CN109868274A - 靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构建方法和在制备肝癌治疗药物中的应用，通过研究EGFL9在肝癌组织中的表达水平，为肝癌的治疗提供了EGFL9基因这一作用靶点；通过设计靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA序列、以及相应的siRNA表达质粒和siRNA慢病毒，从而能够高效抑制肝癌细胞中EGFL9基因的表达，并因此能够有效抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力，对于肝癌的EGFL9基因靶向治疗药物的制备意义重大；同时可用于相应RNAi、单克隆抗体及小分子拮抗剂等靶向治疗药物的开发，从而为针对EGFL9开发治疗肝癌的靶向治疗药物提供了一种行之有效的方法。

Description

靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构 建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和在制备肝癌治疗药物中的应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC；简称肝癌)现居我国恶性肿瘤发病率的第四位，其年死亡率已达23.31/10万，高居国内恶性肿瘤死亡率的第二位，严重威胁我国人民的生命健康。尽管近年来肝癌手术切除率已明显提高，肝癌的治疗手段已趋于多样化，肝移植也越来越多地用于肝癌的治疗，但肝癌的整体治疗水平目前仍无显著改善，术后5年生存率长期徘徊在30％左右。究其原因，主要在于肝癌术后极高的复发转移率。目前，肝癌术后5年内的复发/转移率仍高达70～80％，严重地制约着肝癌远期生存率的提高。因此，侵袭转移的调控机制一直都是肝癌研究的重点之一。

累积的研究显示，肝癌的侵袭转移是一个多步骤、序贯的生物学过程，牵涉到许多复杂的生物学、病理学事件，包括肿瘤细胞的脱落、运动迁移、细胞粘附、血管生成及免疫逃逸等诸多环节，但细胞侵袭迁移能力的提高是导致肿瘤突破内皮细胞屏障并发生远处转移的关键环节，故而已有大量研究都集中于肝癌细胞侵袭迁移能力的调控。然而，目前的研究仍未完全阐明调控肝癌细胞侵袭迁移的分子机制，因而尚未开发出可有效抑制肝癌复发转移的药物，从而严重制约了肝癌病人长期生存率的进一步提高。可见，继续寻找在肝癌侵袭迁移中发挥重要作用的分子并阐明其作用机制，对于研发抑制肝癌复发转移的靶向治疗措施均非常重要。

EGFL9基因(表皮生长因子样9结构域，又称DLK2)属于EGFL家族成员，其定位于人染色体6p21.1，大小为6,281bp。EGFL9基因编码的蛋白大小为40.5kDa，属于跨膜糖蛋白，在人体组织中有着范围较广的表达谱，在肺脏、大脑、脂肪、睾丸、成人肝脏、胎盘、卵巢和胸腺组织中都有表达。早期的研究显示，EGFL9在脂质生成过程中发挥重要作用。近来的研究则发现，EGFL9基因的突变与进展期前列腺癌相关，这首次提示EGFL9可能参与恶性肿瘤的发生发展过程。还有研究发现 EGFL9可通过抑制Notch1信号通路从而抑制SK-MEL-2转移性黑色素瘤细胞的增殖，最新的研究还发现，针对小鼠EGFL9(DLK2)的疫苗可以降低小鼠模型中肾癌的生长，提示EGFL9是一个潜在的肿瘤治疗靶点。然而迄今为止，EGFL9在肝癌等恶性肿瘤中的表达水平及其在恶性肿瘤侵袭转移过程中的作用均尚无任何研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和在制备肝癌治疗药物中的应用，通过研究EGFL9在肝癌组织中的表达水平、设计人EGFL9基因的siRNA序列，并构建相应的siRNA质粒和干扰慢病毒，以慢病毒介导siRNA的方法，特异性抑制肝癌细胞中EGFL9基因的表达，从而实现抑制肝癌细胞侵袭转移的作用。

