CN103667295B - 一种抑制FOXC1基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制人FOXC1基因表达的siRNA分子及其应用，属于分子生物学领域。一种抑制FOXC1基因表达的siRNA，其序列为：正义链：5′-CGGACAAGAAGATCACCCTtt-3′，反义链：5′-AGGGTGATCTTCTTGTCCGtt-3′。本发明siRNA能够有效抑制人FOXC1基因的表达，并能够显著抑制喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177细胞增殖、克隆能力，以及细胞的迁移及侵袭能力，可用于靶向FOXC1的抗喉癌药物的制备。

Description

一种抑制FOXC1基因表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种抑制人FOXC1基因表达的siRNA分子及其应用。

背景技术

喉癌是一种发生在喉黏膜上皮的恶性肿瘤，好发于50～60岁男性，是头颈部第二常见的原发恶性肿瘤，病理类型以鳞状细胞癌为主，约占90%以上。

喉癌起源于喉黏膜上皮，位居头颈部常见恶性肿瘤第二位，病死率较高。我国部分省份的发病率为1.5-3.4/10万人，近20年呈上升并有年轻化趋势。由于喉腔具有解剖结构局限及淋巴组织等丰富的特点，侵袭转移成为其显著恶性生物学特征。喉鳞癌局部复发及转移是患者5年内死亡的主要原因，据临床统计，有80%以上的肿瘤患者死于侵袭转移，而未有侵袭转移者，则预后较好。

人类FOXC1基因是叉头框转录因子基因家族（FOX家族）的一员。FOXC1基因长度为1.6kb，位于人类染色体6p25基因编码区，编码的蛋白质共有553个氨基酸残基的蛋白质。在乳腺癌、子宫内膜癌等研究中发现，FOXC1可以促进癌细胞的增殖、侵袭及迁移，这些研究同时指出FOXC1促进癌细胞侵袭及迁移的作用可能是通过参与EMT（上皮－间质转化），从而导致EMT相关的分子标记表达变化，且FOXC1的高表达提示预后较差。现代肿瘤医学,2012,20:930-933.记载了FOXC1蛋白在喉鳞状细胞癌中表达及临床意义，FOXC1蛋白在喉鳞癌组织中阳性表达率明显高于癌旁正常切缘组织，它可能在喉鳞癌的侵袭、转移过程中发挥重要作用。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的转录后基因沉默机制。其作用机制是：RNase III核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21-23nt及3′端突出的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA），随后siRNA与RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencingcomplex，RISC）结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学的研究中。设计针对人FOXC1基因的siRNA，对肿瘤细胞中FOXC1进行干扰，从而抑制肿瘤细胞恶性增殖、侵袭、转移的恶性生物学表型，可能成为抗肿瘤靶向治疗的有效药物。

发明内容

本发明的目的在于利用RNA干扰技术，针对FOXC1基因设计siRNA，抑制FOXC1表达。

本发明的另一个目的在于提供上述抑制FOXC1基因表达的siRNA的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种抑制FOXC1基因表达的siRNA，其序列为：

正义链：5′-CGGACAAGAAGATCACCCTtt-3′

反义链：5′-AGGGTGATCTTCTTGTCCGtt-3′。

进一步地，优选在3′端悬挂由脱氧核苷组成的碱基TT，用于提高基因沉默效率以及增强siRNA化合物的稳定性。

更进一步地，本发明提供了上述抑制FOXC1基因表达的siRNA在制备抗喉癌药物中的应用。上述siRNA能够有效抑制人FOXC1基因的表达，并能够显著抑制喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177细胞增殖、克隆能力，以及细胞的迁移及侵袭能力，可用于靶向FOXC1的抗喉癌药物的制备。

附图说明

图1为FOXC1mRNA分别在20例喉鳞癌组织及癌旁正常黏膜组织中的相对表达量。

图2为FOXC1mRNA分别在颈淋巴结转移（N+）及非颈淋巴结转移（N0）病理中的相对表达量。

图3为FOXC1蛋白在喉鳞癌组织中的免疫组化表达（箭头指示阳性表达部位，放大倍数400倍）；

图中：A：FOXC1蛋白在喉鳞癌细胞质中强阳性表达；

B：FOXC1蛋白在喉鳞癌细胞核中强阳性表达；

C：FOXC1蛋白在喉鳞癌细胞质及细胞核强阳性表达；

D：FOXC1蛋白在喉鳞癌组织中阴性对照片。

图4为：FOXC1mRNA喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177及3个癌旁正常黏膜组织中的相对表达水平。

