CN104031884B

CN104031884B - 蛋白质精氨酸甲基转移酶7在癌细胞转移中的应用

Info

Publication number: CN104031884B
Application number: CN201410293805.XA
Authority: CN
Inventors: 陆军; 张瑜; 姚若斯; 姜浩; 李晓雪; 黄百渠
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeast Normal University
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2014-06-25
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2034-06-25
Also published as: CN104031884A

Abstract

本发明公开了一种蛋白精氨酸甲基转移酶7在癌细胞转移中的应用。本发明公开了蛋白质精氨酸甲基转移酶7在制备促进细胞上皮间质转化的产品中的应用。本发明证明在乳腺癌组织中PRMT7异常高表达，并且PRMT7能够诱导乳腺癌细胞发生EMT，促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移。而干涉PRMT7可以抑制EMT，降低乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力，PRMT7可以作为靶点应用于癌症的治疗中。

Description

蛋白质精氨酸甲基转移酶7在癌细胞转移中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白质精氨酸甲基转移酶7在癌细胞转移中的应用，属于生物制药领域。

背景技术

乳腺癌是被广泛关注和重视的大众性健康疾病，其发病群体主要是女性，当然现今发现少部分男性也是发病群体，乳腺癌由于是女性第二大高发性癌症，并具有较高的致死率而受到社会大众的关注。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。

蛋白质精氨酸甲基转移酶7(PRMT7)，具有两个AdoMet结合位点的结构域，对于不同的底物具有不同的酶活性，能催化纤维蛋白发生单甲基化。PRMT7能影响药物诱导的敏感性，与CTCFL相作用介导雄性精子的基因印记。经过对1200例乳腺癌样本进行转移相关染色体区位分析发现，16q22、17q21-23、17q25和20q11等染色体区域可能是潜在的转移启动基因，而16q22就是PRMT7所在的区域。目前对于PRMT7功能的研究还非常有限，PRMT7参与鼠胚胎干细胞以及精子细胞多潜能性的维持。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白质精氨酸甲基转移酶7在癌细胞转移中的应用，本发明证明在乳腺癌组织中蛋白质精氨酸甲基转移酶7(PRMT7)异常高表达，并且PRMT7能够诱导乳腺癌细胞发生上皮间质转化(EMT)，促进乳腺癌细胞的侵袭和转移，而干涉PRMT7可以抑制EMT，降低乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。

本发明提供一种蛋白质精氨酸甲基转移酶7在制备促进细胞上皮间质转化的产品中的应用；

或，

蛋白质精氨酸甲基转移酶7在制备促进细胞侵袭和/或迁移的产品中的应用。

蛋白质精氨酸甲基转移酶7作为靶点在制备抑制细胞上皮间质转化的产品中的应用；

或，

蛋白质精氨酸甲基转移酶7作为靶点在制备抑制细胞侵袭和/或迁移的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的应用中，所述细胞为癌细胞，具体为乳腺癌细胞。

蛋白质精氨酸甲基转移酶7在制备促进癌细胞的远端转移的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

蛋白质精氨酸甲基转移酶7作为靶点在制备抑制癌细胞的远端转移的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述的应用中，所述癌细胞为乳腺癌细胞。

蛋白质精氨酸甲基转移酶7在制备预防和/或治疗乳腺癌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

蛋白质精氨酸甲基转移酶7的抑制剂在制备抑制细胞上皮间质转化、抑制细胞侵袭和/或迁移、抑制癌细胞的远端转移、抑制癌细胞转移、治疗癌症的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述抑制剂为能干扰蛋白质精氨酸甲基转移酶7转录和/或表达的siRNA，具体为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9退火片段的转录产物。

上述任一所述的应用中，所述细胞为癌细胞，具体为乳腺癌细胞；

所述癌为乳腺癌。

上述任一所述的应用中，所述蛋白质精氨酸甲基转移酶7的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.3中自5’末端起第17位至第2095位所示。

本发明证明PRMT7可以作为靶点应用于癌症的治疗。

附图说明

图1为PRMT7在恶性能力不同的细胞系中的表达情况。

图2为MCF10A中过表达PRMT7。

图3为PRMT7-MCF10A细胞中表皮和间质marker的变化情况。

图4为免疫荧光检测PRMT7-MCF10A细胞中表皮和间质marker的变化情况。

图5为PRMT7-MCF10A的侵袭和转移能力的体外检测。

图6为siPRMT7-MDA-MB-231细胞中表皮和间质marker的变化情况。

图7为免疫荧光检测siPRMT-MDA-MB-231细胞系表皮和间质marker的变化。

图8为划痕实验检测siPRMT7-MDA-MB-231细胞的迁移能力。

图9为siPRMT7抑制MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力。

图10为PRMT7诱导MDCK细胞发生EMT。

图11为PRMT7促进乳腺癌的远端转移。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

PRMT7-p3×Flag-myc-CMV-23在文献“Graydon B.Gonsalvez,Liping Tian,JasonK.Ospina,-Michel Boisvert,Angus I.Lamond,and A.Gregory Matera，Two distinct arginine methyltransferases are required for biogenesis ofSm-class ribonucleoproteins.The Journal of Cell Biology Vol.178No.5August27,2007733–740”中公开过，公众可从东北师范大学获得。

