CN103389376A - 评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒及ecscr 的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒及ECSCR的应用。其中，该试剂盒包括用于特异性检测ECSCR表达水平或表达模式的试剂。应用本发明的技术方案，ECSCR相对高表达的肝癌患者具有较好的临床分期以及更好的生存预后，即通过应用本试剂盒对肝癌患者的组织标本中ECSCR的表达情况进行检测可以有效地对肝癌患者的临床分期和生存预后情况进行准确评估。

Description

评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒及ECSCR 的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒及ECSCR的应用。

背景技术

肝细胞癌在全球，尤其在东亚地区是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居恶性肿瘤的第六位，且近年来仍呈上升趋势。肝癌具有预后恶劣、死亡率高等特点，其每年的死亡病例数与新发病例数之比接近1:1，高居全世界癌症死因的第三位。中国正是肝癌的高发区，据国际癌症中心统计，每年肝癌新发病例的一半左右发生在中国，我国男性的肝癌死亡率为37.9/10万，女性为14.2/10万，均居全球首位（A.Jemal,F.Bray and M.M.Center,et al.,Global cancerstatistics.CA Cancer J Clin,2011.61（2）:69～90）。而且，肝癌患者术后5年内的复发转移率高达70%，而术后5年生存率仅为30%～50%，甚至更低（A.Forner,J.M.Llovet and J.Bruix,Hepatocellular carcinoma.Lancet,2012.379（9822）:1245～1255）。可见肝癌术后的复发转移严重地制约了肝癌患者长期生存率的提高，是导致肝癌死亡率居高不下的最主要原因。因此，深入研究探讨肝癌复发转移相关的分子标志物，不仅为肝癌患者的治疗和预后评估带来益处，也可为开发新的靶向治疗药物提供依据。因此，寻找并确立肝癌复发转移相关的新的分子标志物，具有重要的理论和现实意义。

新近发现的ECSCR（Endothelial Cell-Specific Chemotaxis Regulator，内皮细胞特异性趋化调节因子）分子是一个单程跨膜糖蛋白，广泛表达于哺乳动物的内皮细胞和血管组织，具有高度保守的胞质尾区，并与并与细胞骨架重排，EGF受体信号传导，以及蛋白酶体活性等密切相关（F.Ma,D.Zhang and H.Yang,et al.,Endothelial cell-specific molecule2（ECSM2）modulates actin remodeling and epidermal growth factor receptor signaling.Genes Cells,2009.14（3）:281～293）。已有研究表明，ECSCR能够促进细胞凋亡，增强细胞粘附，抑制细胞迁移运动和血管生成（K.Ikeda,R.Nakano and M.Uraoka,et al.,Identification of ARIA regulatingendothelial apoptosis and angiogenesis by modulating proteasomal degradation of cIAP-1andcIAP-2.Proc Natl Acad Sci USA,2009.106（20）:8227～8232）。ECSCR可能与肝癌的肿瘤生物学行为密切相关。

然而，目前关于ECSCR的研究尚局限于胚胎发育领域，而在人肝癌中是否存在ECSCR的表达，其阳性表达有何临床意义以及在肝癌中ECSCR是如何发挥其生物学作用的等方面仍未见任何相关报道。

发明内容

本发明旨在提供一种评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒及ECSCR的应用，以解决现有技术中缺少评估肝细胞癌临床分期和预后的分子标记的技术问题。

根据本发明的一个方面，提供了一种评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒。该试剂盒包括用于特异性检测ECSCR表达水平或表达模式的试剂。

进一步地，试剂包括用于特异性检测ECSCR mRNA表达水平或表达模式的RT-PCR引物。

进一步地，RT-PCR引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

进一步地，试剂用于特异性检测ECSCR所编码的蛋白的表达水平或表达模式。

进一步地，试剂包括：用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人ECSCR蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。

进一步地，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂包括二甲苯、乙醇及蒸馏水。

进一步地，用于脱水、透明和封片的试剂包括乙醇、二甲苯及PVP封片液。

根据本发明的另一个方面，提供一种ECSCR作为分子标志物在制备评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒中的应用。

进一步地，试剂盒包括用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人ECSCR蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。

根据本发明的再一个方面，提供一种ECSCR作为分子标志物在体外评估肝细胞癌临床分期和预后中的应用。

应用本发明的技术方案，ECSCR相对高表达的肝癌患者具有较好的临床分期以及更好的生存预后，即通过应用本试剂盒对肝癌患者的组织标本中ECSCR的表达情况进行检测可以有效地对肝癌患者的临床分期和生存预后情况进行准确评估。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了ECSCR mRNA和蛋白在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达水平；

图2示出了ECSCR蛋白在肝癌组织中的表达水平；

图3示出了肝癌组织标本石蜡切片的ECSCR免疫组化Shimizu评分结果；

图4示出了ECSCR过表达慢病毒转染SMMC-7721和HCCLM3细胞后ECSCR的表达水平；

图5示出了过表达ECSCR在体外对肝癌细胞的增殖能力的影响；

图6示出了过表达ECSCR在体外对肝癌细胞的迁移及侵袭的影响；

图7示出了ECSCR通过调控TGFβ1抑制肝癌细胞的增殖和侵袭运动能力；以及

图8示出了过表达ECSCR在裸鼠体内对肝癌细胞的增殖和肝内、外转移能力的影响。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明的发明人采用Real-time qPCR、RT-PCR和Western-blot技术在新鲜肝癌组织及其邻近非瘤肝组织中检测ECSCR（ECSCR为已知基因，基因序列可在互联网上的基因库中下载，例如NCBI）的表达情况。结果发现，ECSCR在肝癌组织中的表达水平明显低于其邻近非瘤肝组织。同时发明人还采用Real-time qPCR和Western-blot技术检测ECSCR在正常肝细胞系L02及其它4种肝癌细胞系（HepG2和SMMC-7721、HCCLM3和MHCC97-L）中的表达情况。结果发现，ECSCR在HepG2和SMMC-7721、HCCLM3和MHCC97-L肝癌细胞系中的表达水平也明显低于正常对照肝细胞系。

发明人进一步采用免疫组织化学方法，对原发性肝细胞癌患者组织标本中ECSCR的表达进行了检测，并分析了ECSCR表达水平与肝癌临床病理特征的相关性。结果发现，ECSCR蛋白在肝癌组织中的阳性表达率和表达水平均明显低于其邻近非瘤肝组织。进一步的分析与研究发现，ECSCR在肝癌组织中的表达下调与肿瘤大小、肿瘤结节数目、有无包膜或假包膜、有无静脉侵犯、临床分型、BCLC分期（Barcelona Clinic Liver Cancer staging system，巴塞罗那分期）及TNM分期（American Joint Committee on Cancer/Union for International CancerControl Tumour Node Metastasis classification，美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟TNM分期系统）等肝癌临床病理特征密切相关。上述结果提示，ECSCR的表达水平与肝癌的肿瘤生物学行为密切相关，是反映肝癌的肿瘤生物学行为的有用的标志物。