本发明通过实时定量PCR检测EGFL9基因在肝癌组织及细胞系中的表达水平，以及通过免疫组织化学技术检测EGFL9蛋白在肝癌组织中的表达水平，首次证明 EGFL9基因在肝癌组织及细胞系中的表达明显上升，且EGFL9的表达上调与肝癌的多结节、包膜侵犯、静脉侵犯及较晚的TNM分期等临床病理特征密切相关，而侵袭转移潜能越高的肝癌细胞系中的EGFL9表达量也越高；同时，首次发现抑制 EGFL9基因的表达可明显抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力，证明EGFL9可作为肝癌治疗的一个有效作用靶点。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供的一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA，所述siRNA序列为 5’-CTGTGAGGTAAATGTGGATGA-3’(序列1)。

本发明提供的一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA质粒，包括含有上述si RNA序列的双链DNA oligo；所述双链DNA oligo的正义链序列为5’-CCGGCTGT GAGGTAAATGTGGATGATTCAAGAGATCATCCACATTTACCTCACAGTTTTTG- 3’(序列2)，反义链序列为5’-AATTCAAAAAGGTGGCAAGACCTGTGAGCTTTC TCTTGAAAAGCTCACAGGTCTTGCCACC-3’(序列3)，其两端含有Age I和 EcoR I酶切位点粘端。

本发明提供的一种靶向抑制EGFL9基因表达的干扰慢病毒，包括上述siRNA 质粒以及慢病毒包装载体；并且其构建方法包括以下步骤：

(1)siRNA质粒的构建

(1-1)以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于GV248载体以使其线性化，电泳鉴定其酶切片段，得到线性化的GV248质粒；

(1-2)通过T4DNA连接酶将所述线性化的GV248质粒和纯化好的权利要求2 所述双链DNAoligo连接，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞，以连接转化产物长出菌溶于LB培养基作为模板进行PCR鉴定；

(1-3)PCR鉴定采用的引物为：

上游：5’-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3’(序列4)；

下游：5’-ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG-3’(序列5)；

对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含有EGFL9干扰片段的siRNA质粒；

(2)干扰慢病毒的构建

以所述siRNA质粒作为表达载体，Helper 1.0和Helper 2.0慢病毒包装辅助质粒作为慢病毒包装载体，同时共转染293T细胞，在该细胞中进行病毒的包装并分泌到细胞外的培养基中，收集培养基离心后取得的上清液，即为包含所述siRNA质粒的干扰慢病毒。

本发明还提供了上述靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒在制备肝癌治疗药物中的应用；以及包括上述靶向抑制EGFL9基因表达的 siRNA、siRNA质粒或干扰慢病毒的药物组合物。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过研究EGFL9在肝癌组织中的表达水平，为肝癌的治疗提供了EGFL9 基因这样一个非常有效的作用靶点；设计了靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA序列、 siRNA表达质粒及siRNA慢病毒，该siRNA慢病毒能够高效抑制肝癌细胞中EGFL9 基因的表达，并因此能够有效抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力，对于肝癌的EGFL9基因靶向治疗药物的制备意义重大；同时可用于相应RNAi、单克隆抗体及小分子拮抗剂等靶向治疗药物的开发，从而为针对EGFL9开发治疗肝癌的靶向治疗药物提供了一种行之有效的方法。

附图说明

下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细描述：

图1是GV248质粒DNA图谱；

图2是Helper1.0质粒DNA图谱；

图3是Helper2.0质粒DNA图谱；

图4是实时定量PCR检测EGFL9基因在肝癌组织中表达量的结果示意图(A： EGFL9基因在20例肝癌及相应癌旁肝组织中的表达量；B：肝癌及癌旁肝组织中EGFL9基因表达量的比较)；

图5是实时定量PCR检测EGFL9基因在肝癌细胞系及正常肝细胞系中表达量的结果示意图；

图6是免疫组织化学法检测EGFL9蛋白在肝癌组织及相应癌旁肝组织中表达水平的结果示意图(A-D：EGFL9在肝癌组织中染色为(+++)、(++)、(+)及(-) 的代表性结果图片；E-H：分别为A-D四例肝癌组织的相应癌旁肝组织)；