MSCV2.2-IRES-GFP在文献“Kofoed,E.M.Vance,R.E.Innate immunerecognition of bacterial ligands by NAIPs determines inflammasome specificity.Nature2011；477:592-5.”中公开过，公众可从东北师范大学获得。

PRMT7-MSCV2.2-IRES-GFP质粒的构建过程如下：

一、设计并合成如下引物：

上游引物：5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGAAGATCTTCTGCAGTCGGG-3’(SEQ ID No.1)

(下划线所示序列为NotI酶切识别位点)

下游引物：5’-ACGCGTCGACTCAGTCTGGGGTATCTGCATGCCT-3’(SEQ ID No.2)

(下划线所示序列为SalI酶切位点)

二、以PRMT7-p3×Flag-myc-CMV-23为模板，以上游引物(SEQ ID No.1)和下游引物(SEQ ID No.2)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如SEQ ID No.3所示。SEQ ID No.3中自5’末端起第17位至第2095位核苷酸所示的序列为PRMT7的编码基因序列，PRMT7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

三、用NotI和SalI双酶切SEQ ID No.3所示的DNA分子，得到基因序列；NotI和SalI双酶切MSCV2.2-IRES-GFP，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，并将其命名为PRMT7-MSCV2.2-IRES-GFP，将PRMT7-MSCV2.2-IRES-GFP送测序，结果正确。

PWPXLD购自addgene，产品目录号为12258。

PWPXLD-PRMT7的构建过程如下：

一、设计并合成如下引物：

上游引物：5’-AGCTTTGTTTAAACATGAAGATCTTCTGCAGTCGGG-3’(SEQ ID No.5)

(下划线所示序列为PmeI酶切识别位点)

下游引物：5’-GACTAGTTCAGTCTGGGGTATCTGCATGCCT-3’(SEQ ID No.6)

(下划线所示序列为SpeI酶切识别位点)

二、以PRMT7-p3×Flag-myc-CMV-23为模板，以上游引物(SEQ ID No.5)和下游引物(SEQ ID No.6)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，如SEQ ID No.7所示。

三、PmeI和SpeI双酶切SEQ ID No.7所示的DNA分子，得到基因序列；用PmeI和SpeI双酶切PWPXLD，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段链接，得到重组质粒，并将其命名为PWPXLD-PRMT7，将PWPXLD-PRMT7送测序，结果正确。

pEN_hH1c购自ATCC,产品目录号为10326368。

pDSL-hpUGIP购自ATCC,产品目录号为10326373。

LR Clonase^TM II enzyme mix购自Invitrogen，产品目录号为11791-100。

干涉质粒pDSL-shPRMT7的构建过程如下：

一、设计并合成如下序列：

5'-GATCCCCGGAACAAGCTATTTCCCATCCTTCAAGAGAGGATGGGAAATAGCTTGTTCCTTTTTC-3'(SEQ ID No.8)

(下划线所示序列为BamHI酶切识别位点的粘性末端)

5'-TCGAGAAAAAGGAACAAGCTATTTCCCATCCTCTCTTGAAGGATGGGAAATAGCTTGTTCCGGG-3'(SEQ ID No.9)

(下划线所示序列为XhoI酶切识别位点的粘性末端)

二、用超纯水或TE buffer稀释互补的寡核苷酸链SEQ ID No.8和SEQ ID No.9使其终浓度均为50μmol/L，各取25μL混匀放入95℃水浴5min，随即关闭水浴自然降温至室温使互补的寡核苷酸链退火，得到退火片段。

三、BamHI和XhoI双酶切Entry载体pEN_hH1c，得到载体大片段；将退火片段与载体大片段连接，得到质粒，将其命名为pEN-shPRMT7，将pEN-shPRMT7送测序，结果正确。

四、利用重组酶将构建好的pEN-shPRMT7与目的载体pDSL-hpUGIP重组，过程如表1所示，得到重组质粒，将其命名为pDSL-shPRMT7,将其送测序，结果正确。

表1 重组过程

PAX购自addgene，产品目录号为12260。

PMD-2G购自addgene，产品目录号为12259。

polyjet转染试剂购自SignaGen Laboratories。

pUMCV购自addgene，产品目录号为8449。

pCMV-VSVG购自addgene，产品目录号为8454。

一抗：兔源抗PRMT7抗体购自upstate公司；兔源抗PRMT7免疫组化抗体购自Abcam公司；兔源抗Snail抗体购自Abcam公司；鼠源抗β-actin和α-SMA抗体购自Sigma公司；鼠源抗E-cadherin、β-catenin、Vimentin、N-cadherin和Fibronectin抗体购自BD Bioscience公司；鼠源抗Occludin抗体购自invitrogen公司。

二抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗和TRITC标记的山羊抗鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自Sigma公司。

永生化的人正常乳腺上皮细胞MCF10A、犬肾细胞MDCK、人胚肾细胞系293T及人乳腺癌细胞系MDA-MB-231均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

MCF-7购自ATCC，产品目录号为HTB22。

T47D购自ATCC，产品目录号为HTB133。

MDA-MB-435购自ATCC，产品目录号为HTB129。

293T细胞购自ATCC，产品目录号为CRL1573。

MDA-MB-231HM(高肺转移乳腺癌细胞系)在文献“Du,J；Li,L；Ou,ZL；Kong,CF；Zhang,Y；Dong,ZX；Zhu,S；Jiang,H；Shao,ZM；Huang,BQ；Lu,J,FOXC1,a target of polycomb,inhibits metastasis of breast cancer cells,BREAST CANCERRESEARCH AND TREATMENT,2012；131(1):65-73”中公开过，公众可从东北师范大学获得。

临床乳腺癌组织样本均由吉林大学中日联谊医院提供。

SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自ToYoBo公司。

蛋白酶抑制剂片剂购自罗氏公司。

hEGF购自R&D公司。

lipofectamine2000、胰岛素、B27和马血清购自Invitrogen公司。

聚凝胺、霍乱毒素、氢化可的松购自Sigma公司。

所有细胞培养基均购自Sigma公司。

下述实施例中的哺乳动物细胞系的培养：

永生化的人正常乳腺上皮细胞MCF10A细胞用DMEM/F12培养基培养，添加体积百分含量5％马血清、20ng/mL hEGF,0.5mg/mL氢化可的松、100ng/mL霍乱毒素、10mg/mL胰岛素、100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素。

人胚肾细胞系293T和犬肾细胞MDCK用DMEM培养基培养，添加体积百分含量10％胎牛血清(FBS)(购自Hyclone公司)。

以上三种细胞均培养于37℃，5％CO₂培养箱中。

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231用L-15培养基培养，添加体积百分含量10％胎牛血清，培养于37℃，无CO₂培养箱中。

人乳腺癌细胞系MCF-7用RPMI-1640培养基培养，添加体积百分含量10％胎牛血清，培养于37℃，5％CO₂培养箱中。

下述实施例中的Real-time PCR实验使用罗氏应用科学部的480Real-Time PCR系统。所得的数据应用ABI公司(Applied Biosystems)所提供的软件以2^–ΔΔCp方法来计。

下述实施例中免疫组化主要试剂的配制：

1)PBS缓冲液(pH7.4)

2)体积百分含量3％H₂O₂的水溶液

3)10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0，1000mL)

余量为水。

4)封闭液：含体积百分含量10％羊血清的PBS

5)抗体稀释液：含5g/100ml BSA的PBS

6)苏木素(1000mL)：

余量为水。

实施例1、PRMT7在人类恶性乳腺癌样本中高表达

一、人类恶性乳腺癌样本的免疫组化

(一)将人类恶性乳腺癌样本组织切块脱蜡和水化，PBS洗3次，每次5min；

(二)抗原热修复：将组织切片放入95℃10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，加热15min；

(三)用体积百分含量3％H₂O₂的水溶液室温孵育组织切片5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；

(四)用PBS洗3次，每次5min；

(五)滴加封闭液，室温孵育5-10min；

(六)滴加适量的兔源抗PRMT7免疫组化抗体的一抗工作液(用抗体稀释液对一抗进行1:50倍稀释)，室温孵育1h，用PBS洗3次，每次5min；

(七)滴加适量的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗工作液，室温孵育30min；

(八)PBS洗3次，每次5min；

(九)DAB显色3-10min，在显微镜下掌握染色程度；

(十)PBS或自来水冲洗10min；

(十一)苏木素复染2min，盐酸酒精分化；

(十二)自来水冲洗，PBS返蓝；

(十三)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片、正置显微镜镜检并照相。

免疫组化的结果表明，PRMT7在癌旁组织中低表达，而在乳腺癌组织中呈现出表达升高的趋势。

二、PRMT7在乳腺癌的高临床分级和高转移性乳腺癌样本中高表达

对114例乳腺癌样本按照步骤一的方法进行免疫组化检测，结果发现PRMT7在几乎所有的乳腺癌样本中表达，但是PRMT7的表达强度与乳腺癌组织临床分级和转移性乳腺癌亚型相关。