为了探讨ECSCR的表达与肝癌患者生存预后之间的关系，发明人还对肝癌患者进行了临床随访研究，获得了肝癌患者手术后的生存时间及复发转移的资料。根据ECSCR的免疫组化评分的结果，将肝癌标本分为ECSCR高表达组(阳性表达组)和ECSCR低表达组(阴性表达组)。采用Kaplan-Meier生存曲线法计算分析ECSCR高表达组和低表达组患者手术后的生存情况，并以Log-rank法分别比较和检验两组之间总体生存率和无瘤生存率的差异。结果显示，ECSCR低表达组肝癌患者的总体生存率和无瘤生存率均明显低于ECSCR高表达组。

接着发明人运用Cox比例风险回归模型对与肝癌预后相关的临床病理参数进行分析。发现不管单因素回归还是多因素回归分析都显示ECSCR低表达代表着更差的总体生存时间和无瘤生存时间，ECSCR低表达是影响肝癌患者预后的独立危险因素。这提示ECSCR的低表达与肝癌患者的不良预后密切相关，可作为肝癌重要的诊断和预后标志物。

ECSCR蛋白在肝癌组织和多种肝癌细胞系中均呈显著性低表达；ECSCR在肝癌组织中的低表达与肝癌的大小、结节数目、有无包膜或假包膜、有无静脉侵犯、BCLC分期、TNM分期及临床分型等肝癌临床病理特征密切相关，是影响肝癌患者预后的独立危险因素；ECSCR可作为评估肝癌患者预后的新的标志物以及针对肝癌复发转移的分子干预治疗的潜在作用靶点。

发明人的上述发现是基于下述实验手段完成的，本发明中采用的样本及实验手段描述如下，如下文中没有详细提及的生物学手段或试剂均采用本领域常规的技术实现：

1.本发明的实施例中病理标本均来自于手术切除并经病理组织学确诊的肝细胞癌标本。

2.本发明的实施例中临床随访资料的收集。根据患者出院后复查B超、选择性血管造影、CT（Computed Tomography，计算机断层扫描技术）、MRI（Magnetic Resonance Imaging，磁共振成像）、血清AFP（Alpha-fetoprotein，甲胎蛋白）水平或再次手术等确定有无临床复发转移。通过门诊、电话、实地访视等方式进行随访，获得患者的复发转移或死亡时间资料。自患者手术当天开始计算患者总体生存时间和无瘤生存时间。患者术后出现肝癌复发转移或因肝癌导致的死亡，即为随访终止点。若至随访截止日期时仍未观察到患者出现肝癌复发转移和因肝癌导致的死亡，或者已出现其他原因导致的死亡，即为删失数据。随访时间为手术当天至随访终止点，其中删失数据的随访时间为手术当天至随访截止日期。以患者手术当天至患者死亡的时间定义为生存时间，以患者手术当天至发生复发转移的时间定义为无瘤生存时间。

3.L02、HepG2和SMMC-7721细胞系由中南大学湘雅医院肝癌研究室保存，HCCLM3和MHCC97-L细胞系购自复旦大学肝癌研究所。所有细胞培养除特别说明外，均采用含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）（GIBCO，CA，USA）的高糖DMEM（Dulbecco’s modifiedEagle’s medium）培养基（GIBCO，CA，USA），且均置于37℃恒温和5％CO₂浓度的二氧化碳细胞培养箱Forma Series Ⅱ Water Jacketed CO₂Incubator（Thermo Scientific，OH，USA）中培养。所有操作均在超净工作台（AIR TECH，Shanghai，China）中进行。

4.总RNA的提取：取新鲜组织50～100mg，以眼科剪剪碎后放入预冷后的研钵（经180℃高温灭活RNA酶），再倒入约5ml液氮，仔细研磨粉碎组织，再转移至一无RNA酶（RNase）的1.5ml离心管中（对于细胞：取对数生长期细胞，去除细胞培养基，加入2～3ml PBS溶液洗涤细胞，弃去PBS（Phosphate Buffered Saline）溶液，放置于冰上。在培养皿或培养瓶里加入胰蛋白酶（Solarbio，Beijing，China）消化细胞，培基（GIBCO，CA，USA）中和灭活胰蛋白酶，细胞计数，800g离心5min，去除上清，1ml PBS溶液洗涤2次，离心收集细胞），加入500μl裂解液（Lysis/Binding Solution，Ambion，TX，USA），剧烈震荡混匀。接着加入50μl匀浆添加剂（Homogenate Additive，Ambion，TX，USA），冰上孵育10分钟（min）。加入500μl的磺酸-苯酚氯仿（Acid-Phenol Chloroform，Ambion，TX，USA），涡旋30～60秒（s），于离心机（Eppendorf，Hamburg，Germany）中室温下10000g离心5min分层。小心吸取上层水相转移至一新的无RNA酶的1.5ml离心管中，并记录吸取的上清的体积。再加入上述上清液体积的1.25倍体积的100%乙醇。混匀后加入过滤器（Ambion，TX，USA）上室（每次最多加700μl，超过700μl则分次加入），室温下10000g离心15秒，使混合液滤过过滤柱，弃去滤过液。重复上述步骤直至所有的混合液都经过滤器过滤。在过滤器上室加入700μl的洗涤液1（Wash Solution1，Ambion，TX，USA），快速离心5～10秒，弃去滤过液。再在过滤器上室加入500μl的洗涤液2/3（Wash Solution2/3，Ambion，TX，USA），快速离心5～10秒，弃去滤过液，重复该步骤1次。接着再次室温下10000g离心1min，去除剩余液体。将过滤柱取出，换入新的收集管，加入95℃预热的无RNA酶水，10000g离心20～30秒，收集含有总RNA的滤过液，分装，保存于-20℃或-80℃备用。

5.RNA的定量及质量检测：取1μl的总RNA提取溶液，加入49μl的无RNA酶水，混匀，使用DU-800紫外分光光度仪（BECKMAN COULTER，CA，USA）测定波长为260nm和280nm时的吸光度值A260和A280，计算A260/A280比值，检测其浓度及纯度。正式检测前需预热紫外分光光度仪，并用50μl无RNA酶水调零。每例总RNA样本的A260和A280均测3次，取其平均值。总RNA纯度以A260/A280比值评估，A260/A280比值介于1.8～2.1之间即可认为总RNA纯度合格。使用以下公式计算总RNA浓度：总RNA浓度=40×A260×50/1000（μg/μl）。

