CN104087663B - Prl-1基因在制备诊断和/或治疗肝癌产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术和医学领域,具体涉及一种PRL-1基因在制备治疗和/或诊断肝癌产品中的应用。本发明证明PRL-1在HCC组织中频繁高表达(81%),PRL-1表达升高与HCC病人的侵袭表型及更差预后明显相关(P<0.05)。外源过表达PRL-1明显增加肝癌细胞的迁移和侵袭。并且PI3K/AKT/GSK3β信号通路通过抑制E-cadherin的表达介导PRL-1的致癌功能。此外,脉管癌栓中PRL-1的蛋白水平明显高于原发病灶。因此PRL-1基因可作为诊断肝癌的特异标志基因,使肝癌诊断更加准确、快速。本发明PRL-1基因为防治肝癌提供了新的治疗靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域,具体涉及一种PRL-1基因在制备诊断和/或治疗肝癌产品中的应用。
背景技术
肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界第五大肿瘤,在癌症相关死因顺位中占第三位。超过75%的肝细胞癌病人在术后5年内复发和/或转移,成为这部分病人死亡的主要原因。可逆性的蛋白酪氨酸磷酸化对于调节各种信号通路(包括参与肿瘤细胞粘附、侵袭和转移的信号通路)非常关键,它的平衡由蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)两大家族调控。与PTKs大家族相比,PTPs超家族还未得到广泛研究。PTPs的肝再生磷酸酶(PRLs)亚家族是一类独特的法尼基化磷酸酶,因其成员PRL-3在结直肠癌转移灶中高表达而受到广泛关注。
在PRLs亚家族成员中,PRL-3研究得最为透彻,且其表达升高与多种肿瘤(包括结直肠癌、乳腺癌、胃癌)的进展和转移相关。PRL-3有望成为潜在的肿瘤预后标志物和治疗靶点。与PRL-3对比,PRLs的另外两个成员,PRL-1(又名PTP4a1)和PRL-2研究得较少。尽管PRL-1磷酸酶最先在再生肝组织中被发现,然而其在肿瘤细胞尤其是肝癌细胞中的功能及其机制仍十分不清楚。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点和不足,提供一种PRL-1基因在制备诊断肝癌产品中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述基因在制备治疗肝癌产品中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种PRL-1基因在制备诊断肝癌产品中的应用,所述的诊断肝癌产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断肝癌的产品;
所述的通过RT-PCR诊断肝癌的产品包括至少一对特异扩增PRL-1基因的引物;
所述的特异扩增PRL-1基因的引物优选为引物PRL-1-CDS-F和引物PRL-1-CDS-R:
引物PRL-1-CDS-F:
5’-GGAAGATCTGCCAACATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGCTCGAATGAACCGC-3’;
引物PRL-1-CDS-R:
5’-CGGCTCGAGTTATTGAATGCAACAGTTGTTTCTATGAC-3’;
所述的通过实时定量PCR诊断肝癌的产品包括至少一对特异扩增PRL-1基因的引物;
所述的特异扩增PRL-1基因的引物优选为引物PRL-1-F和引物PRL-1-R:
引物PRL-1-F:5’-ACCAATGCGACCTTAAACAAA-3’;
引物PRL-1-R:5’-AATCTGGTTGGATGGTGGTG-3’;
所述的通过免疫检测诊断肝癌的产品包括:与PRL-1蛋白特异性结合的抗体,包括多克隆抗体和单克隆抗体;
所述的通过原位杂交诊断肝癌的产品包括:与PRL-1基因的核酸序列杂交的探针;
所述的通过基因芯片诊断肝癌的产品包括:与PRL-1基因的核酸序列杂交的探针;
在本发明中,可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对PRL-1蛋白特异的抗体。例如,将提纯的人PRL-1基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样,表达人PRL-1蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体,这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备(例如,Kohleretal.,Nature256:495,1975;Kohleretal.,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohleretal.,Eur.J.Immunol.6:292,1976)。