215268B
Application number: CN201310004333.7A
Authority: CN
Inventors: 高伟; 王斌全; 张春明; 温树信; 皇甫辉; 陈钢钢; 张海利
Original assignee: First Hospital of Shanxi Medical University
Current assignee: First Hospital of Shanxi Medical University
Priority date: 2013-01-07
Filing date: 2013-01-07
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-01-07
Also published as: CN103215268A

Abstract

本发明公开了一种针对人fascin-1基因的siRNA及其应用，属于生物工程技术领域，解决肿瘤细胞fascin-1恶性增殖、侵袭、转移的问题。一种针对人fascin-1基因的siRNA，包括以下序列：正义链：5′-CGACTATAACAAGGTGGCCATtt-3′；反义链：5′-ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt-3′。本发明针对fascin-1基因表达的siRNA，可抑制肿瘤细胞恶性增殖、侵袭、转移的恶性生物学表型，可广泛用于抑制人肿瘤细胞系的恶性表型研究，用于制备治疗抗肿瘤的生物靶向制剂或者药物。

Description

一种针对人fascin-1基因的siRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种针对人fascin-1基因的siRNA及其应用。

背景技术

喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，起源于喉黏膜上皮，病死率较高。据北美和欧洲流行病学研究显示，其发病率为7.0-13.2/10万人，近20年呈上升趋势。在肿瘤细胞的生物学特征中，以侵袭转移最为关键。据临床统计，有80%以上的肿瘤患者死于侵袭转移，而未有侵袭转移者，则预后较好。然而喉腔由于其解剖结构局限，并具有丰富淋巴组织等特点，使得喉鳞癌具有局部浸润及颈部淋巴结转移的恶性生物学行为，使得局部复发及转移成为患者5年内死亡的主要原因。

fascin-1（FSCN1）即聚束蛋白，是一种肌动蛋白结合蛋白，定位于染色体7p22，分子量为55kD，有两个与F-肌动蛋白结合位点，可通过增加细胞膜突起、改变细胞与细胞外基质的粘附以及通过细胞信号传导通路等途径促进肿瘤细胞侵袭转移。Exp Cell Res. 2002,275(1):92-109.和Gene Expr Patterns. 2004,4(6):637-643记载了现已知人类fascin有3种不同形式：fascin-1，主要表达于间叶组织和神经系统；fascin-2，特异表达于视网膜；fascin-3，在睾丸中特异表达。

细胞骨架对上皮细胞迁移和黏附具有重要作用，在上皮源性肿瘤侵袭和转移过程中，细胞骨架不仅会重组变化，还可导致胞内信号传导异常，成为恶性增殖及侵袭转移的重要初始因素。fascin-1作为细胞骨架结构中的重要分子，不仅在肿瘤细胞多种恶性生物学行为中发挥重要作用，还与患者不良临床病理特征及预后相关。

研究发现fascin-1在乳腺、卵巢、胰腺、胃、胆管、结肠等正常被覆单层柱状上皮中呈阴性表达，在食管复层鳞状上皮中，仅在基底层细胞中呈低表达，上层细胞中未见表达。fascin-1在交界性、原发性及转移性卵巢癌上皮病变中均出现表达，尤其是在转移性卵巢癌中表达更为弥漫；其在非小细胞肺癌中表达上调，并与肿瘤分化程度呈正相关，在大多血管癌栓中特有而普遍表达，尤其在发生对侧胸或远处转移的肺腺癌中与fascin-1弥漫表达明显相关；在结肠原位癌、浸润至肌层、全层癌组织，fascin-1表达逐渐增强，并且有区域淋巴结转移的结直肠癌中fascin-1表达阳性率明显高于无淋巴转移组，尤其是转移癌中fascin-1表达水平高于原位癌；在食管癌中fascin-1高表达与患者预后、肿瘤浸润深度及淋巴结转移相关。因此，fascin-1的确与上皮源性肿瘤的恶性程度及侵袭转移等恶性进展过程密切相关，fascin-1与喉鳞癌侵袭转移、复发及预后不良相关。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的转录后基因沉默机制。其作用机制是：RNase III核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21-23nt及3′端突出的小干扰RNA（smallinterfering RNA，siRNA），随后siRNA与RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA 的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学的研究中。

