CN103881975A

CN103881975A - 人前列腺癌细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途

Info

Publication number: CN103881975A
Application number: CN201410137131.4A
Authority: CN
Inventors: 李晖; 张百芳; 付振明; 彭晓; 叶琳
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2014-04-04
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2034-04-04
Also published as: CN103881975B

Abstract

本发明公开了一种来源于人前列腺癌的细胞株，该细胞命名为人前列腺癌细胞HPCC/HL-002，保藏编号为CCTCCNO：C2013102。所述细胞株是从临床分期为T3b低分化腺癌的前列腺癌患者手术切除的癌组织样品中制备所得，具有典型的肿瘤细胞生物学特性，能在体外连续长期传代，且性状保持稳定。同时本发明还公开了所述细胞株的制备方法。本发明提供的人前列腺癌细胞株具有临床上原发前列腺癌的生物学性状，可用于前列腺癌的发病机理、侵袭和转移的分子机制研究，以及体外筛选抗癌药物的药效学研究和检测。

Description

人前列腺癌细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种人前列腺癌细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途。

背景技术

体外肿瘤细胞系的建立是筛选肿瘤靶向药物的基本手段。但是目前国内外基础研究和临床应用上，几乎所有的肿瘤细胞系都不是原发位点癌细胞系，多为高度分化和转移的肿瘤来源，不能反映和代表真正原发位点的肿瘤生物学特性。现阶段世界上所使用的近千余种癌细胞株已在体外培养传代数年甚至数十年，它们已不能反映癌症患者体内癌细胞的特性，有的细胞株50％的基因以上都发生了变异，一些实验室还存在大量癌细胞株的交叉污染(Drexler, H.G. et al, Leukemia 1999(13):1601–7; Drexler, H.G. et al，Blood 2001（98）：3495–6；Cabrera, C.M. et al，Cytotechnology 2006（51）：45–50)。而对于不同的个体，即使同一类型的肿瘤也可能由不同的原因或机制所导致，因此对于每一种肿瘤，都需要有能代表其特定发病机制的细胞株来进行新药研发。但是目前的国内外现有技术，从患者癌组织获得稳定的体外培养细胞极其困难，全世界90％以上的肿瘤研究和几乎所有抗癌新药的研究，还在继续使用着可能根本没有代表性的癌细胞株。肿瘤生物学领域目前面临的最大挑战，就是如何从原发肿瘤分离培养出稳定的肿瘤细胞系。

前列腺癌是威胁男性健康的最常见恶性肿瘤之一，在欧美国家有较高的发病率。我国一直被认为是前列腺癌的低发国家，但随着我国老龄化社会进程加快，以及人们生活水平的提高和饮食结构的改变，目前前列腺癌在我国已成为常见恶性肿瘤，且有发病年龄年轻化的趋势。由于前列腺癌早期无症状，且具有高转移性，这给前列腺癌的诊断和治疗带来极大困难。而前列腺癌细胞系是公认的在体外极难培养和建系的细胞类型。迄今为止，前列腺癌的研究领域根本没有人类原发前列腺癌的细胞系，仅有的细胞系 (LnCAP, PC-3, DU-145) 都是来自转移后的肿瘤组织。尽管国内外研究尝试通过遗传操作，如转入病毒（SV40 T或HPV16E6E7）或细胞癌基因，来延长细胞在体外存活的代数。然而遗传操作会改变这些细胞的遗传背景和表型，如 p53 和pRB信号通路常常被抑制，因此以这种转入基因的细胞为模型，会导致肿瘤研究和抗癌新药研究从根本上走入歧途。

如果能从原发前列腺癌分离培养出体外稳定传代且未转入外源基因的人前列腺癌细胞，将使人们能够真正地开始研究原发前列腺癌细胞的生物学特性和遗传调控机制，在此基础上揭示前列腺癌的发病机理、侵袭和转移的分子机制，以及体外筛选抗癌药物的药效学研究和检测，这些都将对基础和临床医学研究与应用具有重大意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人前列腺癌细胞。该细胞分离培养自临床病人的前列腺癌组织，该细胞未导入任何外源基因，染色体核型为46+1，X,Y；基因分型鉴定为国内外从未登记注册过的一种人前列腺癌细胞系。

本发明的另一目的在于提供上述人前列腺癌细胞的原代分离培养方法。

本发明的再一目的在于提供上述人前列腺癌细胞的传代培养方法。

本发明的目的还在于提供上述人前列腺癌细胞的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种人前列腺癌细胞，分类命名为人前列腺癌细胞HPCC/HL-002，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2013102。