6.逆转录反应（Reverse Transcription,RT）：采用Invitrogen公司的用于qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统逆转录试剂盒（Invitrogen，CA，USA），建立20μl的逆转录反应体系。首先在无RNase的微量离心管中加入以下组分：10mM的dNTP混合物，1μl；500μg/ml的Oligo（dT）12～18，1μl；总RNA，1μl；无RNA酶水，9μl。混合物在PCR仪（Biometra，Goettingen，Germany）中65℃加热5min后，立即置于冰上。瞬时离心后，加入以下组分：0.1M的DTT，2μl；40单位/μl的RNaseOUTTM核酸酶抑制剂（Invitrogen，CA，USA），1μl；5×第一链合成缓冲液，4μl。轻轻混匀后在37℃下孵育2min。接着在室温下加入M-MLV逆转录酶1μl（200单位），轻轻地吹打混匀。然后于37℃下孵育50分钟。再70℃加热15分钟以终止反应。逆转录后所得cDNA产物于-20℃下保存。

7.半定量RT-PCR反应：半定量RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）引物采用Primer Premier5.0引物设计软件设计，并经NCBI（National Center for BiotechnologyInformation，MD，USA）的Primer-BLAST线上程序验证引物序列的特异性和匹配性，由上海生工生物工程有限公司合成。引物设计如下：ECSCR基因的上游引物序列为：SEQ ID NO：3（5'-AGGCACAAGCAGAGACACATT-3'），ECSCR基因的下游引物序列为SEQ ID NO：4（5'-CTTCCGACACTTGAACCTCAG-3'），产物大小为211bp。以GAPDH基因作为内参，与ECSCR基因在相同条件下进行RT-PCR反应。GAPDH的上游引物序列为SEQ ID NO：5（5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'），GAPDH基因的下游引物序列为SEQ ID NO：6（5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'），产物大小为532bp。以上引物均加入无RNase水配成浓度为100μM的贮存液备用。使用天根生化公司的2×Taq PCR MasterMix试剂盒（TIANGEN，Beijing，China）进行RT-PCR扩增反应。建立25μl的反应体系如下：2×Taq PCRMasterMix，12.5μl；上游引物（10μM），1μl；下游引物（10μM），1μl；双蒸水，8.5μl；cDNA模板（<1μg），2μl。按照以下反应条件进行RT-PCR反应：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共25～35个循环；72℃延伸5分钟，最后降温至4℃。取出RT-PCR产物于4℃保存。将配制好的琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶的浓度可在1%－1.5%之间根据RT-PCR产物的长度选择）放入电泳槽中，凝胶上有加样孔的一侧朝向电泳槽的负极，电泳槽中的液面须没过凝胶。准备一条透明胶带，在上面依次点上1μl的6×DNALoading Buffer（Invitrogen，CA，USA），再依次将5μl的RT-PCR产物与Loading Buffer吸打混匀后加入琼脂糖凝胶的加样孔中。于凝胶的某一加样孔中加入约5μl的DNA Marker（Invitrogen，CA，USA）。加完样后，盖上电泳槽的盖子，注意正负极一定要接对，电压80～100V，电泳30min，紫外灯下观察，满意的结果于Bio-Rad Molecular Imager Gel DocTM XR+Imaging System凝胶成像系统（BIO-RAD，CA，USA）中扫描保存。使用Gel-Pro analyzer4软件对条带图像的灰度值进行半定量分析，并采用方差分析进行统计学分析。每个样本均重复检测3次，结果取其平均值。

8.荧光实时定量Real-time PCR反应：荧光实时定量Real-time PCR引物设计方法同RT-PCR，由上海生工生物工程有限公司合成。引物设计如下：ECSCR基因的上游引物序列为：SEQ ID NO：1（5'-AGGCACAAGCAGAGACACATT-3'），ECSCR基因的下游引物序列为：SEQID NO：2（5'-AACCACCAGGATGACAATGAA-3'），产物大小为160bp。以GAPDH基因作为内参，与ECSCR基因在相同条件下进行Real-time PCR反应。GAPDH的上游引物序列为SEQ ID NO：5（5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'），GAPDH基因的下游引物序列为SEQID NO：6（5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'），产物大小为532bp。以上引物均加入无RNase水配成浓度为100μM的贮存液备用。按照Roche公司的FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）试剂盒（Roche，Mannheim，Germany）说明书，在96孔Real-time PCR板（AppliedBiosystems，CA，USA）中建立20μl反应体系：上游引物（100μM），0.06μl；下游引物（100μM），0.06μl；FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），10μl；无RNase水，7.88μl；cDNA模板（≤10ng/μl），2μl。加完各试剂后，在96孔Real-time PCR板上贴好膜。以上各步均需在冰上操作。Real-time PCR反应过程在7300Real Time PCR System（Applied Biosystems，CA，USA）中进行。反应条件设定为：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，60℃延伸1分钟，共40个循环；并进行定量和融解曲线分析。运行Real-time PCR反应，并统计分析结果。分别计算ECSCR和GAPDH的Ct（Cycle threshold，循环阈值）值，以GAPDH mRNA的表达量作为内参，ECSCR的mRNA的相对表达水平表示为2^-ΔCt，其中ΔCt=Ct_（ECSCR）－Ct_（GAPDH）；而2^-ΔΔCt表示ECSCR在肝癌组织（A）中的mRNA表达水平相较其在相邻非瘤肝组织（P）中的表达水平的倍数，其中2^-ΔΔCt=（Ct_{（A，ECSCR）}－Ct_{（A，GAPDH）}）－（Ct_{（P，ECSCR）}－Ct_{（P，GAPDH）}）。

9.总蛋白的提取：取新鲜组织100mg，以眼科剪剪碎后放入预冷后的研钵（经180℃高温灭菌），倒入5～10ml液氮，仔细研磨粉碎组织，碾碎后的组织转移至1.5ml离心管中（对于细胞：去除培养皿中的培基，以冰PBS液轻柔冲洗2次。吸尽PBS液，加入0.5M的EDTA溶液（GIBCO，CA，USA）0.5ml，促进细胞脱落。用细胞刮匙刮取细胞，放入1.5ml EP管中，800g常温下离心5min，弃去上清），再加入1ml RIPA裂解液（碧云天，上海，中国）。涡旋震荡后，置冰上孵育30min，每4～5min涡旋一次。于4℃下12000g离心15分钟，吸取上清液转移至新的离心管中。重复一次，取上清即为总蛋白。将总蛋白分装保存于-80℃。