本发明的抗体包括可以阻抑PRL-1功能的抗体,也可以是不影响人PRL-1功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人PRL-1基因产物的片段或功能域致免疫而产生,而人PRL-1基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的PRL-1基因产物结合的抗体,可以利用在原核细胞例如E.coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化PRL-1蛋白或多肽结合的抗体,可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。
在本发明中,所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过30个碱基对,与目的核苷酸序列互补的长度以15~25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对,以免影响杂交效率。
一种PRL-1基因在制备治疗肝癌产品中的应用,所述的治疗肝癌产品包括:通过RNA干扰抑制PRL-1基因表达的双链核糖核酸、基于PRL-1抗原蛋白的肿瘤疫苗和用于抑制PRL-1蛋白活性的化学分子。
所述的通过RNA干扰抑制PRL-1基因表达的双链核糖核酸优选为靶向PRL-1基因的siRNA;
所述的靶向PRL-1基因的siRNA为siRNA#1或siRNA#2;
所述的siRNA#1的序列为:
siRNA#1-sense:5’-GUUUAAGGUCGCAUUGGUUGGTT-3’;
siRNA#1-antisense:5’-CCAACCAAUGCGACCUUAAACTT-5’;
所述的siRNA#2的序列为:
siRNA#2-sense:5’-CCAACCAAUGCGACCUUAAACAAAU-3’;
siRNA#2-antisense:5’-AUUUGUUUAAGGUCGCAUUGGUUGG-5’。
在本发明中,所述RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势,主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法,并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明实验证明PRL-1在HCC组织中频繁高表达(81%),PRL-1表达升高与HCC病人的侵袭表型及更差预后明显相关(P<0.05)。外源过表达PRL-1明显增加肝癌细胞的迁移和侵袭。并且PI3K/AKT/GSK3β信号通路通过抑制E-cadherin的表达介导PRL-1的致癌功能。此外,脉管癌栓中PRL-1的蛋白水平明显高于原发病灶。因此PRL-1基因可作为肝细胞肝癌诊断或预后判断标志物。
(2)本发明PRL-1基因为防治肝癌提供了新的治疗靶点。
附图说明
图1是实施例1中HCC患者PRL-1的拷贝数分析图,其中,黑箭头代表存在Chr6:q12区域扩增。
图2是实施例1中免疫组化染色强度结果分析图(×200),其中a:正常肝组织低表达,b~d:分别代表HCC组织低、中、高表达。
图3是实施例1中IHC检测7例正常肝和167例HCC组织中PRL-1的表达水平分析图(KruskalWallisTest,P<0.001)。
图4是实施例2中PRL-1在HCC中表达的生存分析图。
图5是实施例3中成功稳转后的肝癌细胞株鉴定图,其中(a):pMSCV空载体和pMSCV-HA-PRL-1成功稳转肝癌细胞株的荧光结果;(b):Westernblot实验证实PRL-1外源基因在肝癌细胞中成功表达的结果;Huh7-ctrl:稳转空载体的Huh7细胞;Huh7-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的Huh7细胞;SK-ctrl:稳转空载体的SK-hep1细胞;SK-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的SK-hep1细胞。
图6是实施例3中迁移实验结果分析图,其中,Huh7-ctrl:稳转空载体的Huh7细胞;Huh7-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的Huh7细胞;(a):Huh7-ctrl组和Huh7-HA-PRL-1组显微镜下迁移变化;(b):Huh7-ctrl组和Huh7-HA-PRL-1组的细胞相对迁移率比较结果。