图7是EGFL9-siRNA慢病毒感染SMMC-7721肝癌细胞系的感染效率及抑制效率的结果示意图(A：荧光显微镜观察结果显示EGFL9-siRNA慢病毒的感染效率达 80％以上；B：实时定量PCR检测结果显示EGFL9-siRNA慢病毒对SMMC-7721 肝癌细胞系中EGFL9基因的抑制效率高达85.2％)；

图8是靶向抑制EGFL9基因对肝癌细胞侵袭能力的影响的结果示意图(A： EGFL9-siRNA组SMMC-7721肝癌细胞侵袭Matrigel胶并穿出聚碳脂膜的显微镜照片(200×)；B：对照组SMMC-7721肝癌细胞侵袭Matrigel胶并穿出聚碳脂膜的显微镜照片(200×)；C：侵袭SMMC-7721细胞数统计分析的直方图)；

图9是靶向抑制EGFL9基因对肝癌细胞迁移能力的影响的结果示意图(A： EGFL9-siRNA组SMMC-7721肝癌细胞迁移穿过聚碳脂膜的显微镜照片(200×)； B：对照组SMMC-7721肝癌细胞迁移穿过聚碳脂膜的显微镜照片(200×)；C：迁移SMMC-7721细胞数统计分析的直方图)；

图10是靶向抑制EGFL9基因对肝癌细胞迁移率的影响的结果示意图(A： EGFL9-siRNA组SMMC-7721肝癌细胞划痕0小时和24小时的照片；B：对照组 SMMC-7721肝癌细胞划痕0小时和24小时的照片；C：SMMC-7721细胞迁移率统计分析的直方图)。

具体实施方式

图1～图10所示为本发明靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、干扰慢病毒及其构建方法和应用的实施例，通过研究EGFL9在肝癌组织中的表达水平、设计人EGFL9基因的siRNA序列，并构建相应的siRNA质粒和干扰慢病毒，以慢病毒介导siRNA的方法，特异性抑制肝癌细胞中EGFL9基因的表达，从而实现抑制肝癌细胞侵袭迁移能力的作用。

1、实时定量PCR检测EGFL9基因在肝癌组织及细胞系中的表达水平

1)收集标本：收集2012年3月至2015年4月间在广州市红十字会医院手术切除的肝癌新鲜标本共20例，所有标本术后均经我院病理科行病理确认。每例组织样本均包括肝癌组织及癌旁肝组织，肝癌组织取自肿瘤内无肉眼可见坏死的组织，癌旁肝组织则取距肿瘤边缘2cm以上无肉眼可见病变的组织。所有标本离体后立即存放于液氮罐中，随后转送并储存于-80℃深低温冰箱中直至行荧光定量实时PCR 检测。

2)细胞培养：正常肝脏细胞系HL7702和肝癌细胞系SK-HEP-1、Huh-7、 Bel-7402、SMMC-7721、HepG2和Hep3B均购自上海吉凯基因公司，各细胞系均置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中，以含10％胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基培养，按常规进行传代。

3)总RNA提取：取约绿豆大小组织至1.5ml离心管内，用剪刀剪碎组织后用匀浆器匀浆，加入Trizol 1mL(Invitrogen)，充分混匀，室温条件下放置5分钟。加入氯仿0.2mL，盖紧盖子，用振荡器振荡15秒，室温下孵育3分钟，4℃、12000rpm 离心15分钟，取上清液到新的1.5mL离心管中。加与上清液等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃下孵育样品30分钟，4℃、12000rpm离心10分钟，弃上清液。以含焦碳酸二乙酯(DEPC)水的75％乙醇800μL洗涤沉淀一次，4℃7500r/min离心 5min，弃乙醇。空气或真空干燥5-10min，加DEPC处理水20～50μL溶解总RNA， -80℃保存备用。收集细胞后于2000rpm离心5分钟，去上清，细胞沉淀中加入1mLTrizol，充分混匀后室温静置5分钟，然后转移至新的1.5mL离心管中，其余同组织标本的处理步骤。