图5为喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177筛选有效性FOXC1siRNA（si-FOXC1-1/2/3）。

图6为喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177转染FOXC1siRNA，FOXC1mRNA相对表达水平。

图7为喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177转染FOXC1siRNA，FOXC1蛋白相对表达水平。

图8为喉鳞癌细胞系Hep-2转染FOXC1siRNA（si-FOXC1-2后）细胞增殖能力变化。

图9为喉鳞癌细胞系TU-177转染FOXC1siRNA（si-FOXC1-2后）细胞增殖能力变化。

图10为喉鳞癌细胞系Hep-2转染FOXC1siRNA（si-FOXC1-2后）细胞克隆能力变化。

图11为喉鳞癌细胞系TU-177转染FOXC1siRNA（si-FOXC1-2后）细胞克隆能力变化。

图12为喉鳞癌细胞系Hep-2转染FOXC1siRNA（si-FOXC1-2后）细胞迁移能力变化。

图13为喉鳞癌细胞系TU-177转染FOXC1siRNA（si-FOXC1-2后）细胞迁移能力变化。

图14为喉鳞癌细胞系Hep-2转染FOXC1siRNA（si-FOXC1-2后）细胞侵袭能力变化。

图15为喉鳞癌细胞系TU-177转染FOXC1siRNA（si-FOXC1-2后）细胞侵袭能力变化。

图16为定量PVR反应条件图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

一、FOXC1mRNA在喉鳞癌组织及对应正常癌旁黏膜组织中的表达

（1）标本获取

标本取自山西医科大学第一医院首诊及手术的患者，具体为20例喉鳞癌癌组织及同一患者癌旁正常黏膜对照组织；标本分离后15分内进行封装并液氮冻存；病理证实所取得标本均为喉鳞癌，癌旁正常黏膜对照组织中未见癌；肿瘤分期（TNM）采用UICC2012版本；病理学分级采用WHO标准；本实验经过山西医科大学科学研究伦理委员会批准；人口学资料见表1。

表1:喉鳞癌患者人口学资料

（2）总RNA提取

加入液氮研磨组织至粉末，加入1mL TRIzol(Invitrogen).溶液，吹打混匀，使组织充分裂解，静置5min；12000rpm4℃离心5min；上清液转移至1.5mLRNase free EP管；加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；4℃环境中12000g离心15min，溶液离心为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；沉淀RNA：加入0.5mL异丙醇，轻柔充分混匀，室温静置10min；4℃下，12000g离心10min，加入与RNAiso Plus等体积75％乙醇沉淀RNA，7500g4℃离心5min；去上清；用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入15～60μL DEPC水溶解沉淀。

（3）qRT-PCR检测

使用RNase-free的DNaseI（Promega），按表2体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。

表2:去基因组反应液体系

然后按以下步骤操作：加入等体积的苯酚，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心5min，取上清；加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心10min，取上清；加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20℃静置15min；4℃下，10,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入15-40μl DEPC水溶解沉淀。

（4）总RNA纯度和完整性检测

纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus Eppendorf核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，条带完整说明总RNA抽提比较完整。

（5）逆转录反应

在RNase free的PCR管中配置如表3下列溶液：

表3:RNA变性反应液体系

将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性；随后立即冰上制冷，以防止RNA复性；在该PCR管中加入表4所示的试剂（Promega），

表4:逆转录反应液体系

将上述20μl反应溶液30℃保温10min；42℃保温60min；85℃保温10mn。

（6）定量PCR

检测序列片段大小：18S内参片段为112bp，FOXC1-156bp；引物序列见表5所示。

表5:目的片段引物序列

反应体系如表6所示：

表6:PCR反应体系

反应条件如图16所示，融解曲线分析：温度60℃-95℃。每个样重复3次；定量PCR用的SYBR Green PCR Master Mix购自TOYOBO公司；定量PCR仪：ABI7500 Sequence Detection System。

（7）定量PCR结果的分析

实验得到的CT值，按照Methods2001(25):402-408的2^-ΔΔCT法计算各组mRNA的相对表达量。

qRT-PCR法检测20例喉鳞癌及癌旁正常黏膜新鲜组织中FOXC1mRNA的表达水平，20例喉鳞癌组织中FOXC1mRNA总体相对表达水平高于对应癌旁正常黏膜组织（16.47±17.74folds,P=0.001），如图1所示；在N+期喉鳞癌中相对表达水平显著高于N0期病例（15.87±12.62vs.4.97±4.56，P=0.019），如图2所示。这提示FOXC1在喉鳞癌侵袭转移过程中发挥重要生物学功能。