然而目前还没有针对fascin-1基因设计的siRNA报道。申请人为了对肿瘤细胞fascin-1进行干扰，设计了针对fascin-1基因的siRNA，从而抑制肿瘤细胞恶性增殖、侵袭、转移的恶性生物学表型，可能成为肿瘤靶向治疗的有药物。

发明内容

本发明是为了解决肿瘤细胞fascin-1恶性增殖、侵袭、转移的问题，而提供了一种针对人fascin-1基因的siRNA及其应用，从而达到抑制其恶性增殖、侵袭、转移的恶性生物学表型，可能成为肿瘤靶向治疗的有药物的目的。

本发明针对fascin-1基因设计siRNA，通过干扰技术，抑制fascin-1表达，通过荧光实时定量PCR（qRT-PCR），通过包含细胞活力、克隆形成、黏附能力、侵袭能力、迁移能力的细胞功能实验，评价本发明siRNA的沉默靶向基因fascin-1效果。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种针对人fascin-1基因的siRNA，其序列为：

正义链：5′-CGACTATAACAAGGTGGCCATtt-3′

反义链：5′-ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt-3′。

进一步地，所述的3′端悬挂由脱氧核苷组成的碱基TT，用于提高基因沉默效率以及siRNA的稳定性。

本发明还进一步提供了将上述siRNA在制备治疗抗肿瘤的生物靶向制剂或者药物上的应用。

fascin-1的RNA序列如序列1所示。

与现有技术相比，本发明针对fascin-1基因表达的siRNA，可抑制肿瘤细胞恶性增殖、侵袭、转移的恶性生物学表型，可广泛用于抑制人肿瘤细胞系的恶性表型研究，用于制备治疗抗肿瘤的生物靶向制剂或者药物。

附图说明

图1：原始状态下Hep-2及HOK细胞株中fascin-1相对表达量柱状图；

图2：No.1-3 fascin-1 siRNA 转染Hep-2后fascin-1相对表达量柱状图；

图3：No.1-3 fascin-1 siRNA 对fascin-1敲减率柱状图；

图4：Hep-2转染siRNA NC后粘附图；

图5：Hep-2转染No.3 siRNA fascin-1后粘附图；

图6：Hep-2转染siRNA NC后迁移能力图；

图7：Hep-2转染No.3 siRNA fascin-1后迁移能力图；

图8：Hep-2转染siRNA NC后侵袭能力图；

图9：Hep-2转染No.3 siRNA fascin-1后侵袭能力图；

图10：Hep-2转染No.3 siRNA NC后平板克隆能力图；

图11：Hep-2转染No.3 siRNA fascin-1后平板克隆能力图；

图12：Hep-2分别转染siRNA NC及No.3 siRNA fascin-1后细胞活力曲线图。

具体实施方式

本申请所涉及的全部实验经过山西医科大学科学研究伦理委员会批准。

实施例1 fascin-1蛋白在喉鳞癌组织及对应正常癌旁黏膜组织中的表达

石蜡包埋组织行4 μm连续切片，脱蜡后水化；置柠檬酸盐缓冲液高压修复，3%过氧化氢甲醇溶液封闭10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次；加封闭液10 min，一抗4℃孵育过夜；PBS Tween 20液洗3次，二抗孵育15～20 min，PBS洗3次，二氨基联苯胺（DAB）显色；苏木素复染并脱水封片；PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性标本肺鳞癌作阳性对照，血管内皮细胞作内对照；鼠抗人单抗fascin-1（MS-1112）购自美国赛默飞世公司；MaxVision羊抗鼠二抗为福州迈新产品，封闭血清及DAB为武汉博士德产品。

免疫组化评价标准：fascin-1：阳性细胞＜10%，1分；11%～50%，2分；51%～80%，3分；＞81%，4分。浅着色1分；中等着色2分；强着色3分。两者分数相加（2～7分），共分为3组：阴性表达（不着色或＜10%细胞阳性着色，不考虑着色强度），低表达（3分），高表达（4～7分）（参见：Eur J Cancer Prev, 2010,19:11-17.）。