图7是实施例3中侵袭实验结果分析图,其中,Huh7-ctrl:稳转空载体的Huh7细胞;Huh7-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的Huh7细胞;SK-ctrl:稳转空载体的SK-hep1细胞;SK-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的SK-hep1细胞;(a):Huh7-ctrl组和Huh7-HA-PRL-1组以及SK-ctrl组和SK-HA-PRL-1组显微镜下细胞侵袭能力变化;(b):Huh7-ctrl组和Huh7-HA-PRL-1组以及SK-ctrl组和SK-HA-PRL-1组细胞侵袭效果统计分析。
图8PRL-1基因过表达的Huh7细胞和SK-hep1细胞与PRL-1基因沉默的HepG2细胞中E-cadherinmRNA表达结果分析图,其中,Huh7-ctrl:稳转空载体的Huh7细胞;Huh7-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的Huh7细胞;SK-ctrl:稳转空载体的SK-hep1细胞;SK-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的SK-hep1细胞;si-NC:HepG2细胞siRNA阴性对照组;si-PRL-1#1:HepG2细胞PRL-1特异性siRNA1组;si-PRL-1#2:HepG2细胞PRL-1特异性siRNA2组;(a):Huh7-ctrl组和Huh7-HA-PRL-1组E-cadherinmRNA表达结果分析;(b):SK-ctrl组和SK-HA-PRL-1组E-cadherinmRNA表达结果分析;(c):si-NC组、si-PRL-1#1组和si-PRL-1#2组E-cadherinmRNA表达结果分析。
图9是PRL-1基因过表达的Huh7细胞和SK-hep1细胞与PRL-1基因沉默的HepG2细胞中p-AKT(Ser474)、p-GSK3β(Ser9)、Snail和E-cadherin表达情况的Westernblot凝胶电泳图,其中,Huh7-ctrl:稳转空载体的Huh7细胞;Huh7-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的Huh7细胞;SK-ctrl:稳转空载体的SK-hep1细胞;SK-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的SK-hep1细胞;si-NC:HepG2细胞siRNA阴性对照组;si-PRL-1#1:HepG2细胞PRL-1特异性siRNA1组;si-PRL-1#2:HepG2细胞PRL-1特异性siRNA2组;(a):Huh7-ctrl组和Huh7-HA-PRL-1组p-AKT(Ser474)、p-GSK3β(Ser9)、Snail和E-cadherin表达结果分析;(b):SK-ctrl组和SK-HA-PRL-1组p-AKT(Ser474)、p-GSK3β(Ser9)、Snail和E-cadherin表达结果分析;(c):si-NC组、si-PRL-1#1组和si-PRL-1#2组p-AKT(Ser474)、p-GSK3β(Ser9)、Snail和E-cadherin表达结果分析。
图10是实施例4中的免疫荧光实验结果分析图,其中,Huh7-ctrl:稳转空载体的Huh7细胞;Huh7-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的Huh7细胞;SK-ctrl:稳转空载体的SK-hep1细胞;SK-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的SK-hep1细胞。
图11是实施例4中IHC检测肝癌组织中PRL-1与E-cadherin表达结果分析图,其中,(a):低倍镜100倍和高倍镜200倍下IHC检测结果;(b):IHC检测结果统计分析;(c):IHC检测相关分析。
图12是实施例5中不同浓度的PI3K抑制剂(ZSTK474)处理48h后的Huh-HA-PRL-1细胞中p-AKT(Ser474)、p-GSK3β(Ser9)、Snail和E-cadherin表达情况的Westernblot图,其中,Huh7-HA-PRL-1:稳转pMSCV-HA-PRL-1的Huh7细胞。
图13是实施例6中的迁移实验结果分析图,其中,mock:阴性对照,含DMSO,不含ZSTK474试剂;(a):mock组与ZSTK474处理后的Huh7-HA-PRL-1组显微镜下细胞迁移变化;(b):mock组和ZSTK474处理后的Huh7-HA-PRL-1组相对迁移率比较结果;标尺:400um。
图14是实施例6中的侵袭实验结果分析图,其中,mock:阴性对照,含DMSO,不含ZSTK474试剂;(a):mock组与ZSTK474处理后的Huh7-HA-PRL-1组和SK-HA-PRL-1组显微镜下细胞侵袭能力变化;(b):mock组与ZSTK474处理后的Huh7-HA-PRL-1组和SK-HA-PRL-1组侵袭效果统计分析;标尺:40um。