统计分析发现，在Ⅰ/Ⅱ临床分级中21.7％的乳腺癌样本呈现PRMT7强染色，而Ⅲ中却有40％的强染色；与此同时，在基底样乳腺癌样本(Basal-like)和Her2+(人表皮生长因子受体)的乳腺癌中，PRMT7的强阳性率分别为50％和38.9％，但是在腔膜样乳腺癌样本(Luminal-like)中只占22.9％。

三、PRMT7在恶性程度高的乳腺癌细胞系中高表达

(一)PRMT7在不同种类的乳腺癌细胞系的表达情况

根据步骤一和步骤二的乳腺癌样本免疫组化的结果，得出PRMT7与乳腺癌的恶性程度存在着潜在的联系。用兔源抗PRMT7抗体作为一抗进行Western Blotting检测结果，同时以β-actin为内参，鼠源抗β-actin为一抗。结果表明，PRMT7在恶性程度较低的细胞系中低表达，如MCF-7、T47D；相反，在恶性程度高(如转移能力强)的细胞系(如MDA-MB-231HM和MDA-MB-435)中高表达。

(二)PRMT7的表达随着乳腺癌细胞恶性程度的升高而升高

步骤(一)的结果表明，PRMT7的表达在不同种类的细胞系中随着恶性程度的升高而升高，为了更进一步证实PRMT7与乳腺癌细胞恶性程度的正相关性，我们在有相同来源的细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-231HM(高肺转移细胞系)以及MCF-7中检测PRMT7的表达情况，

反转录PCR检测PRMT7的转录水平。

步骤如下：

提取各细胞系的RNA,反转录成cDNA，然后以其cDNA为模板，用PRMT7的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，同时以β-actin作为内参。扩增后的片段通过琼脂糖凝胶电泳检测。

反转录PCR引物如下：

PRMT7：

正义引物：5’-ATCGTCCCTCCCGTTGA-3’(SEQ ID No.10)

反义引物：5’-CATGGGCAGCACATCG-3’(SEQ ID No.11)；

β-actin引物如下：

正义引物：5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’(SEQ ID No.12)

反义引物：5’-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3’(SEQ ID No.13)；

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1A所示。

Western Blotting检测PRMT7的蛋白表达水平。

用兔源抗PRMT7抗体进行Western Blotting检测PRMT7蛋白表达水平，同时以β-actin为内参，以鼠源抗β-actin为一抗进行检测，结果如图1B所示。

图1A和图1B表明，在转录水平和蛋白水平上，高肺转移细胞系MDA-MB-231HM细胞的PRMT7表达最高，在转移能力相对较弱的MDA-MB-231细胞系中表达相对较低，但表达仍然比恶性程度低的MCF-7细胞系高。

四、PRMT7通过诱导EMT促进乳腺癌细胞系的侵袭和迁移

(一)过表达PRMT7诱导EMT促进MCF10A细胞的侵袭和迁移

1、PRMT7诱导MCF10A发生EMT

以上结果显示，PRMT7与乳腺癌细胞的转移有着正相关的联系，现有研究显示，癌症的转移在很大程度上与上皮间质转化(EMT)过程有关，所以推测PRMT7有可能是通过诱导乳腺癌细胞发生EMT来促进乳腺癌细胞的转移，进而提高乳腺癌细胞的恶性程度的。为证实以上推测，在MCF10A细胞中过表达PRMT7，并得到了稳定转染PRMT7的细胞株。

稳定转染PRMT7的细胞株的获得过程如下：

1)将人胚肾细胞293T接种于6cm细胞培养板中，20小时细胞贴壁后汇合度达到80-90％可进行转染；

2)用Lipofectamine2000将含有目的基因的逆病毒质粒PRMT7-MSCV2.2-IRES-GFP与包装质粒pUMCV和pCMV-VSVG按照摩尔比10:9:1的比例，总共4μg质粒DNA转染293T细胞。

3)转染后8小时更换新鲜培养基；

4)分别于48小时、72小时和96小时收集病毒上清液；

5)用0.45μm滤膜过滤上述3个时间段收集的病毒上清；

6)将过滤后的病毒上清混匀，取约15mL放入超滤管(购自Millipore公司)，4℃，4500rpm离心0.5-1h浓缩病毒上清，收集病毒浓缩液约200μL；

7)取50μL病毒浓缩液和8ug/mL的聚凝胺和相应的细胞培养基混合，侵染目的细胞MCF10A，得到稳定转染PRMT7的PRMT7-MCF10A细胞；

8)侵染6-8h后，更换新鲜的完全培养基；

9)PRMT7基因可在病毒侵染后36-48h在PRMT7-MCF10A细胞中表达。

按照上述方法得到对照组细胞，其中仅将PRMT7-MSCV2.2-IRES-GFP替换成MSCV2.2-IRES-GFP质粒。

观察稳定转染PRMT7的细胞株(PRMT7-MCF10A)和对照组细胞的形态，以及按照步骤三的方法检测PRMT7在PRMT7-MCF10A和对照组细胞中的转录水平和蛋白表达水平，结果如图2所示。