二、免疫组化检测FOXC1蛋白在喉鳞癌组织中的表达

（1）免疫组化方法

喉鳞癌组织石蜡包埋样本切片4um，1片做阴性对照，1片做HE染色，1片做免疫组化，1片备用；采用武汉博士德公司Super Vision二步法试剂；经常规脱蜡水化切片后，FOXC1采用EDTA（PH=9.0）修复液高压修复2分10秒，而后洗脱封闭后滴加一抗（一抗为美国Abcam公司产品，孵育浓度为1:150），4度下孵育过夜，洗脱后滴加Super Vision二抗试剂（HRP-Polymer anti-Goat IHCkit，武汉博士德），室温孵育15分后DAB显色，洗脱，苏木素复染后洗脱，脱水，封片；其中用PBS液代替一抗作阴性对照，肺鳞癌切片作阳性对照。

（2）免疫组化评价方法

采用半定量评价方法，即每张切片分别计算阳性细胞百分比数及染色强度，阳性细胞百分数的分为0-3等级，其中0=negative，1=1–30%，2=31–60%，3>60%；染色强度分为0-3个等级，即0=none，1=弱，2=中等染色，3=强染色；将两个等级相乘得分，即0-9分，其中0-3判定为低表达，>3分为高表达。

每张切片采用盲式阅片（阅片专家不知晓患者任何情况）；切片由两位病理科正高级专家阅片，每个切片随机挑选10个视野进行评分（每个视野不小于100个细胞），有争议切片由第三位专家阅读后，结合双方意见给出最终结果。

（3）结果

FOXC1主要定位于肿瘤细胞的细胞质或（和）细胞核，在颈淋巴结转移病例中（N+）80%高表达（8/10），高于未伴有颈淋巴结转移病例中（N0）10%（1/10），差异有统计学意义（P=0.005）。如表7和图3所示，FOXC1表达与年龄、性别、临床分期、分化程度及原发部位没有相关性。说明FOXC1与喉鳞癌的侵袭转移中发挥重要生物学功能；同时根据FOXC1mRNA相对表达量，根据中位数将标本分为10例低表达，10例高表达，发现FOXC1mRNA与FOXC1蛋白表达呈现正相关。

表7.FOXC1蛋白在喉鳞癌中的表达分布

*By Fisher's exact test,**by Mann-Whitney U test.

三、.喉鳞癌细胞株Hep-2及TU-177中FOXC1mRNA及蛋白表达

（1）细胞培养

将水浴锅预热至37℃；用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面；在超净工作台中按次序摆放无菌离心管、吸管、培养瓶等；取出冻存管；迅速解冻，迅速将冻存管投入到已经37℃预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体在2分钟内迅速融化，在冻存管内还存在一点点没融化的时候，取出；用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内；制备细胞悬液，将细胞转移至一个15ml离心管内，逐渐加入预热好的培养基，同时一边晃动离心管；加入培养基的量要达到10ml以上；在低速离心机上离心，以800rpm离心5分钟；吸去上清，然后用1ml培养基重悬细胞；将细胞悬液分装入培养皿内，将培养皿放入37℃培养箱内培养，换液的时间由细胞贴壁情况而定。

Hep-2用含1%青霉素链霉素双抗，10%FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基进行培养，TU-177用含1%青霉素链霉素双抗，10%FBS（胎牛血清）的DMEM/F12（1:1）培养基进行培养。

（2）细胞传代

紫外线提前20－30min打开；关紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯；检查细胞生长状况；显微镜下观察各浓度下细胞生长状况（数量、形态、透亮度、贴壁情况）；用酒精棉对培养瓶外部进行擦拭；将培养基倒掉，加PBS冲洗一下，如不需传代，加入5ml新鲜培养基即可；传代加1.0ml0.25%胰酶冲洗一下（快速）；放入37℃培养箱2-3分钟，轻敲瓶壁使大部分细胞脱落，加入培养基；用吸管轻柔吹打，尽量让细胞均匀分散开来，分装后放入CO2培养箱（培养条件5％CO₂、37℃）。