该细胞来源于人前列腺癌细胞，染色体核型为46+1，X,Y；短串联重复序列（STR）基因型以16个“STR基因座/等位基因长度”来表示：AMEL/X/Y，CSF1PO/10/12, D13S317/12/14, D16S539/11/12, D18S51/12/15, D19S433/14/17.2，D21S11/29/30，D2S1338/18/25，D3S1358/17/18， D5S818/9/12，D7S820/9/11，D8S1179/12/13，FGA/18/26，TH01/6/9.3， TPOX/9/11，vWA/14/17。

所述的人前列腺癌细胞的培养条件优选为用HL培养基于37℃、5% CO₂培养；所述的HL培养基为：DMEM与 Ham’s F-12 NUTRIENT MIX 的混合培养基，体积配比为3:1，同时添加5%的胎牛血清，以及0.4μg/mL 皮质醇（hydrocortisone）, 5μg/mL胰岛素( insulin), 8.4ng/mL霍乱毒素（cholera toxin）, 10ng/mL表皮生长因子（epithelial growth factor (EGF)）, 24μg/mL腺嘌呤（adenine）, 100U/mL 青霉素（penicillin）和 100μg/mL链霉素（streptomycin），0.25µg/mL两性霉素B (Fungizone,) 30μM法舒地尔(Fasudil)(参见发明人已公开专利申请CN 103451148 A)。

上述人前列腺癌细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：

（1）在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集前列腺癌患者手术切除的癌组织样品。

（2）用95～100%（v/v）的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS（0.01M，pH7.4）洗，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪。

（3）将组织样品用消化液消化；优选的，所述的消化液为含胶原酶和分散酶的 HL培养基。

（4）消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25%（质量体积比）胰酶-EDTA中消化。

（5）加入含10%（v/v）FBS的DMEM培养基，离心去上清。

（6）加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品。

（7）再加入含10%（v/v）FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清。

（8）重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶培养，得到人前列腺癌细胞。

步骤（2）中所述的预冷优选为在冰上预冷。

步骤（3）中所述的消化液的用量优选为10倍于组织样品体积。

步骤（3）中所述的消化的条件优选为37℃消化1～3小时。

步骤（3）中所述的胶原酶和分散酶的浓度优选为均为0.2 mg/mL。

步骤（4）中所述的消化优选为冰上消化1小时或室温消化10分钟。

步骤（6）中所述的温水浴优选为37℃的温水浴。

步骤（4）、（5）、（7）中所述的离心优选为1000rpm离心5分钟。

步骤（8）中所述的培养的条件优选为37℃、5% CO₂。

上述人前列腺癌细胞的传代培养方法，包括如下步骤：

（1）当人前列腺癌细胞增殖至70～90%丰度时，用1×PBS（0.01M，pH7.4）洗涤细胞，再用0.05%（质量体积比）胰酶-EDTA消化单层细胞。

（2）加入DMEM中和消化反应；离心去上清，用HL培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养。

步骤（1）中所述的消化的时间优选为2～5分钟。

步骤（2）中所述的离心优选为1000 rpm离心5分钟。

步骤（2）中所述的培养的条件优选为37℃、5% CO₂。

上述人前列腺癌细胞可用于前列腺癌的发病机理、侵袭和转移的分子机制研究，以及筛选抗癌药物的药效学研究和检测。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

（1）本发明提供的人前列腺癌细胞，原代分离培养自人前列腺癌组织，该细胞未导入任何外源基因，经核型分析鉴定染色体核型为46+1，X,Y。

（2）本发明提供的人前列腺癌细胞，原代分离培养自人前列腺癌组织，经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人前列腺癌细胞系。

（3）本发明提供的人前列腺癌细胞，可用于前列腺癌的发病机理、侵袭和转移的分子机制研究，以及体外筛选抗癌药物的药效学研究和检测。

附图说明

图1是人前列腺癌细胞的细胞形态图。

图2是人前列腺癌细胞的增殖倍增曲线图。

图3是人前列腺癌细胞的染色体核型分析图。

图4是人前列腺癌细胞的STR基因分型图。

图5是人前列腺癌细胞在3D分化培养基中的生长形态图。

图6是人前列腺癌细胞异体移植瘤小鼠模型图。

图7是人前列腺癌细胞异体移植瘤的组织切片染色图。

图8是人前列腺癌细胞的药敏检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

【实施例1】人前列腺癌细胞的原代分离培养

（1）在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集57岁的前列腺癌患者手术切除的前列腺癌组织1–2 cm³(立方厘米)，该患者的临床分期为T3b低分化腺癌，无其它治疗。