图2中，Con为对照组细胞；PRMT7为PRMT7-MCF10A。

图2A表明，与对照组细胞相比，稳定转染PRMT7的细胞(PRMT7-MCF10A)形态发生了显著改变，细胞形态呈现有利于迁移的梭行，细胞分散状生长，细胞之间的粘附结构减少，移动性增强。

图2B和图2C表明，与对照组细胞相比，PRMT7在稳定转染PRMT7的细胞(PRMT7-MCF10A)中的转录水平和蛋白表达水平显著升高。

此外，按照步骤三的方法对对照组细胞和稳定转染PRMT7的细胞(PRMT7-MCF10A)EMT相关的Marker(Snail、Vimentin、Fibronectin、N-cadherin和E-cadherin)进行转录水平和蛋白水平的检测，以β-actin为内参。

β-actin、Snail、Vimentin、Fibronectin、N-cadherin和E-cadherin相对应的引物如下：

β-actin:

5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’(SEQ ID No.12)

5’-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3’(SEQ ID No.13)；

E-cadherin:

5’-GACAACAAGCCGAATT-3’(SEQ ID No.14)

5’-GGAAACTCTCTCGGTCCA-3’(SEQ ID No.15)；

Fibronectin:

5’-CAGTGGGAGACCTCGAGAAG-3’(SEQ ID No.16)

5’-TCCCTCGGAACATCAGAAAC-3’(SEQ ID No.17)；

Vimentin:

5’-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3’(SEQ ID No.18)

5’-GCTTCCTGTAGGTGGCAATC-3’(SEQ ID No.19)；

Snail:

5’-GCAAATACTGCAACAAGG-3’(SEQ ID No.20)

5’-GCACTGGTACTTCTTGACA-3’(SEQ ID No.21)；

N-cadherin：

5'-CGGGTAATCCTCCCAAATCA-3'(SEQ ID No.22)

5'-CTTTATCCCGGCGTTTCATC-3'(SEQ ID No.23)。

下述实验中检测相应基因所用的引物与上述一致。

结果如图3A所示。

蛋白水平检测的过程中Snail、Vimentin、Fibronectin、N-cadherin和E-cadherin相对应的一抗分别为兔源抗Snail抗体、鼠源抗Vimentin抗体、鼠源抗Fibronectin抗体、鼠源抗N-cadherin、鼠源抗E-cadherin。同时以β-actin为内参。下述实验中检测相应蛋白的表达所用的抗体与上述一致。

结果如图3B所示。

图3中，Con为对照组细胞；PRMT7为稳定转染PRMT7的细胞(PRMT7-MCF10A)。

图3A和3B表明，与对照组细胞相比，在转录水平和蛋白水平，PRMT7-MCF10A中与间质转化相关的Marker表达均上调，如Vimentin、Fibronectin和N-cadherin，与间质化转变相关的重要转录因子Snail也被上调，而与上皮相关的Marker下调，如E-cadherin。

图3C为Real-time PCR检测对照组细胞和PRMT7-MCF10A细胞的表皮间质Marker及转录因子的变化情况。

具体步骤如下：提取对照组细胞和稳定转染PRMT7的细胞(PRMT7-MCF10A)的RNA，以反转录后的cDNA为模板，Snail、Vimentin、Fibronectin、N-cadherin和E-cadherin相对应的引物进行Real-time PCR，检测Snail、Vimentin、Fibronectin、N-cadherin和E-cadherin的表达水平，并且以β-actin为内参。

图3C的结果与图3A和图3B的结果一致。

2、免疫荧光检测

免疫荧光检测对照组细胞和稳定转染PRMT7(PRMT7-MCF10A)的细胞Vimentin、Fibronectin、N-cadherin和E-cadherin的表达。

免疫荧光检测过程中的Vimentin、Fibronectin、N-cadherin和E-cadherin对应的一抗分别为鼠源抗Vimentin抗体、鼠源抗Fibronectin抗体、鼠源抗N-cadherin、鼠源抗E-cadherin和二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG。

结果如图4所示。

图4中，Con为对照组细胞；PRMT7为稳定转染PRMT7的细胞(PRMT7-MCF10A)。

图4表明，PRMT7过表达后表皮间质Marker发生变化，该变化与图3的结果一致，初步证实PRMT7可诱导EMT过程发生。

3、PRMT7促进MCF10A细胞系的侵袭和迁移

步骤1和2的结果表明，PRMT7能够诱导MCF10A发生EMT，而EMT往往通过促进癌细胞的侵袭和迁移使其恶性程度提高，因此对对照组细胞和稳定转染细胞株(PRMT7-MCF10A)进行体外侵袭和迁移能力的检测(Trans well迁移和侵袭检测)。