（3）总RNA抽提

收集目标细胞，用EDPC配置的PBS液冲洗2-3次，加入1ml Trizol（Invitrogen）溶液，吹打混匀，使组织充分裂解，静置5min；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置2min；4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase-free EP管；沉淀RNA：加入等体积的异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min；4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；加入表8体系的溶液溶解沉淀。

表8:去基因组反应液体系

（4）总RNA纯度和完整性检测

纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus Eppendorf 核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，条带完整说明总RNA抽提比较完整。

（5）逆转录反应

在RNase free的PCR管中配置如表9所示的反应体系。

表9：RNA变性反应液体系

将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性；随后立即冰上制冷，以防止RNA复性；在该PCR管中加入下列如表10所示的试剂（Promega）。

表10:逆转录反应液体系

将上述20μl反应溶液30℃保温10min；42℃保温60min；85℃保温10min。

（6）定量PCR

引物、反应体系及条件均同上。

（7）定量PCR结果的分析

实验得到的CT值，按照Methods2001(25):402-408的2^-ΔΔCT法计算各组mRNA的相对表达量。经过检测，结果如图4所示，FOXC1在Hep-2、TU-177中的相对表达含量均高于随机选取的三个癌旁组织（ANM1/2/3）中的表达量，说明在喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177中FOXC1表达上调，适合作为FOXC1调控的细胞模型。

四、FOXC1siRNA在Hep-2中的转染以及有效siRNA的筛选

（1）siRNA设计：

利用美国Ambion公司siRNA在线设计具（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html），并依据siRNA设计原则，针对人NCBI基因数据库中FOXC1mRNA（NM_001453）序列进行siRNA序列设计，并将候选的靶序列提交BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）网站，经过序列同源性BLAST分析，证明所设计的干扰序列与其他基因无同源性，以确保干扰靶基因的特异性。设计的三对序列为：

si-FOXC1-1

正义链：5′-ATCAAGACCGAGAACGGTAtt-3′

反义链：5′-TACCGTTCGGTCTCTTGATtt-3′

si-FOXC1-2

正义链：5′-CGGACAAGAAGATCACCCTtt-3′

反义链：5′-AGGGTGATCTTCTTGTCCGtt-3′

si-FOXC1-3

正义链：5′-GCTTTCGTCTACGACTGTAtt-3′

反义链：5′-TACAGTCGTAGAGACGAAAGCtt-3′

序列由大连宝生物公司合成；siRNA NC无义序列（siN05815122147）购买于上海吉凯基因化学技术有限公司。

（2）细胞转染siRNA

转染前一天对细胞进行传代，使其汇合度为30%-50%，转染采用Lipofectamine^TMRNAiMAX转染试剂（Invtrigen公司），siRNA工作浓度为50nM，转染时使用Opti-MEM（Invtrigen公司）培养基。

转染后4小时换为含10%FBS及1%青链霉素双抗的细胞生长培养基，实验分组见表11所示。

表11:实验分组

（3）总RNA提取，逆转录及PCR反应步骤及试剂同前。

（4）结果

分别转染三条siRNA（si-FOXC1-1/2/3）后，将cell组作为校正组，经2-ΔΔCT法计算每个转染组FOXC1mRNA的相对表达含量。结果如图5所示，其中转染si-FOXC1-2后FOXC1相对表达含量最低，为0.17±0.04，敲减率为83.0%。

通常选择敲减效率大于70%的siRNA，因此选取si-FOXC1-2进行后续细胞功能研究；敲减率=（cell组2^-ΔΔCT值-实验组2^-ΔΔCT值）/实验组2^-ΔΔCT值×100%。

对喉癌细胞系Hep-2、TU-177转染取si-FOXC1-2后，FOXC1的mRNA及蛋白水平均下调，见图6、7所示。可进行下一步细胞功能研究。

五、MTS检测细胞增殖

（1）方法

取各组细胞进行下面实验；消化细胞后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为1×10⁴个；贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测；收集各个时间点的细胞（0h，24h，48h，72h）加入MTS（Promega公司），比例为1/10，即100ul培养液加入10ul检测液；在孵育4小时后，酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，型号multiscan MK3）读板，读取OD490数据，此值与细胞活力成正性关系；每组设三个副孔；细胞接种后立即测定0h的OD值，24h、48h、72h分别测定每组OD值，计算增殖率，增殖率=（其他时间点OD值/0h OD值×100%）。