图15是IHC比较原发HCC病灶和转移性血管癌栓中PRL-1表达结果分析图,其中,A:3个例子显示转移性癌栓(空心箭头)PRL-1染色强度高于原发病灶(实心箭头);a、b和c:放大100倍,d、e、f:放大200倍;B:血管癌栓和原发HCC病灶的IHC染色评分,▲:原发病灶;●:转移性血管癌栓。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1HCC组织中PRL-1基因拷贝数扩增且其蛋白水平高表达
(1)DNA提取及高密度SNP-Chip分析:
收集中山大学肿瘤防治中心肝胆外科接受肝脏手术的肝癌患者60例。肝癌组织是在伦理委员会批准以及患者知情同意情况下获取的,所收集的标本均为病理诊断明确为肝细胞肝癌患者的标本。蛋白酶K-苯酚-氯仿方法(YinD,OgawaS,KawamataN,etal.High-resolutiongenomiccopynumberprofilingofglioblastomamultiformebysinglenucleotidepolymorphismDNAmicroarray.MolCancerRes.2009;7:665-677)提取人肝癌组织DNA,人50kXbaI/250kNsp芯片(SNP-Chip,Affymetrix)用于检测HCC样本DNA,“CNAG”软件包用于HCC样本DNA拷贝数分析(NannyaY,SanadaM,NakazakiK,etal.Arobustalgorithmforcopynumberdetectionusinghigh-densityoligonucleotidesinglenucleotidepolymorphismgenotypingarrays.CancerRes65(14):6071-9,2005.)。注:CNAG:CopyNumberAnalyzerforAffymetrixGeneChipMapping100Karrays)。
(2)免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)技术分析及评价:
收集中山大学孙逸仙纪念医院肝胆胰外科2000年6月至2007年9月接受肝脏手术的肝癌患者167例(其中,男性142例,女性25例),年龄10~78(50.93±12.86)岁;“正常肝组织”来源于7例肝血管瘤患者。肝癌、癌旁组织和“正常肝组织”是在伦理委员会批准以及患者知情同意情况下获取的。所收集的肝癌标本均为病理诊断明确,且具有完整的随访资料、术前没有接受任何局部或全身治疗。
上述肝组织石蜡切片经烤片、梯度水化后用3%(m/m)过氧化氢室温下阻断内源性过氧化物酶活性15min;10mmol/L枸橼酸盐(pH=6.0)高压热修复3min,然后5%(m/m)山羊血清室温下封闭30min,抗-PRL-1抗体(购自CellSignalingTechnology公司)4℃孵育过夜,PBS代替一抗作为阴性对照;鼠兔通用型二抗(购自基因科技公司)室温孵育1h后用二氨基联苯胺(DAB)染色液染色,苏木精复染,脱水,最后封片。显微镜下拍照,用IPP(ImageProPlus)软件将组织染色强度进行评分。
结果分析:
HCC临床样本的DNA拷贝数分析结果显示约12%(7/60)的样本存在Chr6:q12区域扩增,其中2例Chr6:q12扩增区域很窄,且DNA拷贝数高频扩增。Chr6:q12片段的公共最小扩增区域(CMAR)仅含有PRL-1和PHF3两个基因(图1)。由于PRL-1基因是再生肝中表达的一个及早基因,本发明将研究焦点放在PRL-1基因上。
利用IHC技术检测了167例肝癌样本及7例正常肝组织中PRL-1蛋白表达水平。免疫组化染色强度分为低、中、高三组(图2)。与正常肝组织相比,HCC中PRL-1水平明显高表达,约65%(109/167)HCC样本有高的PRL-1染色,15%(25/167)HCC样本为中度染色,以及20%(33/167)HCC样本为低染色(图3)。与HCC组织对比,7例正常肝组织均表现为低的免疫组化染色。综合分析SNP芯片结果及蛋白表达数据(图3)表明PRL-1基因在HCC中可能作为癌基因发挥作用。
实施例2HCC中PRL-1高表达与侵袭表型和差的预后相关
统计学处理:
SPSS软件包(SPSS13.0,SPSSInc)进行统计学分析。用相关分析研究实施例1中167例HCC样本中PRL-1表达与临床病理参数之间的相关关系;Kaplan-Meier法比较上述样本中PRL-1不同表达组之间的预后差异;单因素或多因素Cox比例风险回归模型计算上述样本的风险比(95%CI和P值)。
结果分析:
用相关分析、Kaplan-Meier法和Cox回归分析检测HCC病人PRL-1蛋白表达的临床病理和预后意义。高PRL-1蛋白表达水平与更侵袭性肿瘤表型(如TNM分期、肿瘤癌栓)明显相关(P<0.05,表1);PRL-1高表达组的中位生存时间(10.07个月)比低/中表达组(26.07个月)明显缩短(P=0.0136,图4)。单因素Cox回归分析也显示高表达PRL-1的HCC患者其总生存时间(OS)更短(P=0.012,表2)。另外,多因素Cox回归分析进一步揭示PRL-1高表达是HCC患者OS差的独立预后指标(p=0.017,表2)。