4)RNA逆转录：将2μL Oligo dT(0.5μg/μL)和2.0μg总RNA加入到PCR小管中，补RNase-Free H₂O至11μL；混匀后离心，70℃温浴10分钟，之后立即置于0℃冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火。按表1所示在冰上配制25μL逆转录反应体系，在42℃反应1小时，然后在70℃水浴10分钟使逆转录酶失活，将得到的反转录产物 cDNA置于-20℃保存备用。

表1 逆转录反应体系

试剂	每管加入量(μL)
		5×RT buffer	5.0
10mM dNTPs	2.0
		Rnasin(40U/ul)	0.4
M-MLV-RTase(200U/ul)	1.0
		RNase-Free H2O	5.6

5)实时定量PCR检测：按表2配置20μLPCR反应体系，采用日本TAKARA 公司TP800实时定量PCR仪行PCR检测。EGFL9基因引物序列为：上游， 5’-TGCAAAGTGGGTGTCATTGG-3’；下游，5’-GACCGATTATTGCATTGGCAG-3’。以管家基因β-actin为内参照，引物序列为：上游， 5’-GCATGGGTCAGAAGGATTCCT-3’；下游，5’-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3’。 PCR反应条件为：95℃预变性15秒，然后95℃变性5秒，60℃退火延伸30秒，共进行45个循环，每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1分钟，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4秒,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2^-ΔΔCT法分析Mus81基因的表达量。实验结果如图4所示，Egfl9在80％(16/20)的肝癌组织中表达水平高于相应癌旁肝组织，即Egfl9基因表达上调，且在65％(13/20)的肝癌组织中的上调倍数大于5，在30％(6/20)的肝癌组织中上调倍数大于10，最高的上调倍数为1050.31 倍(见图4A)。同时，Egfl9在肝癌组织中的平均表达水平也明显高于癌旁肝组织 (1.872±0.482比0.561±0.143，P＝0.0024；见图4B)。另外，Egfl9基因在SMMC-7721 等6株肝癌细胞系中的表达水平均高于正常肝细胞系HL-7702(见图2)，且其表达水平在高侵袭转移潜能的SK-HEP-1细胞系中的表达明显高于中等侵袭转移潜能的 Huh-1、Bel-7402及SMMC-7721细胞系，后者中的Egfl9基因表达水平又明显高于低侵袭转移潜能的HepG2细胞系，Egfl9基因在无侵袭转移潜能的Hep3B细胞系中的表达水平则最低，提示EGFL9基因的表达水平与肝癌细胞的侵袭转移潜能密切相关。

表2 PCR反应体系

2、免疫组织化学技术检测EGFL9蛋白在肝癌组织中的表达水平

1)标本收集：收集2005年6月至2016年2月期间在广州市红十字会医院手术切除的40位肝癌病人的石蜡标本，其中男性30例，女性10例；最大年龄80岁，最小年龄30岁，年龄中位数为55岁，平均年龄为55岁。每例标本均包括肝癌组织与癌旁肝组织两部分切片，且肝癌的诊断均经术后病理检查证实。同时收集上述40 位肝癌病人的临床病理资料：性别、年龄、血清甲胎蛋白(AFP)水平、是否存在肝硬化、肿瘤大小、肿瘤结节数目、包膜是否完整、是否存在静脉侵犯、肿瘤细胞分化程度及肿瘤TNM分期(按照UICC/AJCC 2010年标准)。