结果如图5A和5B所示。

图5A为Trans well检测细胞的迁移能力，细胞数量1×10⁵个，培养18小时之后用溴酚蓝染色镜检计数；

图5B为Trans well检测细胞的侵袭能力，细胞数量1×10⁵个，培养48小时之后用溴酚蓝染色镜检计数。

图5中，Con代表对照组细胞，PRMT7代表稳定转染细胞株PRMT7-MCF10A。

图5A和5B结果表明，与对照组细胞相比，稳定转染细胞株PRMT7-MCF10A的体外迁移和侵袭能力显著提高。

明胶酶谱检测基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达情况，步骤如下：

在细胞培养板上接种1×10⁶/孔对照组细胞或PRMT7-MCF10A细胞，第二天弃去培养基，PBS洗两次后，加约1ml无血清培养基，培养48h，收集无血清培养细胞上清，低速离心(200g，4℃)10min，去除细胞碎片之后，4℃或-80℃备用。取20μL样品，与5×Buffer(该缓冲液的由溶剂和溶质组成，溶剂为250mM pH6.8的Tris·HCl缓冲液，溶质为SDS、溴酚兰和甘油；所述SDS在5×Buffer中的浓度为10g/100ml，所述溴酚兰在5×Buffer中的浓度为0.5g/100ml，所述甘油在5×Buffer中的浓度为50g/100ml)混合后，上样至含0.1g/100ml明胶的PAGE胶中，在4℃环境中进行蛋白电泳，浓缩胶80V，分离胶(120V)，溴酚蓝到达胶下缘即可，取出分离胶，置于洗脱液中，水平摇床40min/次，两次即可，置于孵育液中，37℃孵育过夜，染色2-3h，脱色2-3h，放于扫胶仪中，以白板为背景，在日光灯下照相。

在有二价金属离子存在的缓冲系统中样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

结果如图5C所示，与对照组细胞相比，稳定转染PRMT7细胞株PRMT7-MCF10A的MMP2和MMP9分泌量也升高，而MMP2和MMP9与癌细胞的侵袭和转移能力直接相关。

(二)干涉PRMT7抑制EMT，降低MDA-MB-231细胞系的侵袭和迁移能力

1、shPRMT7抑制MDA-MB-231细胞系的EMT

步骤(一)的结果表明，过表达PRMT7能诱导MCF10A细胞系发生EMT，所以推测siPRMT7干涉PRMT7可能会抑制乳腺癌细胞的EMT，进而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。为了证实上述推测，利用慢病毒体系构建shPRMT7-MDA-MB-231细胞系。

1)提前一天用293T人胚肾细胞铺板(铺板时用普通pH7.4的DMEM完全培养基)，6cm平板中正常培养的密度约85-95％的293T细胞；

2)取两只1.5mL Eppendorf管，分别加入300ul DMEM完全培养基，将质粒pDSL-shPRMT74μg、PAX3ug、PMD-2G1ug溶于一只Eppendorf管内，将24μL polyjet转染试剂溶于另一只Eppendorf管中，初步混匀后移入含有质粒的Eppendorf管内，进一步轻柔吹打混匀数次，静置15min后逐滴均匀加入待转染的平板中；

3)转染13-18h后，用普通pH7.4的DMEM完全培养基3mL换液；

4)分别在转染后48h,72h,96h连收3次病毒原液(培养基)，先收获的病毒原液可暂存4℃冰箱中；

5)将三次收获的病毒原液混合，用0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片(过滤前可离心去除细胞)；

6)病毒浓缩：取15mL过滤后的病毒原液于100kD超滤柱收集池内，4℃，4000g离心25-30min，收集池内剩余约200μL病毒浓缩液，50uL/管分装于1.5mlEppendorf管内，置-80℃可长期保存；

7)病毒侵染：六孔板内待侵染MDA-MB-231细胞生长至50-60％左右进行侵染为宜，侵染前用1mL新鲜培养基换液。同时用1mL新鲜培养基稀释50μL上述制备的病毒浓缩液，加入4μL聚凝胺(浓度为5mg/mL)混匀后移入六孔板1个孔内；

8)侵染后24h换液，得到siPRMT7-MDA-MB-231细胞系。

按照上述方法得到对照组细胞，其中仅将pDSL-shPRMT7质粒替换成下述的pDSL-shCtrl质粒。

pDSL-shCtrl质粒的构建过程同pDSL-shPRMT7，两个互补片段如下：

5’-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTC-3’(SEQ ID No.24)；

5’-TCGAGAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGGG-3’(SEQ ID No.25))。

与MDA-MB-231细胞系相比，siPRMT7-MDA-MB-231细胞系的形态没有发生明显变化。

用步骤三的方法对对照组细胞和siPRMT7-MDA-MB-231细胞的PRMT7进行转录水平和蛋白水平的检测，同时以β-actin为内参，结果如图6A和6B所示。