结论为fascin-1高表达不仅与喉鳞癌的恶性进展正相关，还预示着复发风险及预后不良（参见：中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2012,47(10):841-847. ）。

实施例2 喉鳞癌细胞株Hep-2及正常人口咽黏膜角化细胞株HOK中fascin-1mRNA及蛋白表达

一、细胞培养

将水浴锅预热至37℃；用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面；在超净工作台中按次序摆放无菌离心管、吸管、培养瓶等；取出冻存管；迅速解冻，迅速将冻存管投入到已经37℃预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体在2分钟内迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候，取出；用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内；制备细胞悬液，将细胞转移至一个15ml离心管内，逐渐加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到10ml以上；在低速离心机上离心，以800rpm离心5分钟；吸去上清，然后用1ml培养基重悬细胞；将细胞悬液分装入培养皿内，将培养皿放入37℃培养箱内培养，换液的时间由细胞贴壁情况而定。Hep-2用含1%青霉素链霉素双抗，10%FBS（胎牛血清）的MEM培养基进行培养。

HOK细胞（正常人口咽黏膜角化细胞）用含1%青霉素链霉素双抗，10%FBS（胎牛血清）的OKM培养基进行培养；Hep-2细胞系购自，HOK细胞系购自美国ScienCell Research Laboratory公司。

二、细胞传代

紫外线提前20－30min打开；关紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯；检查细胞生长状况；显微镜下观察各浓度下细胞生长状况（数量、形态、透亮度、贴壁情况）；用酒精棉对培养瓶外部进行擦拭；将培养基倒掉，加PBS冲洗一下，如不需传代，加入5ml新鲜培养基即可；传代加1.0ml 0.25%胰酶冲洗一下（快速）；放入37℃培养箱2-3分钟，轻敲瓶壁使大部分细胞脱落，加入3n（n为传代瓶数）ml培养基（MEM）；用吸管轻柔吹打，尽量让细胞均匀分散开来，补足培养基3n ml，各取出3ml至新瓶中；放入CO2培养箱（培养条件5％CO₂、饱和湿度37℃）。

三、总RNA抽提

收集目标细胞，用EDPC配置的PBS液冲洗2-3次，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，使组织充分裂解，静置5min；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置2min；4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase-free EP管；沉淀RNA：加入等体积的异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min；4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入60μl DEPC水溶解沉淀。

四、去基因组

使用RNase-free的DNase І（Promega公司），按表1体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。

然后按以下步骤操作：加入等体积的苯酚，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心5min，取上清。加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心10min，取上清。加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20℃静置15min；4℃下，10,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入15-40μl DEPC水溶解沉淀。

五、总RNA纯度和完整性检测

纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus Eppendorf核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，条带完整说明总RNA抽提比较完整。

六、逆转录反应

在RNase free的PCR管中配置如表2下列溶液：

将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性；随后立即冰上制冷，以防止RNA复性；在该PCR管中加入下列试剂（Promega），见表3。

将上述20μl反应溶液30℃保温10min；42℃保温60min；85℃保温10mn。

七、定量PCR

检测序列片段大小: 18S内参片段为112bp，目的片段为139bp引物序列见表4。

反应体系见表5，

反应条件如下：

融解曲线分析：温度60℃-95℃；每个样重复3次；定量PCR用的SYBR Green PCR Master Mix购自TOYOBO公司；定量PCR仪：ABI PRISM^® 7500 Sequence Detection System。

八、定量PCR结果的分析

实验得到的CT值，按照2^- ^ΔΔ ^CT法计算各组mRNA的相对表达量（参见：Methods 2001(25): 402-408.）。

经过检测，发现fascin-1在Hep-2中的相对表达含量是HOK细胞系的5.68-6.46倍（P<0.05），说明在喉鳞癌细胞系Hep-2中fascin-1表达上调，适合作为fascin-1调控的细胞模型。原始状态下Hep-2及HOK细胞株中fascin-1相对表达量柱状图如图1所示。