10.SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹：配置12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶和5%的浓缩胶。准备蛋白样品。在提取的蛋白中加入5×SDS-PAGE Loading Buffer（碧云天，上海，中国）（稀释至终浓度1×），平时于-80℃保存。将加好Loading Buffer的蛋白样品置于开水中水浴10min变性。蛋白样品稍冷却后，12000rpm离心5～10min，用特制的细长TIP头取上清上样，采用Mini-PROTEAN Tetra System小型垂直电泳系统（BIO-RAD，CA，USA）进行电泳，之后使用TE77ECL Semi-Dry Transfer Unit半干转膜仪（Amersham Biosciences，NY，USA）将蛋白样品转移至PVDF Western Blotting Membranes（Roche，Mannheim，Germany）上。PVDF[Poly（vinylidene fluoride），聚偏氟乙烯]膜用甲醇预处理5s成半透明状后，放入转膜缓冲液中；滤纸用转膜缓冲液泡着。去除小玻片，切除积层胶，盖上PVDF膜，防止气泡产生，盖滤纸，再去除大玻片，制成“夹心饼”样（从上往下，依次为：滤纸、胶、PVDF膜、滤纸）。电压12V下半干转约80min。转膜完成后，用PBS液将PVDF膜漂洗3～5min，去除转膜缓冲液。再将膜放入5%的脱脂牛奶（用PBS溶液溶解）中封闭45min。之后用PBS-T溶液（PBS溶液中加入终浓度为0.1%的吐温-20）洗涤3次，每次5min。接着将膜放入用PBS溶液适当稀释的7～10ml的一抗中，于4℃摇床过夜。次日，将膜放入PBS-T液中轻摇5min，共3次。再将膜放入用PBS溶液适当稀释的二抗中，室温下轻摇20～30min。接着用PBS-T液洗涤15min，共3次。将膜用显像试剂WesternBrightTM ECL-spray Western blotting detectionsystem（ADVANSTA，CA，USA）浸泡1min，再将膜和胶片贴在一起后放入暗盒，压紧暗盒，约1min，再边显边看。当条带显影而背景未显影时，将胶片放入定影液中漂洗，定影，摄片。采用Bio-Rad Molecular Imager Gel DocTM XR+Imaging System凝胶成像系统（BIO-RAD，CA，USA）扫描保存，并使用Gel-Pro analyzer4软件对Western-blot条带图像的灰度值进行半定量分析，并采用方差分析进行统计学分析。每个样本重复检测3次，结果取平均值。使用的一抗包括：山羊抗人ECSCR蛋白多克隆抗体（Santa Cruz，CA，USA）；兔抗人β-Actin蛋白多克隆抗体（Santa Cruz，CA，USA）等。以兔抗人β-Actin蛋白多克隆抗体检测β-Actin蛋白作为内参照。使用的二抗包括：HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（Santa Cruz，CA，USA）；辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体（中杉金桥，北京，中国）等。

11.免疫组化检测方法如下：免疫组织化学检测采用非生物素-辣根酶标记的超敏二步法。使用的主要试剂为PV-9003山羊超敏二步法免疫组化检测试剂盒（中杉金桥，北京，中国）。

（1）切片：本研究使用的所有的肝细胞癌的石蜡组织标本均交由中南大学湘雅医院病理科以3～5μm厚度行连续切片。

（2）烤片：将石蜡切片放在铜架上，置60℃～70℃烤箱烤30～60min。

（3）脱蜡：切片从烤箱中取出后，立即置于二甲苯（100%）中，浸泡15min后换到第二缸二甲苯，再浸泡15min。

（4）水化：切片从二甲苯取出后依次置于无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中浸泡3～10min；再用自来水冲洗5min（先装一盆水放在水龙头下，调整水龙头使水量适中，再将切片架放在水盆中冲洗）；蒸馏水过一下。

（5）抗原修复（微波热修复）：13.5ml柠檬酸修复液A液加上61.5ml B液，再加去离子水至750ml，配成柠檬酸抗原修复液；切片正面朝上放在修复液中，在微波炉中煮至沸腾，避免煮干，10min×2次；修复结束后，切片自然冷却至室温；PBS浸泡，5min×2次（保证第一次浸泡的是新配的PBS）。

（6）灭活内源性过氧化物酶（HRP酶）：从PBS中取出切片，在蒸馏水中过一下；3%H₂O₂室温孵育30min；蒸馏水冲洗（直接用蒸馏水冲洗切片架上的切片，或者将切片放在蒸馏水中浸泡3～5min）；PBS浸泡5min。

（7）封闭：滴加封闭血清（相应二抗的封闭血清原液，用PBS稀释至10%，可再加1%BSA（牛血清白蛋白概述牛血清白蛋白））后室温或37℃孵育15～30min。

（8）孵育一抗：滴加适当比例稀释的山羊抗人ECSCR蛋白多克隆抗体（Santa Cruz，CA，USA），37℃预孵育30min后再置于4℃过夜；第二天先将切片在37℃复温30min，再泡PBS，3min×3次。

（9）孵育二抗：切片滴加聚合物辅助剂（PV-9003试剂盒中试剂1），37℃孵育15～20min；PBS浸泡，3min×3次；切片滴加二抗（PV-9003试剂盒中试剂2），37℃孵育15～20min；PBS浸泡，3min×3次。

（10）显色剂显色：使用DAB显色试剂盒（中杉金桥，北京，中国）配制显色剂，取一干净EP管（eppendorf管）装1ml DAB底物液，再加入50μl浓缩DAB（二氨基联苯胺，Diaminobenzidine）溶液（20×），混匀即可（DAB配好后需避光放置，30min内使用）；滴加适当显色剂于切片上，镜下控色，记录时间并保证各切片的显色时间一致；染色完成后，切片置自来水中冲洗5min。

（11）苏木素复染：滴加适当苏木素（碧云天，上海，中国）于切片上，复染时间约为0.5～3min；自来水冲洗5～10min。

（12）返蓝、脱水、透明：若复染后过蓝，可将切片置于1%盐酸酒精中过一下；再依次于自来水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和无水乙醇中浸泡3～5min；最后将切片置于二甲苯中3min。

（13）封片：滴加适当的封片剂（PVP（聚乙烯吡咯烷酮）封片液）（碧云天，上海，中国）于切片上，将盖玻片附着于封片剂上，让封片剂扩散至全部组织切片（避免产生气泡）；再将封好的切片水平置于37℃烤箱中适当烤干即可。