2)免疫组织化学检测：

①组织切片脱蜡水化：将组织切片分别先后放入3个存满二甲苯试剂的玻璃缸中浸润13分钟。再先后放入2个存有无水酒精的玻璃缸中5分钟。然后先后置入装有95％酒精的玻璃缸中5分钟。再先后置入存有90％、85％、75％酒精的玻璃缸中 2分钟。最后置入装有自来水、蒸馏水中的玻璃缸中洗涤，反复3次。

②抗原修复：将组织切片放入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，高压力环境下煮沸修复，在溶液沸腾后持续加热3分钟，维持30分钟上下。

③关闭非外源性过氧化氢酶：组织切片置入3％过氧化氢溶液的玻璃缸中，持续浸泡15分钟。然后置入蒸馏水溶液的试剂缸中清洗，反复3次。再置入装满磷酸缓冲盐溶液(PBS)的玻璃缸中，持续浸泡5分钟。

④抗体杂交：组织切片甩去PBS余液，加稀释好的一抗100μL(兔抗人EGFL9 多克隆抗体，购自英国abcam公司；1:400稀释)，再置于PBS缓冲液的容器缸中，轻柔震荡然后洗涤5分钟，随后置换PBS缓冲液，同法重复执行4次后甩干。随即加入二抗试剂50μL，放置于湿盒中，常温37℃条件下放置60分钟。然后置于装有 PBS缓冲液的玻璃容器中，轻柔震荡并洗涤5分钟，置换洗涤后的PBS缓冲液，同法执行操作3次。

⑤显色：组织切片置于装有PBS缓冲液的玻璃缸中，轻柔匀速震荡濯洗5分钟，置换玻璃缸中的PBS缓冲液，同方法执行3次。滴加新鲜的二氨基联苯胺(DAB) 工作液100μL，放置3分钟，观察反应部位呈现黄褐色时，置入装有自来水的玻璃水缸中反复清洗3次。

⑥复染、脱水及透明封片：组织切片浸入苏木精溶剂中进重复染色，静置5 分钟后用自来水重复刷洗直至水不改变色泽为止。然后，先后放入装有95％酒精溶剂的玻璃缸中进浸泡5分钟。再依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸中，每一玻璃缸浸泡5分钟。最后放入2个存好二甲苯的玻璃容器中，每一容器内均浸泡5分钟。滴加适量中性树胶、然后封片。

3)染色评分及结果判断：在高倍显微镜视野下阅片，根据染色强弱和阳性细胞所占总细胞数百分比实行半定量检测，染色强弱的判断标准如下：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色则为3分；阳性细胞所占比例的评判标准为：阳性细胞数<5％为0分，5～25％者记为1分，26～50％者记为2分，51～75％为3 分，76～100％为4分。两组分数相乘所得分数作为评级标准：0分定为阴性(-)，1～ 4分定作弱阳性(+)，5～8分定作中等阳性(++)，9～12分定为强阳性表现(+++)。若肝癌组织切片中EGFL9染色评分高于相应的癌旁肝组织切片，则为EGFL9蛋白表达上调。

4)EGFL9蛋白表达水平与肝癌临床病理特征的相关性：免疫组织化学检测结果显示，EGFL9蛋白主要表达于肝癌细胞或肝细胞的胞浆、核膜及胞膜，且在67.5％ (27/40)的肝癌组织中表达水平上调(代表性结果详见图3)，进一步验证了实时定量PCR的检测结果，说明EGFL9在肝癌组织中表达上调。且EGFL9蛋白表达上调与肝癌的肿瘤多结节(P＝0.020)、包膜侵犯(P＝0.030)、静脉侵犯(P＝0.033)及较晚的TNM分期(P＝0.037)密切相关(见表3)，由于这些临床病理特征与肝癌的侵袭转移直接相关，这些结果进一步显示EGFL9表达上调与肝癌的侵袭转移密切相关。

