CN108283722B - Specc1l在治疗肝癌和/或术后预防肝癌复发的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种SPECC1L基因在治疗肝癌和/或术后预防肝癌复发的药物中的应用，即SPECC1L基因在治疗肝癌和/或抑制肝癌术后癌细胞增殖与侵袭转移的药物中的应用，还公开了用于治疗肝癌和/或术后预防肝癌复发的药物组合物。本发明通过多种手段发现在肝癌细胞系和肝细胞癌组织中SPECC1L呈高表达，且其高表达与肝细胞癌病人不良的临床病理特征以及术后总体生存时间、无瘤生存时间密切相关；并发现SPECC1L在肝细胞癌组织中高表达是影响肝癌长期生存预后的一个独立危险因素；SPECC1L能够促进肝癌细胞的增殖与侵袭转移。因此，SPECC1L可应用于制备治疗肝癌和/或抑制肝癌术后癌细胞增殖与侵袭转移的药物中。

Description

SPECC1L在治疗肝癌和/或术后预防肝癌复发的药物中的应用

技术领域

本发明涉及肝癌治疗领域，特别地，涉及一种SPECC1L基因在治疗肝癌和/或术后预 防肝癌复发的药物中的应用。

背景技术

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。据最新统计，男性肝癌每年全球新发病例55.4 万例，在男性所有肿瘤中排第五；女性每年新发病例22.8万例，在女性所有肿瘤中排第八。 全球每年肿瘤死亡病例中，肝癌占所有肿瘤死亡病例的5.7％。发展中国家肝癌发病率明显 高于发达国家。据统计，全球肝癌一半以上发生在亚洲地区，严重威胁着人类生命健康。 虽然近年来肝癌的诊断技术以及以手术、化疗、TECA等为主的综合治疗方法有了长足的 发展，但肝癌患者的长期生存率并没有得到很大提高，5年总体生存率仍处在30％左右。 肿瘤复发、转移是影响肝癌预后恶劣的主要因素。因此，进一步深入开展肝癌转移、复发 的机制研究，研发新的肝癌复发转移干预措施，对提高肝癌患者的长期预后是十分有必要 的。肝癌复发、转移是涉及肿瘤细胞增殖、侵袭生长、肿瘤血管生成、肿瘤细胞迁移运动、转移灶形成等多基因、多环节、多步骤的极其复杂的病理过程。而在肿瘤侵袭、转移的多 个步骤和环节中，肿瘤细胞的迁移运动能力发挥着至关重要的作用。同时在肝癌侵袭转移 过程中，许多细胞内调控信号发生改变，如Integrin信号、PI3K-AKT信号及Wnt信号通 路等等，这些信号的改变在肝癌的侵袭转移过程中发挥重要作用。SPECC1L(sperm antigenwith calponin homology and coiled-coil domains 1 like)蛋白是一种细胞骨架蛋白“横连”蛋 白，具有3个螺旋卷曲结构域和一个钙调蛋白结构域。已有的研究表明，SPECC1L能够 同时与细胞微管蛋白及肌动微丝蛋白相互作，具有稳定细胞微管蛋白、参与纺锤体形和促 进细胞运动中肌动蛋白微丝重组的功能，对细胞粘附发挥重要调控作用，并能促进细胞迁 移运动，同时SPECC1L蛋白还参与Integrin信号、PI3K-AKT信号及Wnt信号通路的 调节。然而，SPECC1L在肝癌细胞中是否也参与了这些信号通路的改变，是否通过这些信 号通路发挥促进肝癌侵袭转移，还需要进一步深入探究。

发明内容

本发明提供了一种SPECC1L基因在治疗肝癌和/或术后预防肝癌复发的药物中的应 用，以解决肝癌患者术后肝癌细胞容易在人体内增殖与侵袭转移导致癌细胞扩散的技术问 题。

本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种SPECC1L基因在治疗肝癌和/或抑制肝癌术后癌细胞增殖与侵袭转 移的药物中的应用。

进一步地，应用包括在慢病毒载体中携带所述SPECC1L基因的敲除质粒的给药方式。

进一步地，SPECC1L基因的敲除序列为序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4所示的基因序列中的一种。

进一步地，SPECC1L基因的敲除序列为序列表中SEQ ID NO.4所示的基因序列。

作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种药物组合物，包含用于敲除表达SPECC1L基因的负载于慢病毒载体的shSPECC1L。