实施例3 fascin-1siRNA在Hep-2中的转染以及有效siRNA的筛选

一、siRNA设计：

利用美国Ambion公司siRNA在线设计具（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_

finder.html），并依据siRNA设计原则，针对人NCBI基因数据库中fascin-1 mRNA（NM_003088.3）序列进行siRNA序列设计，并将候选的靶序列提交BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）网站，经过序列同源性BLAST分析，证明所设计的干扰序列与其他基因无同源性，以确保干扰靶基因的特异性。

设计的序列为：

No.1

正义链：5′-CAAAGACTCCACAGGCAAAtt-3′

反义链：5′-TTTGCCTGTGGAGTCTTTGtt-3′

No.2

正义链：5′-CGACTATAACAAGGTGGCCATtt-3′

反义链：5′-ATGGCCACCTTGTTATAGTCGtt-3′

No.3

正义链：5′-CAAGTTTGTGACCTCCAAGAAtt-3′

反义链：5′-TTCTTGGAGGTCACAAACTTGtt-3′

序列由大连宝生物公司合成；siRNA NC无义序列购买于上海吉凯基因化学技术有限公司。

二、细胞转染siRNA

转染前一天对细胞进行传代，使其汇合度为30%-50%，转染采用Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂（Invtrigen公司），siRNA工作浓度为50nM，转染时使用Opti-MEM（Invtrigen公司）培养基。

转染后4小时换为含10%FBS及1%青链霉素双抗的细胞生长培养基。实验分组见表6。

三、总RNA提取，逆转录及PCR反应步骤及试剂同前。

四、结果

分别转染三条siRNA（No.1，No.2，No.3）后，将cell组作为校正组，经2^- ^ΔΔ ^CT法计算每个转染组fascin-1mRNA的相对表达含量，结果见表7及图2；其中转染No.3 siRNA后fascin-1相对表达含量最低，其敲减率为11.18-86.2%，见表8图3；通常选择敲减效率大于80%的siRNA，因此选取No.3 siRNA进行后续细胞功能研究。敲减率=（cell组2^- ^ΔΔ ^CT值-实验组2^- ^ΔΔ ^CT值）/实验组2^- ^ΔΔ ^CT值×100%。

实施例4 粘附能力检测

用96孔板，每孔加入30mg/L的FN（美国sigma公司）50ul，置超净台上过夜风干，制成FN包被待用；使用前用3%BSA的PBS液化，20ul置37℃ 2小时封闭；每孔加入含10%FBS 0.5×10⁶个/ml的细胞200ul，培养1-1.5小时后，分别以PBS洗2便，以洗去未黏附的细胞；用MTS（Promega公司）检测，后用酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，型号multiscan MK3）测定OD490吸光值，每组设6个复孔，此值与细胞数量成正比；结果表明，转染No.3 fascin-1

后Hep-2的粘附能力明显减弱，见表9及图4、5。

实施例5 Transwell检测细胞迁移能力

细胞转染siRNA第二天，计数1*10⁵个细胞，用100ul无血清DMEM-F12、MEM培养基重悬，加入Transwell小室上室（BD公司），在下室加入600ul完全培养基；在37℃，5%CO₂孵育24、48小时分别，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10min，PBS洗涤一次，用33%醋酸洗脱，后用酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，型号multiscan MK3）测定OD570吸光值，此值与细胞数量成正比；结果表明转染No.3 fascin-1后Hep-2的迁移能力明显减弱，见表10及图6、7。

实施例6 Transwell检测细胞侵袭能力

4℃溶解Matrigel胶（BD公司）过夜，用预冷的无血清培养基以1:3的体积比稀释matrigel，取40ul加入预冷的Transwell小室中（BD公司），37℃孵育2h使Matrigel胶凝固；吸走小室中多余的液体，并在上室、下室分别加入100ul、600ul无血清培养基，37℃平衡过夜；细胞转染siRNA第二天，计数1*10⁵个细胞，用100ul无血清DMEM-F12、MEM培养基重悬，加入Transwell小室上室，在下室加入600ul完全培养基；在37℃，5%CO₂孵育24、48小时后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10min，PBS洗涤一次，检测细胞是否穿过小孔，如有穿过终止其他实验组，并拍照；用结晶紫染色的上室下表面细胞，用33%醋酸洗脱，后用酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，型号multiscan MK3）测定OD570吸光值，此值与细胞数量成正比。结果表明转染No.3 fascin-1后Hep-2的侵袭能力明显减弱，见表11及图8、9。