表3 Egfl9蛋白表达上调与肝癌临床病理特征的相关性

3、设计EGFL9基因siRNA序列并构建EGFL9-siRNA和阴性对照质粒

首先从Genebank中调取人EGFL9基因的序列(NM_206539)，然后利用上海吉凯基因化学技术公司的设计软件Genechem设计3条针对EGFL9基因的siRNA 序列，并从中筛选出干扰效果最佳的siRNA序列：5’-CTGTGAGGTAAAT- GTGGATGA-3’。随后设计包含EGFL9基因siRNA序列的双链DNAoligo，其序列及结构如表4所示。上述双链DNAoligo由上海吉凯基因化学技术公司合成，把合成所得的DNA干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15分钟，然后自然冷却至室温，即形成包含干扰靶点序列的DNA双链。以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于 GV248载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司，质粒DNA图谱见图1)以使其线性化，酶切反应体系见表5，琼脂糖凝胶电泳鉴定其酶切片段。

表4 EGFL9 siRNA双链DNA oligo

表5 GV248质粒双酶切反应体系

通过T4DNA连接酶将线性化的GV248质粒和纯化好的双链DNAoligo连接，在适当的连接反应体系(表6)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的感受态大肠杆菌细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌表面沾一下，溶于10μL LB培养基，混匀取1μL作为模板。

针对GV248质粒中EGFL9RNA干扰序列的上下游设计PCR鉴定引物进行PCR 鉴定实验：上游，5’-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3’；下游，5’- ATGTC-CTTCTGCTGATACTGGG-3’。PCR鉴定反应体系见表4，PCR反应条件见表7。然后对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含有EGFL9干扰片段的siRNA载体，命名为GV248-EGFL9-siRNA。

表6 连接反应体系

试剂	体积(μL)
		线性化载体(100ng/μL)	1
双链DNA(100ng/μL)	1
		10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液	2
T4噬菌体DNA连接酶	1
		dd H<sub>2</sub>O	15
总计	20

表7 PCR鉴定实验反应体系

试剂	体积(μL)
		2×Taq Plus Master Mix	10
上游引物	0.4
		下游引物	0.4
Template	1
		ddH<sub>2</sub>O	9.2
总计	20

siRNA阴性对照靶点序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，构建siRNA 对照质粒时，针对siRNA阴性对照靶点序列合成双链DNAoligo序列(表8)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同GV248-EGFL9-siRNA质粒，构建成功的阴性对照命名为GV248对照质粒。

表8 siRNA阴性对照双链DNA oligo

4、构建EGFL9-siRNA慢病毒及siRNA对照慢病毒

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取GV248-Mus81-siRNA质粒及siRNA对照质粒，分别制备成100ng/μL的质粒储存液。同法提取Helper 1.0和pHelper 2.0慢病毒包装辅助质粒(购自上海吉凯基因公司)。转染前24小时，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为5×10⁶细胞/15 mL，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养，24小时后待细胞密度达70～80％时即可用于转染。转染前2小时将细胞培养基更换为无PBS培养基。向一灭菌离心管中加入所制备的GV248-EGFL9-siRNA质粒或阴性对照质粒及各包装质粒溶液(GV248-EGFL9-siRNA质粒或阴性对照质粒20μg，Helper 1.0质粒15μg， Helper 2.0质粒10μg)，与相应体积的转染试剂混合均匀，调整总体积为1mL，在室温下温育15分钟。将该混合液缓慢滴加至293T细胞培养液中(加入过程注意均匀，避免将细胞吹起)并混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养6小时后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃。缓慢加入含10％FBS的细胞培养基20ml，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48小时，然后收集293T细胞上清液。于4℃，4000g离心10分钟，除去细胞碎片。以0.45μm滤器过滤上清液于40mL超速离心管中，在4℃、25000rpm下离心2小时。离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬(尽可能地避免病毒长时间暴露在室温中，减少病毒损失)。经充分溶解后，10000rpm高速离心5分钟后，取上清按要求分装。包含 GV248-EGFL9-siRNA质粒和siRNA阴性对照质粒的慢病毒分别命名为 EGFL9-siRNA慢病毒和siRNA对照病毒。