表1PRL-1表达水平与HCC患者临床病例特征之间的关系
a有删失数据的病例未纳入分析
b卡方检验所得P值
AFP,甲胎蛋白;HBV,乙型肝炎病毒;TNM,肿瘤-淋巴结-转移
*p<0.05
表2单因素和多因素分析与HCC患者总预后相关的因素
在140例HCC病例中用单因素或多因素Cox比例风险回归模型计算风险比(95%CI)和P值;
AFP,甲胎蛋白;HBV,乙型肝炎病毒;TNM,肿瘤-淋巴结-转移
实施例3外源过表达PRL-1促进肝癌细胞迁移和侵袭
(1)逆转录病毒pMSCV-HA-PRL-1载体构建:
通过GeneBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)查询人PRL-1基因(NM_003463.3)的mRNA信息,用PrimerPrimer5.0软件设计引物PRL-1-CDS-F与PRL-1-CDS-R,用于扩增PRL-1基因CDS全长序列。其中,所述引物序列为:
PRL-1-CDS-F:
5’-GGAAGATCTGCCAACATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGCTCGAATGAACCGC-3’(加粗斜体部分为含HA标签序列;下划线部分为BgiII限制性酶切位点);
PRL-1-CDS-R:5’-CGGCTCGAGTTATTGAATGCAACAGTTGTTTCTATGAC-3’(下划线部分为XhoI限制性酶切位点);
PCR扩增PRL-1基因CDS全长序列,反应体系(20μL体系):primeSTARHS10μL,PRL-1-CDS-F0.6μL,PRL-1-CDS-R0.6μL,cDNA1μL,RNasefreewater7.8μL;
反应条件如下:98℃5min预变性;98℃30s,58℃20s,72℃1min,共30个循环;72℃10min,4℃终止。1%(m/m)的琼脂糖凝胶电泳判断克隆片段大小符合预期后,切胶回收目的基因。BgiII和XhoI酶切克隆片段和pMSCV-PIG空载体(购自addgene)后将两者连接,连接反应体系(10μL):10×buffer1μL,T4ligase0.5μL,克隆片段酶切回收产物6.5μL,pMSCV-PIG空载体酶切回收产物2μL。连接反应程序:16℃,30min。转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布平板过夜培养。挑取菌落PCR初步验证,鉴定引物为:
PRL-1-CDS-F:
5’-GGAAGATCTGCCAACATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGCTCGAATGAACCGC-3’;
pMSCV-PIG-R:5’-CAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGC-3’;
阳性克隆且片段大小符合预期的细菌扩增培养,提取质粒,送华大基因公司测序,测序引物为pMSCV-PIG-R:5’-CAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGC-3’。测序序列正确则表明载体pMSCV-HA-PRL-1构建成功。
(2)pMSCV-HA-PRL-1肝癌稳转细胞株的建立:
①用Lipofectamine2000(Invitrogen,美国)将pMSCV-HA-PRL-1表达载体和Evector、Gvector辅助载体(购自addgene)共转染HEK293T包装细胞(购自ATCC细胞库),其中空载体pMSCV-PIG作为对照。收集转染后36至60小时细胞上清液并过滤,过滤的病毒上清液加6μg/mLPolybrene(购自Sigma-Aldrich公司)感染肝癌细胞株Huh7和SK-hep1(购自ATCC细胞库)48小时。随后用含4μg/mLpuromycin(购自Sigma-Aldrich公司)DMEM高糖培养基(购自GIBCO公司)加压筛选2周,得到pMSCV-HA-PRL-1肝癌稳转细胞株Huh7-HA-PRL-1和SK-HA-PRL-1以及稳转空载体的Huh7细胞Huh7-ctrl和稳转空载体的SK-hep1细胞SK-ctrl。存活的抗puromycin细胞进行荧光显微镜检测。
②Westernblot实验:
用细胞裂解液(购自博彩生物公司)分别裂解步骤①得到的稳转细胞株Huh7-ctrl、Huh7-HA-PRL-1、SK-ctrl、SK-HA-PRL-1,每25μg等份的变性蛋白用10%(m/m)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后转膜至0.22μmPVDF膜(购自Millipore公司)上。5%(m/m)的脱脂牛奶室温下封闭2小时。用兔来源的多克隆抗体抗-HA抗体(购自cellsignalingtechnology公司,1:1000稀释)4℃孵育过夜。TBST液洗膜10min,3次。HRP连接的抗兔二抗(购自cellsignalingtechnology公司)室温下孵育1小时。TBST液洗膜10min,3次。用SuperSignalWestDura发光液(购自Thermo公司)曝光显像。GAPDH作为内参。