（2）消化液的配制：含胶原酶和分散酶均0.2mg/mL的HL培养基；其中，HL培养基为：DMEM与 Ham’s F-12 NUTRIENT MIX 的混合培养基，体积配比为3:1，同时添加5%的胎牛血清，以及0.4μg/mL皮质醇（hydrocortisone）, 5μg/mL胰岛素( insulin), 8.4ng/mL霍乱毒素（cholera toxin）, 10ng/mL表皮生长因子（epithelial growth factor (EGF)）, 24μg/mL腺嘌呤（adenine）, 100U/mL青霉素（penicillin）和100μg/mL链霉素（streptomycin），0.25µg/mL两性霉素B (Fungizone,) 30μM法舒地尔(Fasudil)。

（3）用95～100%（v/v）的乙醇洗分离的组织样品1次，再用PBS（0.01M，pH 7.4）洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪。

（4）将组织样品1～2mm³（立方毫米）放入10mL消化液的14mL或50mL离心管中，37℃消化1小时。

（5）将消化后的组织低速离心（1000 rpm）5分钟，去除上清。

（6）将细胞沉淀重悬于2～5mL的0.25%（质量体积比）胰酶-EDTA中，置于冰上1小时或室温10分钟。

（7）然后加入10mL含10%（v/v）FBS的DMEM培养基，低速1000rmp离心5分钟；尽量将上清去除干净。

（8）加入2mL温水浴（37℃）的5mg/mL分散酶和200μL的1mg/mL DNase I，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1分钟。

（9）加入10mL含10%（v/v）FBS的DMEM，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5分钟，去除上清。

（10）重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5% CO₂。

按照上述方法分离培养成功的原代人前列腺癌细胞，显微镜下观察细胞的形态如图1，排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞。该细胞分类命名为“人前列腺癌细胞HPCC/HL-002(Human Prostate Cancer Cells HPCC/HL-002)”，已于2013年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国. 武汉. 武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：C2013102。

【实施例2】人前列腺癌细胞的传代培养

（1）当在T25或T75的培养瓶中培养的人前列腺癌细胞增殖至70～90%丰度时，用1×PBS（0.01M，pH7.4）洗涤细胞两次，再用0.05%（质量体积比）胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟。

（2）加入10mL完全DMEM中和消化反应1～2分种。

（3）1000rmp离心5分钟，去上清，重悬细胞沉淀于10mL HL培养基中接种培养。

（4）必要时可将1×10⁶人前列腺癌细胞重悬于1～2mL的细胞冻存液（90%胎牛血清和10% DMSO，v/v）中，储存于液氮中备用。

按照上述方法传代培养人前列腺癌细胞，培养建系的细胞增殖倍增曲线如图2，连续传代培养90天，培养代数超过50代以上，本发明的人前列腺癌细胞仍能保持增殖状态在体外生长增殖。

【实施例3】人前列腺癌细胞的核型分析鉴定

（1）当人前列腺癌细胞（1×10⁶）处于指数生长期时，加秋水仙素，终浓度为0.2μg/mL，继续培养3.5小时。

（2）反复吹打细胞使其脱落，2000rpm离心5分钟收获细胞。

（3）弃上清液，加入37℃预温的0.075mol/LKCl溶液8mL，轻轻吹打细胞团混匀，置37℃低渗处理25分钟。

（4）加入1mL新配制的固定剂（甲醇 : 冰乙酸=3 : 1，v/v），小心吹打、混匀，2000rpm离心5分钟。

（5）弃上清液，加入8mL固定剂，吹打制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。

（6）2000rpm离心5分钟，弃上清液，重复固定一次。

（7）弃上清液，加入数滴固定剂制成细胞悬液，取2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上。

（8）将载玻片置70℃烤箱中干烤2小时，自然冷却。

（9）2.5%（质量体积比）胰酶溶液（pH6.8～7.2）5mL处理25～45秒钟。

（10）37℃预温的生理盐水漂洗，Giemsa染色5～10分钟，做G显带分析。

（11）显微镜下观察细胞核型并摄影，进行核型分析；共计数30个有丝分裂中期分裂相，其中12个为: 46-XY ，18个为: 47-XY。代表性的细胞核型分析结果见图3，人前列腺癌细胞染色体核型异常，为46+1，X,Y。