5、EGFL9-siRNA慢病毒感染肝癌细胞系的感染效率及抑制效率

胰酶消化对数生长期的SMMC-7721肝癌细胞系，以培养基制成细胞悬液后接种于12孔板中，培养至细胞融合度达到20％左右。按照MOI(感染复数)＝10，加入2×10⁹/ TU/ml的EGFL9-siRNA慢病毒0.5μL，培养16小时后更换培养基，感染3天后荧光拍照评估感染效率，感染7天后收集细胞采用荧光实时定量PCR检测EGFL9基因的敲减效率。细胞总RNA提取、逆转录及荧光实时定量PCR实验方法如前所述。实验结果如图3所示，EGFL9-siRNA及对照慢病毒对肝癌细胞的感染效率均达到80％以上，感染EGFL9-siRNA慢病毒组SMMC-7721细胞中EGFL9基因的表达量仅为阴性对照组细胞的14.8％，即EGFL9-siRNA慢病毒对肝癌细胞中EGFL9基因表达的抑制效率达到了85.2％，效果理想。

6、靶向抑制EGFL9基因表达可明显抑制肝癌细胞的侵袭能力

采用Transwell侵袭小室实验检测EGFL9基因表达抑制对肝癌细胞侵袭能力的影响。将Matrigel胶(购自美国Becton-Dickinson公司)预先用4℃的无FBS细胞培养液稀释至200μg/mL，取200μl稀释的DMEM置于孔径为8μm的Transwell小室(购自美国Costar公司)聚碳脂膜上，使膜上所有的微孔被Matrigel胶覆盖，37℃过夜干燥。备好的Transwell小室用紫外线照射2小时，使用前加入少量的灭菌无 FBS培养液使其水化，并取一小室用考马斯亮兰染色检查确定无漏孔。将 EGFL9-siRNA组和对照组SMMC-7721细胞按1×10⁵细胞数加入每个小室，下室内加入含30％FBS的培养基750μL，5％CO₂、37℃孵育48小时。倒扣Transwell小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去非侵袭细胞。滴2～3滴Giemsa染色液到膜的下表面染色侵袭细胞3～5分钟后，将小室浸泡冲洗数次，空气晾干。在显微镜下拍照：每个小室随机选取视野，拍100×照片4张，200×照片9张。以200×的照片来计数并进行数据分析，比较EGFL9-siRNA组与对照组侵袭细胞数的差异，各组聚碳脂膜照片见图6，可知EGFL9-siRNA组细胞的侵袭细胞数明显低于对照组，仅为对照组的51.75％，证明敲减EGFL9基因可明显抑制肝癌细胞的侵袭能力。

7、靶向抑制EGFL9基因表达可明显抑制肝癌细胞的迁移能力

1)Transwell实验检测EGFL9基因表达抑制对肝癌细胞迁移能力的影响：取出Transwell小室置于新的24孔板中，上室加100μL无FBS培养基，37℃培养箱中放置1小时。将EGFL9-siRNA组和对照组SMMC-7721细胞按1×10⁵细胞数加入每个小室，下室内加入含30％FBS的培养基600μL，5％CO₂、37℃孵育48小时。倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去小室内非转移细胞，滴2～3 滴Giemsa染色液到膜的下表面染色转移细胞3～5分钟后，将小室浸泡冲洗数次，空气晾干。在显微镜下拍照：每个小室随机选取视野，拍100×照片4张，200×照片 9张。以200×的照片来计数并进行数据分析，比较EGFL9-siRNA组与对照组迁移细胞数的差异，各组聚碳脂膜照片见图6，可知EGFL9-siRNA组细胞的迁移细胞数明显低于对照组，较对照组下降了33.33％，证明靶向抑制EGFL9基因可明显抑制肝癌细胞的迁移运动能力。