（14）镜下阅片：首先在ECLIPSE80i显微镜（Nikon，Tokyo，Japan）的低倍镜（100×）下观察大体结果；找到感兴趣的区域后，转至高倍镜（400×）观察，并进行照相和ECSCR染色结果的评价。

12.免疫组化的染色评估方法如下：参考Michio Shimizu等（M.Shimizu,Y.Saitoh and H.Itoh,Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal,benign,and malignanthuman pancreatic tissues.Hum Pathol,1990.21（6）:607～612）报告的方法，在所有标本的每张切片随机选择5个视野，首先按照细胞染色强度计分：无染色记为0分，显著的深度染色记为2分，染色程度居中的浅染色记为1分。其次按阳性染色细胞所占的比例计分：无染色记为0分，1/3以下的局部染色记为1分，1/3以上至2/3以下的多个部位染色记为2分，2/3以上的绝大部分细胞弥漫性染色则记为3分。最后将两者的评分相加，0分为（－），2分为（±），3分为（＋），4分为（＋＋），5分为（＋＋＋）。定义（－）和（±）为阴性表达（或低表达），（＋）、（＋＋）和（＋＋＋）为阳性表达（或高表达）。

13.统计学分析方法：全部数据均使用IBM SPSS Statistics Version19.0.0for Windows统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，采用配对样本或者独立样本t检验；计数资料采用χ2检验。采用Spearman等级相关分析ECSCR的表达水平与肝癌临床病理特征之间的相关性。采用Kaplan-Meier生存分析法计算肝癌患者手术后的总体生存率（OverallSurvival）和无瘤生存率（Disease-free Survival）。采用Log-rank法比较各组间无瘤生存率和总体生存率的差异。采用逐步回归法建立Cox比例风险回归模型，使用单因素和多因素法分析肝癌患者的临床病理特征以及ECSCR表达水平等因素对其手术后预后的影响；并确定影响肝癌患者预后的独立危险因素，分别以P<0.05和P>0.10作为引入和剔除影响因素的筛选界值。本研究中所有数据分析的检验均为双侧检验，且均以P<0.05作为差异具有统计学显著性意义的检验界值。

采用上述实验手段，具体地，发明人得到了如下结果：

1.ECSCR mRNA和蛋白在肝癌组织与肝癌细胞系中均呈显著性低表达

首先采用Real-time PCR检测了30对新鲜肝癌组织(HCC)及其相应的邻近非瘤肝组织(ANLT)中ECSCR mRNA的表达情况（编号分别为D162、D417、D240、D205、D126、D179、D383、D414、D207、D175、D405、D260、D192、D208、D139、D156、D386、D438、D412、D411、D446、D406、D407、D107、D415、D267、D256、D153、D449、D157），并以新鲜的正常肝脏组织(NL，6例)标本作为对照。以GAPDH mRNA的表达量作为内参，采用2^-ΔCt法计算ECSCR mRNA的相对表达水平。结果显示，ECSCR mRNA在HCC、ANLT和NL中相对表达水平的中位值分别为0.0044(0.0038-0.0087)、0.0169(0.0125-0.0211)和0.0221(0.0159-0.0273)，ECSCR mRNA在邻近非瘤肝组织和正常肝组织中的表达水平无显著差异(P=0.135)，但均明显高于肝癌组织(P<0.01)，如图1中的A所示。

以相应的邻近非瘤肝组织中ECSCR mRNA的表达水平为1，ECSCR mRNA的在肝癌组织中的相对表达水平的中位值为0.2912(如图1中的B所示)。接着采用RT-PCR检测ECSCRmRNA在肝癌组织、对应的邻近非瘤肝组织以及正常肝组织中的表达情况，结果同样显示ECSCR mRNA在邻近非瘤肝组织以及正常肝组织中的表达水平无显著差异(1.271±0.153vs.1.518±0.212，P=0.094)，而在肝癌组织中的表达水平明显低于其邻近非瘤肝组织(0.271±0.064vs.1.271±0.153，P<0.05)和正常肝组织(0.271±0.064vs.1.518±0.212，P<0.05)(如图1中的C所示)。为进一步验证ECSCR蛋白在肝癌组织中的表达水平和ECSCR mRNA是否具备一致性，发明人Western-blot方法继续对这些组织标本进行检测。结果显示，ECSCR蛋白在肝癌组织中的表达水平显著下调，而在相对应的邻近非瘤肝组织中呈相对高表达(0.234±0.047vs.1.097±0.196，P<0.05)(如图1中的D所示)。上述结果显示，与邻近非瘤肝组织及正常肝组织比较，ECSCR mRNA和蛋白均在肝癌组织中呈显著性低表达，提示ECSCR在肝癌中可能发挥抑癌作用。

为进一步了解ECSCR mRNA和蛋白在不同肝癌细胞系中的表达情况，采用Real-time PCR及Western-blot检测了正常肝细胞系L02及HCCLM3、HepG2、MHCC97-L和SMMC-7721等四种不同侵袭转移潜能的肝癌细胞系中的ECSCR mRNA和蛋白的表达水平，并以正常肝细胞系L02作为对照。结果显示，ECSCR mRNA和蛋白在L02细胞系中的表达水平均显著高于HepG2、SMMC-7721、MHCC97-L和HCCLM3肝癌细胞系(P<0.05)，其中SMMC-7721与HCCLM3细胞系中ECSCR的表达水平相对最低(如图1中的E、F所示)。上述结果显示，ECSCR mRNA和蛋白在肝癌细胞系中也均呈显著性低表达，同样也提示ECSCR在肝癌中可能发挥抑癌作用。

2.ECSCR低表达与肝癌临床病理特征密切相关

由于上述研究结果提示ECSCR在肝癌中可能发挥抑癌作用。发明人进一步采用免疫组织化学方法，对97例原发性肝细胞癌患者组织标本中ECSCR的表达进行了检测，并分析了ECSCR表达水平与肝癌临床病理特征的相关性。结果发现，ECSCR在肝癌组织标本中的特异性染色主要分布于胞膜及胞浆内，未见明显的胞核染色，具体如图2中的A-F所示，其中，A-D：免疫组化法检测97例肝癌组织标本石蜡切片中ECSCR的表达，结果显示ECSCR主要分布于胞浆及胞膜中，ECSCR蛋白在97例邻近非瘤肝组织中均呈阳性表达，而在97例肝癌组织中则仅有58例可见ECSCR蛋白阳性表达，ECSCR蛋白在肝癌组织的阳性表达率明显低于邻近非瘤肝组织(59.8%vs.100.0%，P<0.001)。A-D分别为ECSCR表达的代表性图片(400×)：A为Shimizu评分为(－)的肝癌组织；B为Shimizu评分为(+)的肝癌组织；C为Shimizu评分为(++)的肝癌组织；D为Shimizu评分为(+++)的邻近非瘤肝组织。E、F：ECSCR在肝癌及其邻近非瘤肝组织中表达的代表性图片，可见ECSCR在肝癌组织中呈明显低表达。其中E的放大倍数为100×，F的放大倍数为400×。在97例邻近非瘤肝组织中均可见ECSCR蛋白呈阳性表达(97/97，100.0%)(表1)。ECSCR蛋白在肝癌组织中的阳性表达率和表达水平均明显低于其邻近非瘤肝组织(P<0.001)。