实施例7 克隆形成实验

在细胞转染48小时后用胰酶消化收集不同组的细胞，用1毫升培养基重悬细胞计数。吹打成单细胞悬液，细胞计数，将细胞稀释成1×10⁴cell/ml，再稀释成1×10³cell/ml接种于96孔板，吸50ul接种即50cell/孔，吸100ul接种即100cell/孔，吸200ul接种即200cell/孔。接种完毕，各孔补加培养基至300ul/孔。水平位左右前后晃动培养板，尽量使孔内细胞分布均匀。培养7天后，吸去各孔培养基，PBS或生理盐水漂洗2次，各孔加200ul结晶紫染色液应充分覆盖孔底，20min后将96孔板置于自来水下冲洗，注意水流要缓慢，冲洗后晾干，计算集落数。集落计数使用ELISPOT酶联免疫斑点仪器（AID iSpot system公司）。Hep-2细胞转染siRNA后相对克隆形成倍数，经cell组均一化。结果表明转染No.3 fascin-1后Hep-2的克隆能力明显减弱，见表12及图10、11。

实施例8 MTS检测细胞增殖

取各组细胞进行下面实验。消化细胞后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为1×10⁴个。贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测。收集各个时间点的细胞（0h，24h，48h，72h）加入MTS（Promega公司），比例为1/10，即100ul培养液加入10ul检测液。在孵育4小时后，酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，型号multiscan MK3）读板，读取OD490数据，此值与细胞活力成正性关系。每组设三个副孔。细胞接种后立即测定0h的OD值，24h、48h、72h分别测定每组OD值，计算增殖率，增殖率=（其他时间点OD值/0h OD值×100%）。结果显示转染No.3 fascin-1后Hep-2的细胞增殖率明显降低，以48h及72h为著，见表13及图12。

各项实验均表明，本发明涉及的siRNA能够有效抑制人fascin-1基因的表达，并能够显著抑制喉鳞癌细胞系Hep-2细胞活力，细胞粘附迁移、侵袭、克隆能力，不仅为研究fascin-1基因在肿瘤中的功能与机制提供有效工具，还为靶向fascin-1的抗肿瘤药物的制备提供依据。

<110> 山西医科大学第一医院

<120> 一种针对人fascin-1基因的siRNA及其应用

<160> 2761

<210> 1

<212> RNA

<213> 人（Homo sapiens）

1 agctgggctt tgtggagcgc tgcggagggt gcgtgcgggc cgcggcagcc gaacaaagga

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2281 ggcgggcggg taggggtgtg ggggccgtct tcctcctgtc tctttccttt caccctagcc

2341 tgactggaag cagaaaatga ccaaatcagt atttttttta atgaaatatt attgctggag

2401 gcgtcccagg caagcctggc tgtagtagcg agtgatctgg cggggggcgt ctcagcaccc

2461 tccccagggg gtgcatctca gccccctctt tccgtccttc ccgtccagcc ccagccctgg

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2641 ccctgctgcc agcctccccc gtccccaaca tgcatctcac tctgggtgtc ttggtctttt

2701 attttttgta agtgtcattt gtataactct aaacgcccat gatagtagct tcaaactgga

2761 aatagcgaaa taaaataact cagtctgcag ccccagaaaa aaaaaaaaaa aa

Claims

1.一种针对人fascin-1基因的siRNA在制备体外抑制喉鳞癌细胞系Hep-2细胞恶性表型试剂中的应用，所述恶性表型是指抑制Hep-2细胞的细胞活力、黏附能力、迁移能力和侵袭能力；

该siRNA包括以下序列：

正义链：5′-CAAGTTTGTGACCTCCAAGAAtt-3′

反义链：5′-TTCTTGGAGGTCACAAACTTGtt-3′；

序列3′端悬挂由脱氧核苷组成的碱基TT，用于提高基因沉默效率以及siRNA的稳定性。