通过上述荧光显微镜检测和Westernblot实验证实外源PRL-1基因是否在HCC细胞中表达,若表达则成功建立pMSCV-HA-PRL-1肝癌稳转细胞株Huh7-HA-PRL-1和SK-HA-PRL-1。
(3)迁移实验:
将步骤(2)得到的稳转细胞株Huh7-ctrl和Huh7-HA-PRL-1分别融合至95%以上时用200uL枪头划痕,创造出无细胞区,24小时后观察“伤口愈合”程度,并在显微镜在拍照。跟起初的间距相比,细胞迁移覆盖的比例即定义为细胞迁移率。
(4)侵袭实验:
将105个步骤(2)得到的稳转细胞株Huh7-ctrl、Huh7-HA-PRL-1、SK-ctrl或SK-HA-PRL-1加入到含有Matrigel胶的上室,下室培养基含有10%(V/V)FBS作为趋化吸引。10小时(SK-hep1细胞)或12小时(Huh7细胞)后用棉棒轻轻去除非侵袭细胞,侵袭细胞位于小室的下室面,用4%(m/m)多聚甲醛固定,结晶紫染色,风干并拍照。
结果分析:
扩增人PRL-1基因CDS序列并与逆转录病毒载体pMSCV-PIG连接,得到表达载体pMSCV-HA-PRL-1,将表达载体pMSCV-HA-PRL-1稳定转染HCC细胞株(Huh7和SK-hep1),荧光显微镜检测和Westernblot实验证明外源PRL-1基因已在HCC细胞中稳定表达(图5)。划痕实验和Matrigel胶侵袭实验显示与稳转空载体细胞相比,稳转了PRL-1的Huh7和SK-hep1细胞其迁移和侵袭能力明显增加(P<0.01,图6、7)。
实施例4PRL-1抑制HCC细胞株中E-cadherin表达且HCC组织中PRL-1与E-cadherin表达存在负相关
本实施例通过qRT-PCR、Westernblot技术分别检测PRL-1过表达的Huh7和SK-hep1细胞以及PRL-1沉默的HepG2细胞中E-cadherinmRNA和蛋白水平变化;用IF技术研究PRL-1与E-cadherin表达关系,并在连续石蜡切片中用IHC技术进一步证实这种关系,具体实验步骤如下:
(1)RNA干扰:
用“X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent”转染试剂(购自Roche公司)按照说明书将特异性针对PRL-1的siRNA(siRNA#1和siRNA#2)和相应的对照siRNA(购自上海吉玛公司)转染至肝癌HepG2细胞株,转染后48小时用Westernblot实验(具体方法参照实施例3)证实靶基因沉默效果。其中,相关siRNA序列如下所示:
对照siRNA-sense:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;
对照siRNA-antisense:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’;
siRNA#1-sense:5’-GUUUAAGGUCGCAUUGGUUGGTT-3’;
siRNA#1-antisense:5’-CCAACCAAUGCGACCUUAAACTT-5’
siRNA#2-sense:5’-CCAACCAAUGCGACCUUAAACAAAU-3’;
siRNA#2-antisense:5’-AUUUGUUUAAGGUCGCAUUGGUUGG-5’;
(2)RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR):
用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)分别提取实施例3得到的稳转细胞株Huh7-ctrl、Huh7-HA-PRL-1、SK-ctrl和SK-HA-PRL-1以及本实施例步骤(1)得到的HepG2细胞si-NC、si-PRL-1#1和si-PRL-1#2不同处理组的总RNA;用PrimeScriptRTase(购自Takara公司)按照说明书合成cDNA;用PremixExTaq试剂(购自Takara公司)按照说明书在LightCycler480机器(Roche公司)上对PRL-1、E-cadherin和GAPDH(作为内参)进行实时荧光定量PCR。反应引物如下:
引物PRL-1-F:5’-ACCAATGCGACCTTAAACAAA-3’;
引物PRL-1-R:5’-AATCTGGTTGGATGGTGGTG-3’;
引物E-cadherin-F:5’-CGTCCTGGGCAGAGTGAA-3’;
引物E-cadherin-R:5’-GGCGTAGACCAAGAAATGGA-3’;