表1

进一步的分析与研究发现，ECSCR在肝癌组织中的表达下调与肿瘤大小(P=0.036)、肿瘤结节数目(P<0.001)、有无包膜或假包膜(P=0.001)、有无静脉侵犯(P=0.001)、临床分型(P=0.001)、BCLC分期(P=0.002)及TNM分期(P<0.001)等临床病理特征密切相关；而与患者的性别、年龄、有无乙肝、是否存在肝硬化、Edmondson-Steiner分级及Child-Pugh分级等其他临床病理参数无明显相关(表2)。

表2

上述结果提示，ECSCR的表达水平与HCC的肿瘤生物学行为密切相关，很可能影响肝癌患者的生存与预后。

3.ECSCR低表达与肝癌患者不良预后密切相关

为了阐明ECSCR的表达与肝癌患者生存预后之间的关系，发明人对前述的97例肝癌患者进行了临床随访研究，获得了肝癌患者手术后的生存时间及复发转移的资料。根据ECSCR的免疫组化Michio Shimizu评分的结果，将97例肝癌标本分为ECSCR高表达组(免疫组化评分+～+++，n=58)和ECSCR低表达组(免疫组化评分－～±，n=39)。采用Kaplan-Meier生存曲线法计算分析ECSCR高表达组和低表达组患者手术后的总体生存率与无瘤生存率，并以Log-rank法分别比较和检验两组之间总体生存率和无瘤生存率的差异。结果显示，ECSCR低表达组肝癌患者的总体生存率明显低于ECSCR高表达组(P=0.005)，5年总体生存率分别为27.43%vs.51.18%，平均总体生存时间分别为31.1±4.6vs.49.0±3.2(Months，月)(图3中的A)。同样，ECSCR低表达组肝癌患者的无瘤生存率亦明显低于ECSCR高表达组(P=0.002)，5年无瘤生存率分别为9.56%vs.38.94%，平均无瘤生存时间分别为22.5±3.4vs.41.2±3.6(月)(图3中的B)。同时，在总体生存率分析中，SLHCC组与SHCC组的总体生存率无显著差异(P=0.894)；而NHCC组的总体生存率明显低于SLHCC组与SHCC组(P=0.002)，三组的5年总体生存率分别为19.53%vs.57.20%vs.68.44%，平均总体生存时间分别为31.4±3.7vs.46.7±3.2vs.53.3±5.7(月)(图3中的C)。同样，在无瘤生存率分析中，SLHCC组与SHCC组的无瘤生存率无显著差异(P=0.304)；而NHCC组的无瘤生存率明显低于SLHCC组与SHCC组(P<0.001)，三组的5年无瘤生存率分别为4.93%vs.28.19%vs.56.37%，平均无瘤生存时间分别为20.9±2.8vs.41.1±3.8vs.53.1±5.8(月)(图3中的D)。

为了进一步探讨ECSCR是否可以作为影响肝癌患者预后的独立影响因素，首先发明人利用上述临床病理及随访资料构建了Cox比例风险回归模型，并将肝癌患者的性别、年龄、有无乙肝、是否存在肝硬化、肿瘤大小、结节数目、有无包膜或假包膜、是否存在静脉侵犯、Edmondson-Steiner分级、Child-Pugh分级、临床分型、BCLC分期、TNM分期以及ECSCR表达水平等因素引入此模型进行分析。通过单因素Cox回归分析发现，肿瘤结节数目、有无包膜或假包膜、是否存在静脉侵犯、临床分型、BCLC分期、TNM分期以及ECSCR表达水平等因素与肝癌患者的预后密切相关。接着将这些因素纳入多因素Cox回归分析，结果显示，包膜或假包膜(HR=4.239，P=0.004)、静脉侵犯(HR=3.054，P=0.015)、肝癌临床分型(HR=2.368，P=0.038)、BCLC分期(HR=2.469，P=0.046)、TNM分期(HR=2.768，P=0.014)以及ECSCR低表达(HR=2.183，P=0.040)是影响肝癌患者预后的独立危险因素(表3)；提示ECSCR的低表达与肝癌患者的不良预后密切相关。

表3

注：HR，风险比：95％CI，95％可信区间：NA，not adopted，未采纳。

4.过表达ECSCR在体外能显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭运动能力

发明人首先选取ECSCR表达水平相对最低的两个肝癌细胞系SMMC-7721和HCCLM3作为进一步研究的对象，并通过慢病毒转染技术在其中转染ECSCR过表达慢病毒，构建了稳定过表达ECSCR的SMMC-7721^ECSCR、HCCLM3^ECSCR细胞系，以及转染空质粒慢病毒的对照组SMMC-7721^Control、HCCLM3^Control细胞系。通过于转染后96小时在荧光倒置显微镜（200×）下观察各组细胞中GFP的表达情况来评估慢病毒的转染效率。其中过表达组SMMC-7721^ECSCR细胞系的转染效率达96%(图4中的A)，HCCLM3^ECSCR细胞系的转染效率达98%(图4中的C)。而空质粒慢病毒对照组SMMC-7721^Control细胞系和HCCLM3^Control细胞系的转染效率均达到97%(图4中的B，D)。同时发明人采用Western-blot方法验证SMMC-7721^ECSCR、SMMC-7721^Control、HCCLM3^ECSCR、HCCLM3^Control细胞系中ECSCR的表达水平。结果显示，与对照组SMMC-7721^Control和HCCLM3^Control细胞系比较，过表达组SMMC-7721^ECSCR和HCCLM3^ECSCR细胞系中ECSCR的蛋白表达水平均显著上调，分别为0.073±0.017vs.1.168±0.165(P<0.01)(图4中的E)和0.132±0.029vs.1.193±0.181(P<0.01)(图4中的F)。提示ECSCR过表达慢病毒在SMMC-7721和HCCLM3细胞系中具有很好的转染效率，能够在SMMC-7721和HCCLM3细胞系中有效地过表达ECSCR。