【实施例4】人前列腺癌细胞的基因分型鉴定

（1）贴壁生长的人前列腺癌细胞（1×10⁶），用1×PBS洗涤细胞两次，0.05%胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟，10mL完全DMEM中和消化反应。

（2）10000rpm离心1分钟，倒尽上清，加200μL缓冲液GA（细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司），振荡至彻底悬浮。

（3）加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

（4）加入200μL缓冲液GB（细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司），充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心。

（5）加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心。

（6）将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司），12000rpm 离心30秒，去废液。

（7）向吸附柱中加入500μL缓冲液GD（细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司），12000rpm 离心30秒，去废液。

（8）向吸附柱中加入600μL漂洗液PW（细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司），12000rpm离心30秒，去废液。

（9）将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～200μL洗脱缓冲液TE（细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司），室温放置2～5 min，12000 rpm（～13400×g）离心2分钟，将提取的DNA溶液收集到离心管中。

（10）利用PowerPlex® 16 HS系统（DC2101，promega公司）进行16个基因座（15个STR位点和1个性别位点）的DNA复合扩增。

（11）使用ABI PRISM® 3100型遗传分析仪（1.1版本数据收集软件）进行扩增片段的检测。

（12）使用Genotyper®和PowerTyperTM 16 Macro软件分析样本数据，进行自动基因分型，STR分型结果见图4，检测16个STR基因位点，以“STR基因座/等位基因长度”来表示：AMEL/X/Y，CSF1PO/10/12, D13S317/12/14, D16S539/11/12, D18S51/12/15, D19S433/14/17.2，D21S11/29/30，D2S1338/18/25，D3S1358/17/18，D5S818/9/12，D7S820/9/11，D8S1179/12/13，FGA/18/26，TH01/6/9.3，TPOX/9/11，vWA/14/17。

本发明的人前列腺癌细胞经STR基因分型，是国内外从未登记注册过的一种人前列腺癌细胞系。

【实施例5】人前列腺癌细胞的3D培养、固定及HE染色

（1）将matrigel（BD，BD Biosciences）于4℃过夜溶解。

（2）冰上充分预冷的24-孔细胞培养板中，均匀加入50μL的matrigel平铺底部成一层，置于37℃的培养箱15-30分钟，使matrigel形成胶状。

（3）胰酶-EDTA常规消化人前列腺癌细胞3-5分钟，完全DMEM中和消化反应。

（4）1000rmp离心5分钟，去上清，重悬细胞沉淀于250μL的HL培养基中，加入上述（2）制备的24孔培养板中，置于37℃的培养箱15-30分钟。

（5）冰上充分预冷的HL培养基250μL中加入10%的matrigel，微量枪头混匀后沿培养板壁小心加入24孔培养板中。

（6）最终的细胞浓度约为0.50–0.60×10⁶ /mL，并于37℃、5% CO₂条件下培养6天，每2天更换一次培养基。

（7）小心吸去培养基，用500μL的预冷的PBS洗2次

（8）4%多聚甲醛于室温固定10分钟，常规HE染色后显微镜下观察并摄影。

按照上述方法在3D分化培养基中培养的人前列腺癌细胞，经固定和HE染色后，显微镜下观察细胞的形态如图5（细胞为未正常分化的细胞积团，不形成紧密清晰的组织结构）。

【实施例6】人前列腺癌细胞异体移植瘤小鼠模型

（1）处于对数生长期的人前列腺癌细胞（细胞计数约1×10⁶），胰酶-EDTA常规消化3-5分钟，完全DMEM中和消化反应。

（2）1000rmp离心5分钟，去上清，重悬细胞沉淀于200μL的Matrigel HC（BD，BD Biosciences）中。

（3）重度联合免疫缺陷的6周龄雄性小鼠，将人前列腺癌细胞的Matrigel HC悬液，经皮下接种小鼠，每只小鼠接种左、右2个位点（见图6），共计10个位点（5只）。

（4）每周观察测量移植瘤的大小如图6，8周后处死小鼠。

（5）取小鼠形成的移植瘤，常规组织包埋、切片、HE染色，显微镜下观察并摄影。

按照上述方法建立的人前列腺癌细胞异体移植瘤，经组织包埋、固定和HE染色后，显微镜下观察前列腺癌组织的病理切片如图7（多数细胞着色深，肿瘤细胞生长增殖旺盛）。

【实施例7】人前列腺癌细胞的化疗药物敏感性检测

（1）将人前列腺癌细胞用0.05%胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种细胞悬液100μL，每孔约为5000个细胞，于37℃、5% CO₂培养箱培养。