图6中，Coi代表对照组细胞，siPRMT7代表siPRMT7-MDA-MB-231细胞。

图6A和6B表明，在转录和蛋白水平上的检测证实，在siPRMT7-MDA-MB-231细胞中，PRMT7的干涉效率非常高。

用步骤三的方法对对照组细胞和siPRMT7-MDA-MB-231细胞的Vimentin、Fibronectin和E-cadherin进行转录水平检测，结果如图6C所示。

图6C表明，与对照组细胞相比，siPRMT7-MDA-MB-231细胞中，间质Marker，如Vimentin和Fibronectin，被明显的降低；上皮Marker，如E-cadherin，被明显上调。

用步骤三的方法对对照组细胞和siPRMT7-MDA-MB-231细胞的Snail、Vimentin、Fibronectin和E-cadherin进行Western blotting检测，结果如图6D所示。

图6D表明，与对照组细胞相比，siPRMT7-MDA-MB-231细胞中，间质Marker，如Vimentin和Fibronectin，被明显的降低；上皮Marker，如E-cadherin，被明显上调，转录因子Snail的表达却被明显地抑制。

2、对siPRMT7-MDA-MB-231细胞的Vimentin、Fibronectin、E-cadherin和Occludin(一抗分别为鼠源抗Vimentin抗体、鼠源抗Fibronectin抗体、鼠源抗E-cadherin、鼠源抗Occludin，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG)进行免疫荧光检测，结果如图7所示。

图7中，Coi代表对照组细胞，siPRMT7代表siPRMT7-MDA-MB-231细胞。

图7的结果与图6C和6D的结果一致，与对照组细胞相比，siPRMT7-MDA-MB-231细胞中，间质Marker，如Vimentin和Fibronectin，被明显的降低；上皮Marker，如E-cadherin和Occludin，被明显上调，说明siPRMT7能抑制MDA-MB-231细胞的EMT。

3、siPRMT7抑制MDA-MB-231细胞系的侵袭和迁移

siPRMT7影响MDA-MB-231细胞系上皮间质相关Marker的表达，进而抑制EMT。上面已经提到过EMT与癌细胞的迁移和侵袭能力直接相关，所以抑制了EMT会影响癌细胞的迁移和侵袭。对稳定转染细胞系siPRMT7-MDA-MB-231和MDA-MB-231细胞的体外侵袭和迁移能力进行了检测，首先利用划痕实验观察干涉PRMT7细胞的迁移能力是否被抑制。

体外细胞划痕实验步骤如下：

1)用marker笔在孔板背后画出均匀横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿孔。

2)向孔中加入一定数量的细胞(对照组细胞或siPRMT7-MDA-MB-231细胞)，一般要求过夜铺满最好。

3)第二天用移液器垂直于背后的横线划痕。

4)用PBS清洗细胞2次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。

5)把4)处理好的平板置入37℃5％CO₂培养箱，根据实验需要，0、6h、12h和24h定时取样拍照。

结果如图8所示。

图8中，Coi代表对照组细胞，siPRMT7代表siPRMT7-MDA-MB-231细胞。

图8的细胞数量1×10⁴个，待细胞长满之后，撤去胎牛血清，划痕定时镜检。

图8表明，与对照组细胞相比，干涉PRMT7细胞(siPRMT7-MDA-MB-231细胞)的迁移能力被抑制。

对siPRMT7-MDA-MB-231和对照组细胞进行体外侵袭和迁移能力的检测(Transwell迁移和侵袭检测)。

结果如图9所示。

图9中，Coi代表对照组细胞，siPRMT7代表siPRMT7-MDA-MB-231细胞。

图9表明，siPRMT7显著抑制了MDA-MB-231细胞的体外侵袭和迁移能力。

(三)PRMT7诱导MDCK细胞发生EMT并促进其迁移

为了证明PRMT7诱导细胞发生EMT的普遍性，构建了PRMT7-MDCK稳定转染细胞系，具体过程如si-PRMT7-MDA-MB-231细胞系的建立，其中将MDA-MB-231细胞替换成犬肾细胞MDCK细胞(转染时的密度为20％左右)，并将pDSL-shPRMT7替换成PWPXLD-PRMT7，24小时后换液，次日进行二次侵染，扩繁，挑取单克隆，继续培养，得到PRMT7稳定转染的PRMT7-MDCK稳定转染细胞系。

按照上述方法得到对照组细胞，其中仅将PWPXLD-PRMT7质粒替换成PWPXLD质粒。

用步骤三的方法对对照组细胞和PRMT7-MDCK稳定转染细胞系的PRMT7的转录水平和蛋白水平进行检测，并且观察MDCK细胞和PRMT7-MDCK稳定转染细胞系的形态，结果如图10A所示。

图10中，Con代表对照组细胞，PRMT7代表PRMT7-MDCK稳定转染细胞系。

图10A表明，与对照组细胞相比，在转录水平和蛋白水平，PRMT7在PRMT7-MDCK稳定转染细胞系中高表达，并且PRMT7-MDCK稳定转染细胞形态发生显著的变化，细胞形态呈梭形，与PRMT7诱导MCF10A的结果很相似，细胞之间的粘附能力下降，迁移和移动能力增强。