由于ECSCR在肝癌组织和肝癌细胞系中均呈显著低表达，且ECSCR低表达的肝癌患者的预后较高表达者更差，结合已有的文献分析，发明人有理由推测其可能参与了肝癌细胞的增殖和侵袭运动等生物学功能的调控。为此，发明人通过一系列实验对ECSCR是否能够抑制肝癌细胞的增殖和侵袭运动能力进行了验证。首先发明人采用生长曲线（MTT法绘制）的方法分别比较了SMMC-7721^ECSCR和SMMC-7721^Control细胞，以及HCCLM3^ECSCR和HCCLM3^Control细胞的增殖能力。结果显示，过表达ECSCR的SMMC-7721^ECSCR细胞的增殖速度明显低于对照组SMMC-7721^Control细胞，在第7天两者的细胞总数分别为6.09×10⁴和8.06×10⁴，两者之间存在显著性差异(P<0.01)(图5中的A)；而过表达ECSCR的HCCLM3^ECSCR细胞的增殖活性相较于HCCLM3^Control细胞也明显受抑，在第7天两者的细胞总数分别为1.47×10⁴和3.47×10⁴，两者之间也存在显著性差异(P<0.01)(图5中的B)。同时，集落形成实验的结果显示，SMMC-7721^ECSCR和HCCLM3^ECSCR细胞所形成的集落总数分别为109±22个和80±12个，相比于SMMC-7721^Control和HCCLM3^Control细胞的480±37个和255±17个，SMMC-7721^ECSCR和HCCLM3^ECSCR细胞所形成的集落数目分别减少了77%和68%，差异均具有显著性意义(P<0.01)(图5中的C，D)。继之发明人采用划痕愈合实验分别比较了SMMC-7721^ECSCR和SMMC-7721^Control细胞以及HCCLM3^ECSCR和HCCLM3^Control细胞的迁移运动能力。划痕愈合实验结果(100×)显示，与对照组比较，SMMC-7721^ECSCR和HCCLM3^ECSCR细胞的迁移运动能力明显下降，48小时后的划痕愈合率分别为47%vs.96%(图6中的A)，和27%vs.86%(图6中的B)，差异均具有显著性意义(P<0.001)。随后发明人进一步采用Transwell侵袭小室实验分别比较了SMMC-7721^ECSCR和SMMC-7721^Control细胞以及HCCLM3^ECSCR和HCCLM3^Control细胞在侵袭能力方面的差异。Transwell实验结果显示，SMMC-7721^ECSCR和HCCLM3^ECSCR细胞的侵袭能力分别较SMMC-7721^Control和HCCLM3^Control细胞明显下降。SMMC-7721^ECSCR和SMMC-7721^Control细胞经48小时培养后穿过Transwell小室的每低倍视野(100×)细胞数分别为33±8和134±11，差异具有统计学意义(P<0.001)(图6C)；而HCCLM3^ECSCR和HCCLM3^Control细胞经24小时培养后穿过Transwell小室的每低倍视野细胞数分别为12±4和56±7，差异也具有统计学意义(P<0.001)(图6中的D)。上述结果均表明，过表达ECSCR在体外实验中能够显著抑制肝癌细胞的增殖和侵袭运动能力。

5.ECSCR通过抑制TGFβ1/Smad信号通路调控肝癌细胞的增殖和侵袭运动

为了深入探讨ECSCR抑制肝癌细胞的增殖和侵袭运动的分子机制，发明人首先采用10条肿瘤常见信号通路筛选试剂盒(Cignal Finder Cancer10-Pathway Reporter Array CCA-101L)对SMMC-7721^ECSCR、HCCLM3^ECSCR细胞和SMMC-7721^Control、HCCLM3^Control细胞中不同信号通路的活化程度进行初步筛选。通过对不同信号通路的双荧光素酶活性强度进行检测，发明人发现与对照组SMMC-7721^Control和HCCLM3^Control细胞相比，SMMC-7721^ECSCR和HCCLM3^ECSCR细胞中与细胞的增殖及侵袭运动相关的TGFβ信号通路的活化程度明显下降，仅为对照组的0.29±0.15倍(P<0.01)；同时，SMMC-7721^ECSCR和HCCLM3^ECSCR细胞中与细胞凋亡相关的p53/DNA Damage信号通路的活化程度明显增强，达到对照组的2.85±0.21倍(P<0.01)(图7中的A)。上述结果均与本研究中已证实的ECSCR的生物学功能相吻合。

基于此，为了进一步阐明ECSCR抑制肝癌细胞的增殖和侵袭运动的具体分子机制，发明人采用Western-blot进一步检测了TGFβ信号通路中主要相关蛋白的表达水平。结果显示，与对照组SMMC-7721^Control和HCCLM3^Control细胞相比，过表达组SMMC-7721^ECSCR和HCCLM3^ECSCR细胞中ERK(1.012±0.241vs.0.977±0.208，P=0.836)和Smad2/3蛋白(0.979±0.283vs.1.053±0.312，P=0.903)的表达水平无明显差异，但TGFβ1(1.014±0.127vs.0.154±0.024，P<0.05)、p-ERK(2.118±0.406vs.0.479±0.093，P<0.05)和p-Smad2/3蛋白(1.471±0.215vs.0.249±0.048，P<0.05)的表达水平均明显降低(图7中的B)，提示ECSCR通过抑制TGFβ1的表达进而抑制了ERK和Smad2/3蛋白的磷酸化，但并不影响ERK和Smad2/3蛋白的表达水平。鉴于肌动蛋白(F-Actin)细胞骨架的形态变化是细胞迁移运动的形态学基础，发明人进而采用罗丹明标记的鬼笔环肽对肝癌细胞的肌动蛋白细胞骨架进行标记，采用DAPI标记细胞核，在激光共聚焦显微镜(1260×)(Leica confocal laser scanning microscope TCS SP5)下观察过表达组和对照组细胞的形态变化及F-Actin的表达情况，其中红色为结合罗丹明的鬼笔环肽特异性标记的肌动蛋白细胞骨架，蓝色为DAPI标记的细胞核，Merge为两者图像重叠。结果显示，高倍镜(1260×)下可见对照组SMMC-7721^Control和HCCLM3^Control细胞的形态舒展、多样，伸出大量伪足，且F-Actin纤维粗大明亮，排列有序；而ECSCR过表达组SMMC-7721^ECSCR和HCCLM3^ECSCR细胞的形态挛缩，且细胞中的F-Actin纤维呈细丝状，排列紊乱(图7中的C)。上述结果明显提示ECSCR可通过抑制TGFβ1/Smad信号通路抑制肝癌细胞的增殖和侵袭运动能力。