作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种药物组合物，包含用于敲除表达SPECC1L基因的shSPECC1L以及与shSPECC1L相连接的递送载体。

进一步地，递送载体为电荷翻转型药物载体。

本发明具有以下有益效果：本发明通过多种手段发现在肝癌细胞系和肝细胞癌组织中 SPECC1L呈高表达，且其高表达与肝细胞癌病人不良的临床病理特征以及术后总体生存、 无瘤生存密切相关；并发现SPECC1L在肝细胞癌组织中高表达是影响肝癌长期生存预后 的一个独立危险因素；SPECC1L能够促进肝癌细胞的增殖侵袭转移。因此SPECC1L可应用于制备治疗肝癌和/或抑制肝癌术后癌细胞增殖与侵袭转移的药物中。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下 面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例 及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明优选实施例的SPECC1LmRNA和蛋白在肝癌细胞系以及肝细胞癌组织中 的表达情况图；图1A是采用Real-time PCR检测SPECC1L mRNA在32例肝癌组织和匹配的邻近非肿瘤肝组织(ANLT)中的表达情况图；图1B是采用Real-time PCR检测在肝癌 细胞系和正常肝细胞系L02细胞中SPECC1LmRNA的表达情况图；图1C是采用 Western-blot检测4对癌组织和ANLT及1对正常肝组织中SPECC1L蛋白表达情况图；图 1D.是采用Western-blot检测人肝细胞系L02与8种肝癌细胞系中SPECC1L蛋白表达水平 图；IHC检测正常癌组织、肝癌及匹配的ANLT中SPECC1L表达的代表性图片；图1E是 采用IHC检测正常癌组织、肝癌及匹配的ANLT中SPECC1L表达的代表性图片；

图2是本发明优选实施例的队列纳入与排除过程的流程示意图；

图3是本发明优选实施例的SPECC1L表达与肝癌患者术后不良的关系图；图3A是采用IHC检测training cohort与validation cohort石蜡标本中肝癌组织中SPECC1L的表达情况 图；图3B是采用通过Kaplan-Meier方法分析training cohort中SPECC1L高表达组(73例) 与SPECC1L低表达组(57例)总体生存时间的差异图；图3C是采用Kaplan-Meier方法 分析training cohort中SPECC1L高表达组(73例)与SPECC1L低表达组(57例)无瘤生 存时间的差异图；图3D是采用Kaplan-Meier方法分析validation cohort SPECC1L高表达 组(77例)与SPECC1L低表达组(43例)总体生存时间的差异结果图；图3E是分析Validationcohort中SPECC1L高表达组(77例)与SPECC1L低表达组(43例)HCC病人术后无瘤 生存时间的差异图；

图4是本发明优选实施例的SPECC1L能够显著促进肝癌细胞的增殖图；图4A为采用real-time PCR检测HCCLM3-shSPECC1L中敲除效率图；图4B为采用real-time PCR检测HepG2-SPECC1L细胞中的过表达效率图；图4C为采用western-blot检测 HCCLM3-shSPECC1L细胞中SPECC1L过表达效率图；图4D为采用western-blot检测 HepG2-SPECC1L细胞中SPECC1L过表达效率图；图4E为集落形成实验检测 HepG2-SPECC1L、HepG2-vector细胞、HCCLM3-shSPECC1L细胞和HCCLM3-shcontrol 细胞增殖形成集落的能力图；图4F为采用MTT法测定HepG2-SPECC1L、HepG2-vector 细胞、HCCLM3-shSPECC1L细胞和HCCLM3-shcontrol细胞增殖能力并绘制生长曲线图；

图5是本发明优选实施例的SPECC1L促进肝癌细胞的迁移与侵袭图，图5A是采用Wound healing实验检测HepG2-SPECC1L、HepG2-vector细胞、HCCLM3-shSPECC1L细胞 和HCCLM3-shcontrol细胞的迁移能力图；图5B为采用Transwell试验检测HepG2-SPECC1L 和HepG2-vector细胞、HCCLM3-shSPECC1L细胞和HCCLM3-shcontrol细胞的侵袭能力 图；图5C为对HepG2-SPECC1L、HepG2-vector细胞、HCCLM3-shSPECC1L细胞和 HCCLM3-shcontrol细胞的细胞骨架肌动蛋白(F-Actin)进行免疫荧光染色的细胞形态的图；