引物GAPDH-F:5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’;
引物GAPDH-R:5’-GAATTTGCCATGGGTGGA-3’。
反应体系(20μL):premixExTaq(2×)10μL,正向引物0.4μL,反向引物0.4μL,cDNA1μL,RNasefreewater8.2μL。
反应条件如下:95℃3min预变性;95℃5s,59℃15s,72℃20s,共40个循环;95℃0s,65℃15s,95℃continutous,为融解曲线反应。
(3)Westernblot实验:
用细胞裂解液(购自博彩生物公司)分别裂解实施例3得到的稳转细胞株Huh7-ctrl、Huh7-HA-PRL-1、SK-ctrl、SK-HA-PRL-1以及本实施例步骤(1)得到的HepG2细胞si-NC、si-PRL-1#1和si-PRL-1#2不同处理组。每25μg等份的变性蛋白用质量分数为10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后转膜至0.22μmPVDF膜(购自Millipore公司)上。5%(m/m)的脱脂牛奶室温下封闭2小时。用以下兔来源的多克隆抗体4℃孵育过夜:抗-E-cadherin、抗-PRL-1和抗-HA抗体。TBST液洗膜10min,3次。HRP连接的抗兔二抗室温下孵育1小时。TBST液洗膜10min,3次。用SuperSignalWestDura发光液(购自Thermo公司)曝光显像。GAPDH作为内参。PRL-1抗体购自Abgent公司外,E-cadherin和HA抗体购自CellSignalingTechnology公司。所有抗体均按1:1000稀释。
(4)免疫荧光实验:
实施例3得到的稳转细胞株Huh7-ctrl、Huh7-HA-PRL-1、SK-ctrl、SK-HA-PRL-1分别在玻璃底的皿(购自Nest公司)中培养,至细胞融合50~70%时,用PBST洗涤3次,4%(m/m)多聚甲醛固定。用鼠来源的抗-HA抗体(1:400稀释)和兔来源的抗-E-cadherin抗体(购自CellSignalingTechnology公司)(1:200稀释)4℃孵育过夜;彻底洗涤后,用荧光素偶联的二抗(Pyld偶联的羊抗鼠、APC偶联的羊抗兔)(分别购自BD公司、SantaCruzBiotechnology公司)室温孵育1小时。细胞洗涤后用0.5μg/mLDAPI(购自VectorLaboratories公司)染色。最后,细胞用PBST洗涤三次后用激光共聚焦显微镜(ZeissLSM710,德国)拍照。
(5)免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)技术分析及评价:
具体步骤参照实施例1,其中,一抗为抗-PRL-1和抗-E-cadherin抗体(均购自CellSignalingTechnology公司);二抗(购自基因科技公司);
结果分析:
表皮间质转化(EMT)赋予肿瘤细胞侵袭和转移特性,本发明探究了在肝细胞肝癌中PRL-1是否参与调控EMT。
qRT-PCR结果显示在Huh7和SK-hep1细胞中外源过表达PRL-1下调E-cadherinmRNA表达(图8)。而用siRNA方法沉默HepG2细胞中PRL-1表达后E-cadherinmRNA水平明显上升(P<0.05,图8)。
与RNA结果相一致,westernblot结果显示增加Huh7和SK-hep1细胞中PRL-1表达后E-cadherin蛋白水平降低,而沉默Huh7细胞中PRL-1表达后E-cadherin蛋白水平明显上升(图9)。另外,免疫荧光实验证实外源过表达PRL-1下调Huh7和SK-hep1细胞中E-cadherin蛋白水平(图10)。qRT-PCR结果与westernblot结果均表明PRL-1在mRNA和蛋白水平均下调E-cadherin表达。
PRL-1与E-cadherin的表达关系进一步在167例HCC样本中用IHC技术证实。高表达PRL-1的HCC患者中约83%(90/109)低表达E-cadherin。与此类似,高表达E-cadherin的HCC患者中约44%(17/39)低表达PRL-1。相关分析显示HCC中PRL-1与E-cadherin表达间存在明显的负相关[P=0.002(Spearman’srhotest),图11]。64号代表病例显示高的PRL-1和低的E-cadherin表达,而54号病例显示低的PRL-1和高的E-cadherin表达。这些结果表明PRL-1调节HCC中E-cadherin的表达。
实施例5PRL-1通过激活PI3K/AKT/GSK3β信号通路抑制HCC中E-cadherin的表达