6.过表达ECSCR可在体内抑制肝癌细胞的增殖和肝内及肺转移

为了在体内环境研究过表达ECSCR对肝癌细胞的增殖和肝内及肺转移的影响，发明人建立了HCCLM3肝癌细胞系裸鼠原位移植模型。发明人首先将HCCLM3^ECSCR和HCCLM3^Control细胞分别种植于裸鼠右前腋皮下，30天后完整解剖取出皮下瘤，观察并比较HCCLM3^ECSCR和HCCLM3^Control细胞的皮下瘤的生长情况。结果显示，HCCLM3^ECSCR组裸鼠的皮下瘤的平均体积较HCCLM3^Control组明显减小(0.24±0.15vs.0.72±0.39cm³，P<0.05)(图8A)。接着发明人将HCCLM3^ECSCR组和HCCLM3^Control组裸鼠的皮下瘤切成大小一致的组织小块，分别种植于裸鼠的肝脏被膜下。于接种5周后，完整解剖取出裸鼠的肝脏和肺脏组织，行石蜡包埋并进行连续切片，经HE染色后于显微镜下观察，比较HCCLM3^ECSCR和HCCLM3^Control细胞的肝内转移及肺转移的能力。结果显示，HCCLM3^ECSCR组的6只裸鼠中仅有2只在种植部位以外的肝组织中发现了肿瘤结节，而HCCLM3^Control组的6只裸鼠中则有5只存在肝内转移，两组的肝内转移率具有显著性差异(33.3%vs.83.3%，P<0.05)(图8中的B，C，肉眼可见裸鼠肝脏种植部位以外的肿瘤结节即视为存在肝内转移。其中黄色箭头所示为肝内转移瘤，绿色箭头所示为肝脏种植部位形成的原位瘤)；HCCLM3^ECSCR组仅有1只裸鼠在其肺组织中发现了转移灶，而HCCLM3^Control组则有4只裸鼠存在肺转移，HCCLM3^ECSCR组的肺转移率显著低于HCCLM3^Control组(16.7%vs.66.7%，P<0.05)(图8中的D)；裸鼠的肺组织行连续切片并经HE染色后，镜下观察肺转移灶。a图的放大倍数为100×；b图的放大倍数为400×，蓝色箭头所示为肺转移灶（图8中的E)。上述实验结果表明，过表达ECSCR在体内能够显著地抑制肝癌细胞的增殖能力以及肝内和肝外肺转移的能力。

本发明的发明人在上述发现的基础上，提供了一种评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒。该试剂盒包括用于特异性检测ECSCR表达水平或表达模式的试剂。采用本发明的试剂盒，ECSCR作为一种评估肝细胞癌临床分期和预后的分子标记能够准确的对肝细胞癌的复发转移进行监测和预后评估。

根据本发明一种典型的实施方式，试剂包括用于特异性检测ECSCR mRNA表达水平或表达模式的RT-PCR引物，能够从mRNA水平上对ECSCR表达水平或表达模式进行监测和预后评估。

用于监测和预后评估ECSCR在mRNA表达水平或表达模式的RT-PCR引物的可以采用Primer5设计，优选地，RT-PCR引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

根据本发明一种典型的实施方式，试剂为用于特异性检测ECSCR所编码的蛋白的表达水平或表达模式，这样能够从蛋白水平上对ECSCR表达水平或表达模式进行监测和预后评估，结果更为准确。

优选地，试剂包括：用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人ECSCR蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。采用上述试剂，通过本发明描述的免疫组织化学法对ECSCR表达水平或表达模式进行监测和预后评估。

优选地，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂包括二甲苯、乙醇及蒸馏水。

优选地，用于脱水、透明和封片的试剂包括乙醇、二甲苯及PVP（聚乙烯吡咯烷酮）封片液。

根据本发明一种典型的实施方式，提供ECSCR作为分子标志物在制备评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒中的应用。

优选地，试剂盒包括用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人ECSCR蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。

应用本发明的试剂盒评估肝癌患者的临床分期和术后生存预后：

在本实施例中，发明人采用本试剂盒应用免疫组织化学法与步骤对随机选取的2例肝癌患者（编号分别为179和156）的术后组织标本中ECSCR的表达情况进行检测。其中，编号179的肝癌患者张某的肝癌组织标本中ECSCR mRNA相对于其癌旁组织的相对表达水平均值为0.102061，ECSCR蛋白的免疫组化评分为(±)，即阴性表达(或低表达)，其临床分型为NHCC（结节性肝癌），BCLC分期为C期，TNM分期为Ⅲ期，术后无瘤生存时间为90天，术后总体生存时间为125天；而编号为156的肝癌患者廖某的肝癌组织标本中ECSCR mRNA相对于其癌旁组织的相对表达水平均值为0.315716，ECSCR蛋白的免疫组化评分为(+)，即阳性表达(或高表达)，其临床分型为SLHCC（孤立性大肝癌），BCLC分期为A期，TNM分期为Ⅰ期，术后无瘤生存时间为1571天，术后总体生存时间为1571天，截至随访截止日期时仍未观察到该患者出现肝癌复发转移和因肝癌导致的死亡。

由此可见，ECSCR相对高表达的肝癌患者具有较好的临床分期以及更好的生存预后，即通过应用本试剂盒对肝癌患者的组织标本中ECSCR的表达情况进行检测可以有效地对肝癌患者的临床分期和生存预后情况进行准确评估。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性检测ECSCR表达水平或表达模式的试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括用于特异性检测ECSCR mRNA表达水平或表达模式的RT-PCR引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂用于特异性检测ECSCR所编码的蛋白的表达水平或表达模式。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括：

用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，

用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，

用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，

用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，

用于封闭的封闭血清，

山羊抗人ECSCR蛋白多克隆抗体，

辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，

用于显色的DAB显色剂和苏木素，

以及用于脱水、透明和封片的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂包括二甲苯、乙醇及蒸馏水。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于脱水、透明和封片的试剂包括乙醇、二甲苯及PVP封片液。

8.ECSCR作为分子标志物在制备评估肝细胞癌临床分期和预后的试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：

用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，

用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，

用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，

用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，

用于封闭的封闭血清，

山羊抗人ECSCR蛋白多克隆抗体，

辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，

用于显色的DAB显色剂和苏木素，

以及用于脱水、透明和封片的试剂。

10.ECSCR作为分子标志物在体外评估肝细胞癌临床分期和预后中的应用。

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