用步骤三的方法对PRMT7-MDCK稳定转染细胞和对照组细胞的Snail、α-SMA(一抗为鼠源抗α-SMA抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG)、Fibronectin、E-cadherin和Occludin进行Western blotting检测，结果如图10B所示。

图10B表明，与对照组细胞相比，PRMT7-MDCK稳定转染细胞间质Marker(具体为Snail，α-SMA和Fibronectin)表达上调，上皮Marker(具体为E-cadherin和Occludin)表达下降，侵袭能力明显升高。以上结果与MCF10A的结果一致，说明PRMT7诱导细胞发生EMT具有一定的普遍性。

对PRMT7-MDCK稳定转染细胞和MDCK细胞进行体外侵袭和迁移能力的检测(Transwell侵袭检测)。

结果如图10C所示。

图10C中，细胞数量2×10⁵个，培养48小时之后用溴酚蓝染色镜检计数。

图10C表明，PRMT7增强了MDCK细胞的侵袭能力。

实施例2、PRMT7促进乳腺癌的远端转移

一、在乳腺癌细胞系MCF-7中过表达PRMT7(方法同实施例1中的步骤四中稳定转染PRMT7的细胞株的获得过程，将目的细胞替换成MCF-7并将PRMT7-MSCV2.2-IRES-GFP替换成PRMT7-PWPXLD)，得到该稳定转染的PRMT7-MCF-7细胞系，同样用上述方法得到对照组细胞(仅将PRMT7-PWPXLD替换为对照质粒PWPXLD)。

将稳定转染的PRMT7-MCF-7细胞系和对照组细胞两种细胞对BALB/c裸鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)分别进行尾静脉注射(注射的细胞的数量均为2×10⁶个细胞)，分别得到实验组小鼠和对照组小鼠。2个月后，利用小动物活体成像技术检测小鼠，结果如图11A所示。

图11中，Vector代表对照组小鼠，PRMT7代表实验组小鼠。

图11A表明，实验组小鼠(注射PRMT7-MCF-7细胞组小鼠)的PRMT7-MCF-7细胞发生肺转移，而对照组小鼠的对照组细胞没有发生肺转移，A图整个信号区域的信号值量化结果如柱状图所示。

随后取出小鼠的肺组织，可以观察到实验组小鼠的肺部有明显的转移灶，对照组小鼠的则没有。进一步通过组织学手段HE染色得到与图11A同样的结论，结果如图11B所示。

二、将稳定转染细胞系PRMT7-MCF-7及对照组细胞进行BALB/c裸鼠皮下注射(注射的细胞的数量2×10⁶)，得到实验组小鼠和对照组小鼠，每周时间观察小鼠的皮下部位肿瘤的发生情况，结果如图11C和11D所示。

图11C和11D表明，与对照组小鼠相比，实验组小鼠皮下部位形成较小的肿瘤，统计分析发现PRMT7显著地抑制了MCF-7原位瘤的重量和体积。

以上实验证实PRMT7明显地促进乳腺癌的远端转移。

Claims

1.蛋白质精氨酸甲基转移酶7在制备促进细胞上皮间质转化的产品中的应用；所述细胞为乳腺癌细胞。

2.蛋白质精氨酸甲基转移酶7在制备促进细胞侵袭和/或迁移的产品中的应用；所述细胞为乳腺癌细胞。

3.蛋白质精氨酸甲基转移酶7作为靶点在制备抑制细胞上皮间质转化的产品中的应用；所述细胞为乳腺癌细胞。

4.蛋白质精氨酸甲基转移酶7作为靶点在制备抑制细胞侵袭和/或迁移的产品中的应用；所述细胞为乳腺癌细胞。

5.蛋白质精氨酸甲基转移酶7在制备促进癌细胞的远端转移的产品中的应用；所述癌细胞为乳腺癌细胞。

6.蛋白质精氨酸甲基转移酶7作为靶点在制备抑制癌细胞的远端转移的产品中的应用；所述癌细胞为乳腺癌细胞。

7.蛋白质精氨酸甲基转移酶7在制备预防和/或治疗乳腺癌的产品中的应用。

8.蛋白质精氨酸甲基转移酶7的抑制剂在制备抑制细胞上皮间质转化、抑制细胞侵袭和/或迁移、抑制癌细胞的远端转移、抑制癌细胞转移、治疗癌症的产品中的应用；所述癌细胞为乳腺癌细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抑制剂为能干扰蛋白质精氨酸甲基转移酶7转录和/或表达的siRNA；所述癌细胞为乳腺癌细胞。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抑制剂为SEQ ID No.8和SEQID No.9退火片段的转录产物。