（2）结果

结果显示转染si-FOXC1-2后Hep-2的细胞增殖率明显降低，以48h及72h为著，如表12、13和图8、9所示。

表12:转染si-FOXC1-2 siRNA后Hep-2细胞活力改变

表13:转染si-FOXC1-2 siRNA 后TU-177细胞活力改变

六、克隆形成实验

（1）方法

在细胞转染48小时后用胰酶消化收集不同组的细胞，用1毫升培养基重悬细胞计数；吹打成单细胞悬液，细胞计数，将细胞稀释成1×10⁴cell/ml，再稀释成1×10³cell/ml接种于96孔板，吸50ul接种即50cell/孔，吸100ul接种即100cell/孔，吸200ul接种即200cell/孔；接种完毕，各孔补加培养基至300ul/孔；水平位左右前后晃动培养板，尽量使孔内细胞分布均匀；培养7天后，吸去各孔培养基，PBS或生理盐水漂洗2次，各孔加200ul结晶紫染色液应充分覆盖孔底，20min后将96孔板置于自来水下冲洗，注意水流要缓慢，冲洗后晾干，计算集落数。集落计数使用ELISPOT酶联免疫斑点仪器（AID iSpot system公司）。细胞转染si-FOXC1-2siRNA后相对克隆形成倍数，经cell组均一化。

（2）结果

结果表明转染si-FOXC1-2siRNA后Hep-2、TU-177的克隆能力明显减弱，结果如表14、15和图10、11所示。

表14:转染si-FOXC1-2 siRNA后Hep-2克隆能力改变

表15:转染si-FOXC1-2 siRNA后TU-177克隆能力改变

七、划痕实验检测细胞迁移能力

（1）方法

先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔；每孔至少穿过5条线；对数生长期细胞接种于6孔板内，每孔1×10⁶个细胞。

用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂。

各组转染si-FOXC1-2并处理后换液。

用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。

用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。

放入37度5%CO₂培养箱培养。按0，6，24，48小时取样，拍照。

（2）结果

划痕实验表明在下调FOXC1基因表达后，如图12、13所示，Hep-2、TU-177的划痕愈合能力减弱，反映出两个肿瘤细胞的迁移能力明显减弱。

八、Transwell检测细胞侵袭能力

（1）方法

4℃溶解Matrigel胶（BD公司）过夜，用预冷的无血清培养基以1:3的体积比稀释matrigel，取40ul加入预冷的Transwell小室中（BD公司），37℃孵育2h使Matrigel胶凝固；吸走小室中多余的液体，并在上室、下室分别加入100ul、600ul无血清培养基，37℃平衡过夜；细胞转染si-FOXC1-2第二天，计数1*10⁵个细胞，用100ul无血清培养基重悬，加入Transwell小室上室，在下室加入600ul完全培养基；在37℃，5%CO₂孵育24、48小时后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10min，PBS洗涤一次，检测细胞是否穿过小孔，如有穿过终止其他实验组，并拍照。用结晶紫染色的上室下表面细胞，用33%醋酸洗脱，后用酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，型号multiscan MK3）测定OD570吸光值，此值与细胞数量成正比。

（2）结果

如表16、17和图14、15所示，表明转染后Hep-2、TU177的侵袭能力明显减弱。

表16:转染si-FOXC1-2 siRNA后Hep-2侵袭能力改变

表17:转染si-FOXC1-2 siRNA后TUl77侵袭能力改变

各项实验均表明，本发明涉及的siRNA能够有效抑制人FOXC1基因的表达，并能够显著抑制喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177细胞增殖、克隆能力，以及细胞的迁移及侵袭能力，为靶向FOXC1的抗喉癌药物的制备提供依据。

SEQUENCE LISRING

<110> 山西医科大学第一医院

<120>一种抑制FOXC1基因表达的siRNA及其应用

<160> 2

 

<210>1

<211>22

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<223>以FOXC1基因为靶标的siRNA序列的正义链

 

<400>1

5′- CGGACAAGAAGATCACCCTtt-3′

<210>2

<211>20

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<223>以FOXC1基因为靶标的siRNA序列的反义链

 

<400>2

5′ -AGGGTGATCTTCTTGTCCGtt-3′

Claims (1)

1.一种抑制FOXC1基因表达的siRNA在制备抗喉癌药物中的应用，其中所述siRNA的序列为：

正义链：5′- CGGACAAGAAGATCACCCTtt-3′

反义链：5′ -AGGGTGATCTTCTTGTCCGtt-3′，

所述的应用为所述 siRNA在制备抑制喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177细胞的增殖、克隆、迁移、和/或侵袭的试剂中的应用。