（2）第二天加药（erlotinib、SAHA）处理，每孔加入10μL不同浓度药物，药物浓度梯度（μM）为0.6、1.25、2.5、5.0、10、20、40，每种药物的每个梯度设置三个复孔，同时设置细胞对照组（接种细胞不加药处理）及只加HL培养基的空白对照组，每组设置三个复孔。erlotinib（Tarceva）用于两个或两个以上化疗方案失败的局部晚期或转移的非小细胞肺癌的三线治疗；SAHA(Zolinza®)为美国Merck公司开发的第一个用于治疗持续、恶化或在用其他药治疗期间或之后复发的皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)药物。

（3）药物处理（37℃、5% CO₂培养箱培养）48小时后，吸去孔内溶液，每孔加入10μL CKK-8检测试剂（碧云天，上海），即10μL CCK-8 + 90μL HL培养基。

（4）在37℃、5% CO₂细胞培养箱内继续孵育0.5～2个小时，孵育时间跟细胞量的多少相关，具体时间根据预实验确定（可根据液体颜色变化来初步确定），吸光度范围控制在1.0～1.5之间最好。

（5）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

人前列腺癌细胞对上述2种抗癌药物erlotinib、SAHA的敏感性（毒性）检测结果如图8。erlotinib在低浓度10uM以下时对细胞存活率影响较小，高浓度40uM时使细胞存活率降低至60%。而SAHA在低浓度就显示明显杀细胞作用，5uM可以使细胞存活率降至50%，高浓度40uM时则使细胞存活率仅为20%。以上实验表明人前列腺癌细胞对不同抗癌药物的敏感性和区分度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种人前列腺癌细胞，其特征在于, 命名为人前列腺癌细胞HPCC/HL-002，保藏编号为CCTCC NO：C2013102。

2.根据权利要求1所述的人前列腺癌细胞，其特征在于, 染色体为46+1，X,Y，短串联重复序列基因型以16个短串联重复序列基因座/等位基因长度来表示：AMEL/X/Y，CSF1PO/10/12, D13S317/12/14, D16S539/11/12, D18S51/12/15, D19S433/14/17.2，D21S11/29/30，D2S1338/18/25，D3S1358/17/18， D5S818/9/12，D7S820/9/11，D8S1179/12/13，FGA/18/26，TH01/6/9.3， TPOX/9/11，VWA/14/17。

3.权利要求1或2所述的人前列腺癌细胞的原代分离培养方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）收集前列腺癌患者手术切除的癌组织样品；

（2）用95～100%的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS洗，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；

（3）将组织样品用消化液消化；所述的消化液为含胶原酶和分散酶的 HL培养基；

（4）消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25%胰酶-EDTA中消化；

（5）加入含10% 胎牛血清的DMEM培养基，离心去上清；

（6）加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品；

（7）再加入含10% 胎牛血清的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；

4.根据权利要求3所述的人前列腺癌细胞的原代分离培养方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的预冷为在冰上预冷；

步骤（3）中所述的消化液的用量为10倍于组织样品体积，所述的消化的条件为37℃消化1～3小时；

步骤（3）中所述的胶原酶和分散酶的浓度均为0.2 mg/mL。

5.根据权利要求3所述的人前列腺癌细胞的原代分离培养方法，其特征在于：

步骤（4）中所述的消化为冰上消化1小时或室温消化10分钟；

步骤（6）中所述的温水浴为37℃的温水浴；

步骤（8）中所述的培养的条件为37℃、5% CO₂。

6.根据权利要求3所述的人前列腺癌细胞的原代分离培养方法，其特征在于：

步骤（4）、（5）、（7）中所述的离心为1000rpm离心5分钟。

7.权利要求1或2所述的人前列腺癌细胞的传代培养方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）当人前列腺癌细胞增殖至70～90%丰度时，用PBS洗涤细胞，再用0.05%胰酶-EDTA消化单层细胞；

8.根据权利要求7所述的人前列腺癌细胞的传代培养方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的消化的时间为2～5分钟；

步骤（2）中所述的离心为1000rpm离心5分钟，所述的培养的条件为37℃、5% CO₂。

9.权利要求1或2所述的人前列腺癌细胞可用于前列腺癌的发病机理、侵袭和转移的分子机制研究，以及体外筛选抗癌药物的药效学研究和检测。