2)划痕愈合实验检测EGFL9基因表达抑制对肝癌细胞迁移能力的影响： EGFL9-siRNA组和对照组SMMC-7721细胞按3×10⁴数量加入96孔板，以含10％ FBS的培养基培养过夜，使细胞呈现出单层贴壁生长状态且细胞融合度达到100％。更换不含FBS的培养基，并用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。用不含FBS的培养基漂洗2次，洗去刮下的飘浮细胞。再加入不含FBS的培养基，拍照记录划痕距离。在5％CO₂、37℃培养箱中继续培养24小时，拍照记录划痕距离，每组实验重复3次，计算并比较各组细胞迁移率，迁移率计算公式为：迁移率＝(0小时划痕宽度-24小时划痕宽度)/0小时划痕宽度×100％。EGFL9-siRNA 组和对照组0小时及24小时划痕宽度及迁移率比较见图7，可见EGFL9-siRNA组肝癌细胞24小时迁移率明显低于对照组，较对照组下降了37.50％，这一结果不仅验证了Transwell实验的结果，而且进一步证明靶向抑制EGFL9基因可明显抑制肝癌细胞的迁移能力。

序列表

<110> 广州市红十字会医院（暨南大学医学院附属广州红十字会医院）

<120> 靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构建方法和应用

<141> 2019-02-13

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtgaggta aatgtggatg a 21

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggctgtga ggtaaatgtg gatgattcaa gagatcatcc acatttacct cacagttttt 60

g 61

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aattcaaaaa ggtggcaaga cctgtgagct ttctcttgaa aagctcacag gtcttgccac 60

c 61

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatgattcc ttcatatttg c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtccttct gctgatactg gg 22

Claims (10)

1.一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA，其特征在于：所述siRNA序列为5’-CTGTGAGGTAAATGTGGATGA-3’(序列1)。

2.一种靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA质粒，其特征在于：包括含有权利要求1所述siRNA序列的双链DNA oligo；所述双链DNA oligo的正义链序列为5’-CCGGCTGTGAGGTAAATGTGGATGATTCAAGAGATCATCCACATTTACCTCACAGTTTTTG-3’(序列2)，反义链序列为5’-AATTCAAAAAGGTGGCAAGACCTGTGAGCTTTCTCTTGAAAAGCTCACAGGTCTTGCCACC-3’(序列3)，其两端含有Age I和EcoR I酶切位点粘端。

3.一种靶向抑制EGFL9基因表达的干扰慢病毒，其特征在于：包括权利要求2所述siRNA质粒以及慢病毒包装载体。

4.权利要求3所述靶向抑制EGFL9基因表达的干扰慢病毒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)siRNA质粒的构建

(1-1)以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于GV248载体以使其线性化，电泳鉴定其酶切片段，得到线性化的GV248质粒；

(1-2)通过T4 DNA连接酶将所述线性化的GV248质粒和纯化好的权利要求2所述双链DNAoligo连接，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞，以连接转化产物长出菌溶于LB培养基作为模板进行PCR鉴定；

(1-3)PCR鉴定采用的引物为：

上游：5’-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3’(序列4)；

下游：5’-ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG-3’(序列5)；

对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的含有EGFL9干扰片段的siRNA质粒；

(2)干扰慢病毒的构建

以所述siRNA质粒作为表达载体，Helper 1.0和Helper 2.0慢病毒包装辅助质粒作为慢病毒包装载体，同时共转染293T细胞，在该细胞中进行病毒的包装并分泌到细胞外的培养基中，收集培养基离心后取得的上清液，即为包含所述siRNA质粒的干扰慢病毒。

5.权利要求1所述靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA在制备肝癌治疗药物中的应用。

6.权利要求2所述靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA质粒在制备肝癌治疗药物中的应用。

7.权利要求3所述靶向抑制EGFL9基因表达的干扰慢病毒在制备肝癌治疗药物中的应用。

8.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求1所述的靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA。

9.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求2所述的靶向抑制EGFL9基因表达的siRNA质粒。

10.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求3所述的靶向抑制EGFL9基因表达的干扰慢病毒。