(1)用Westernblot技术分别检测实施例3得到的稳转细胞株Huh7-ctrl、Huh7-HA-PRL-1、SK-ctrl、SK-HA-PRL-1以及实施例步骤4得到的HepG2细胞si-NC、si-PRL-1#1和si-PRL-1#2不同处理组PI3K/AKT/GSK3β信号通路变化情况,具体方法参照实施例3进行,其中一抗分别为:抗-AKT、p-AKT(Ser474)、GSK3β、p-GSK3β(Ser9)、Snail、E-cadherin、PRL-1和HA,二抗为HRP连接的抗兔二抗。除PRL-1抗体购自Abgent公司外,所有抗体购自CellSignalingTechnology公司。所有抗体均按1:1000稀释。
(2)用含有不同浓度(0μM、1μM和10μM)ZSTK474(一种新型的PI3K抑制剂,购自Selleck公司)的DMEM培养基培养PRL-1过表达肝癌细胞Huh7-HA-PRL-148小时后用Westernblot技术检测PI3K/AKT/GSK3β信号通路变化情况以及E-cadherin表达恢复情况,Westernblot实验具体方法参照本实施例步骤(1)。
结果分析:
Huh7和SK-hep1细胞中外源过表达PRL-1增加AKT丝氨酸474位点的磷酸化,导致GSK3β的磷酸化以及Snail转录因子表达升高,最终降低E-cadherin的表达(图9)。与此对比,用siRNA方法敲低肝癌细胞中PRL-1的蛋白水平导致p-AKT(Ser474)、p-GSK3β(Ser9)、Snail表达下调,E-cadherin表达上升(图9)。
为了进一步探究PI3K/AKT信号通路是否参与PRL-1介导的抑制E-cadherin表达,利用ZSTK474(一种新型的PI3K抑制剂)进行处理PRL-1过表达肝癌细胞Huh7-HA-PRL-1。肝癌细胞暴露于ZSTK474后p-AKT(Ser474)下调,导致p-GSK3β(Ser9)和Snail表达下降以及E-cadherin表达恢复(图12)。
上述结果表明PRL-1增强肝癌细胞中PI3K/AKT信号通路,导致E-cadherin表达下降。
实施例6PI3K/AKT信号参与PRL-1促进肝癌细胞迁移和侵袭
(1)迁移实验:PRL-1过表达稳转肝癌细胞Huh7-HA-PRL-1融合至95%以上时,用200μL枪头划痕,创造出无细胞区。改用含0μM、10μM不同浓度ZSTK474的DMEM培养基培养,24小时后观察“伤口愈合”程度,并在显微镜在拍照,具体步骤参照实施例3。
(2)侵袭实验:用不同浓度的ZSTK474(0μM和10μM)处理10小时(SK-HA-PRL-1)或12小时(Huh7-HA-PRL-1)后,观察细胞侵袭情况,具体步骤参照实施例3。
结果分析:
为了评估PI3K/AKT信号是否介导PRL-1在肝癌细胞中的侵袭特性,PRL-1过表达稳转细胞株Huh7-HA-PRL-1用PI3K抑制剂处理,划痕实验结果显示10μMZSTK474消弱了PRL-1促迁移作用(图13),matrigel胶侵袭实验显示肝癌细胞用10μMZSTK474处理后,PRL-1促侵袭能力也收到抑制(图14)。
上述结果提供证据表明过表达PRL-1的肝癌细胞PI3K/AKT信号通路激活,可以介导侵袭活性。
实施例7PRL-1可能参与肝癌的转移过程
参照实施例1用IHC技术分析13例有脉管癌栓HCC患者组织切片(来自中山大学孙逸仙纪念医院,所有切片是在伦理委员会批准以及患者知情同意情况下获取的)PRL-1表达。给每例切片的原发灶和脉管癌栓染色评分。用McNemar检验方法(SPSS13.0软件处理)比较原发灶和脉管癌栓中PRL-1表达差异。
结果分析:
13例中有10例患者的转移性血管癌栓表现为PRL-1高的免疫组化染色。McNemar检验显示转移病灶中PRL-1免疫组化染色强度强于原发病灶(P=0.031)。3个代表病例显示血管癌栓表现为强的PRL-1IHC染色(图15)。这些发现与PRL-1在HCC转移过程中发挥作用相一致。
上述研究结果表明:PRL-1是HCC潜在的致癌基因,并且是HCC患者独立预后指标,通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路抑制E-cadherin表达,从而促进肝癌细胞迁移和侵袭。另外PRL-1与血管转移相关。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种靶向PRL-1基因的siRNA在制备治疗肝癌产品中的应用,其特征在于:
所述的靶向PRL-1基因的siRNA为siRNA#1或siRNA#2;
所述的siRNA#1的序列为:
siRNA#1-sense:5’-GUUUAAGGUCGCAUUGGUUGGTT-3’;
siRNA#1-antisense:5’-CCAACCAAUGCGACCUUAAACTT-5’;
所述的siRNA#2的序列为:
siRNA#2-sense:5’-CCAACCAAUGCGACCUUAAACAAAU-3’;
siRNA#2-antisense:5’-AUUUGUUUAAGGUCGCAUUGGUUGG-5’。
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