图6是本发明优选实施例的SPECC1L在体内可显著促进肝癌细胞的增殖与转移图；图6A为HepG2-SPECC1L、HepG2-vector细胞、HCCLM3-shSPECC1L细胞和 HCCLM3-shcontrol细胞四组裸鼠皮下成瘤情况图；图6B为HepG2-SPECC1L、HepG2-vector 细胞、HCCLM3-shSPECC1L细胞和HCCLM3-shcontrol细胞原位肿瘤生长情况图；图6C 为4周后IVIS检测HepG2-SPECC1L、HepG2-vector细胞、HCCLM3-shSPECC1L细胞和 HCCLM3-shcontrol细胞四组裸鼠4周后原位肿瘤生长及转移情况图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆 盖的多种不同方式实施。

本发明中采用试剂及相关机构的缩写词中英文如下：

缩写词中英文对

缩略语 英文全称 中文全称

AFP Alpha-fetoprotein 甲胎蛋白

ANLT Adjacent nontumorous liver tissue 邻近非肿瘤肝组织

BCLC Barcelona Clinic Liver Cancer staging system 巴塞罗那分期

BCA Bicinchoninic acid 二喹啉甲酸

BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白

cDNA Complementary DNA 互补DNA

Ct Cycle threshold 循环阈值

DAB Diaminobenzidine 二氨基联苯胺

DAPI 4′，6-diamidino-2-phenylindole 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚

DFS Disease-free survival 无瘤生存率

DMEM Dulbecco′s modified Eagle′s medium DMEM 培养基

DMSO Dimathyl sulfoxide 二甲基亚砜

EP Eppendorf tubes 离心管

EMT Epithelial mesenchymal cell transformation 上皮间质转化

FBS Fetal bovine serum 胎牛血清

GAPDH Glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 甘油醛-3-磷酸脱氢酶

HBsAg Hepatitis B surface antigen 乙肝表面抗原

HE Hematoxylin-eosin staining 苏木精-伊红染色法

HR Hazard ratio 危险比

HRP Horse radish peroxidase 辣根过氧化物酶

HCC Hepatocellular carcinoma 肝细胞癌

MOI Multiplicity of infection 感染复数

MVI Microvascular invasion 微血管侵犯

mRNA Messenger RNA 信使RNA

NA. Not adopted 未采纳

NS. No significant 无意义

OS Overall survival 总体生存率

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳

PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液

PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应

TNM Union for international cancer control TNM分期

UICC Tumour node metastasis classification 国际抗癌联盟

本发明的优选实施例提供了一种SPECC1L基因在治疗肝癌和/或抑制肝癌术后癌细胞 增殖与侵袭转移的药物中的应用。

SPECC1L(Sperm antigen with calponin homology and coiled-coil domains1-like)基因位 于22号染色体短臂11区23带，包括19个外显子，其蛋白有1117个氨基酸约126KDa， 是一种新发现的细胞骨架“横连”蛋白，具有3个螺旋卷曲结构域和一个钙调蛋白结构域， 可以同时与细胞骨架微管蛋白和肌动蛋白微丝相互作用，具有稳定细胞微管蛋白、参与纺 锤体形和促进肌动蛋白微丝重组的功能，对细胞粘附和细胞迁移运动发挥调控作用。

本发明中采用real-time PCR、western-blot检测肝癌细胞系和32例新鲜冰冻肝癌组织 (HCC)及匹配的邻近非肿瘤肝组织(adjacent non-tumorous tissue，ANLT)中SPECC1L 基因的表达水平。采用免疫组化(IHC)检验收集的两个病例队列中所有病例切片中 SPECC1L表达，利用Spearman相关性分析、Kaplan-meier生存分析、Log-rank检验和 Cox单、多因素分析等统计方法分析HCC组织中SPECC1L蛋白水平与病人的临床病理特 征及长期预后的关系。采用慢病毒质粒转染肝癌细胞系，在肝癌细胞系HepG2中进行过表 达SPECC1L，在HCCLM3细胞中敲除SPECC1L表达，并用细胞集落形成实验、划痕愈 合实验、细胞骨架荧光染色实验进行体外验证，用裸鼠进行皮下成瘤实验、肝原位成瘤实 验和活体动物荧光成像实验在体内验证SPECC1L在肝细胞癌中的生物学功能。

本发明通过上述多种实验发现在肝癌细胞系和肝细胞癌组织中SPECC1L呈高表达， 且其高表达与肝细胞癌病人不良的临床病理特征以及术后总体生存、无瘤生存密切相关； 同时发现SPECC1L在肝细胞癌组织中高表达是影响肝癌长期生存预后的一个独立危险因 素；SPECC1L能够促进肝癌细胞的增殖侵袭转移。因此本发明将SPECC1L基因应用于制备治疗肝癌和/或抑制肝癌术后癌细胞增殖与侵袭转移的药物中。

具体实验如下：

1.材料与方法

1.1临床组织标本、临床病理及随访资料

1.1.1临床组织标本

收集在中南大学湘雅医院和湖南省肿瘤医院施行肝脏手术切除的肝癌组织标本及其相 邻的非肿瘤肝组织(ANLT)。全部纳入training corhot以及Validation corhot的HCC病人均 经病理组织学检查确诊，且术前均未接受过包括TACE在内的其他治疗。收集HCC病人的 临床病例资料和组织标本建立临床随访数据库和组织标本库。收集组织标本时，注意在无 菌条件下将切除的肝脏肿瘤组织和匹配的ANLT(距离肿瘤边缘大于1cm)于30分钟内切 取一部分置于无菌离心管(Axygen，Union city，CA)中，并将离心管装入有液氮的保温 瓶中，随后转入-80℃冰箱中(Thermo Scientific，，Waltham，，MA)保存备用。将另一部分组 织标本用5％甲醛溶液固定后先经梯度溶液乙醇(50％-70％-90％-95％-100％)中脱水、二甲 苯透明后，再将标本移入包埋器中并用液态石蜡浸透。将凝固的石蜡块切成1cm3的小方 块。用切片机(Leica RM 2125RT，Leica，Solms，Germany)将石蜡包块做连续切片，切 成5μm的切片用于HE染色和免疫组化等下一步检测。所有标本经两位有经验的病理组织学医师确诊为肝细胞癌后方纳入标本库。

本发明的病例标本随机选取自2004年1月至2010年12月在湘雅医院经手术治疗的新 鲜HCC及匹配的ANLT标本32例、肝血管瘤瘤旁肝组织1例作为正常肝组织对照、从2004年1月至2010年12月期间在湘雅医院行手术治疗的HCC病人的HCC组织及其匹配的 ANLT石蜡标本中随机选取的130例作为training cohort以及随机选取120例来自同时期湖 南省肿瘤医院的HCC组织及匹配的ANLT石蜡标本作为validation cohort。

1.1.2临床病理学资料及随访资料

本研究共纳入多个观察变量进行统计学分析，包含Gender、Age(以60岁为分界)、术 前AFP(以20ug/L为正常上限)、HBsAg(阴性/阳性)、肝硬化(术后病理检查)、肿瘤大小、肿块数目和有无包膜(CT、MRI或术后标本解剖观察)、大体血管侵犯(指CT或MRI检 察发现或肉眼可见的肿瘤侵犯血管，包括门静脉和肝静脉分支)、微血管侵犯(指镜下观察 到肿快周围的门静脉、肝静脉和肿瘤的包膜血管内存在癌细胞团，细胞数目≥50个)、肿 瘤Edmondson-Steiner分级、肝功能Child-Pugh分级、TNM分期、BCLC分期。

所有的HCC病人术后前3年内每3个月随访，之后每6个月随访，截至2016年12 月31日。通过门诊复查、电话或上门的方式进行随访。随访内容包括肝功能检查、AFP水 平、胸片和腹部超声检查，对于怀疑复发的病例进一步行CT或MRI检查。总体生存时间 (Overallsurvival，OS)指手术日期到死亡日期的时间，无瘤生存时间(Disease free survival，DFS)为手术日期到首次临床诊短段为肿瘤复发或转移日期的时间。

1.2Real-time PCR

1.2.1组织标本及细胞总RNA的提取

组织RNA的提取：剪取约100mg冻存标本放入经高温高压消毒后的研钵内，加液氮，研磨成粉后加入1ml的Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将匀浆标本转移到1.5ml的无菌EP管(Invitrogen，Carlsbad，CA)中用涡旋器涡旋成匀浆后在37℃放置5分钟。再 加入200ul的氯仿涡旋15秒后37℃静置2min，然后4℃离心12，000×g，15min。取无色 水相移至另一无菌的EP管，加入500ul异丙醇，7℃静置15min后再次4℃条件下离心 12,000×g，15min。去除上清液，加1ml75％酒精混匀，4℃离心7，500×g，10min。去上 清，置无风环境中5-10min，干燥RNA沉淀，干燥过程中注意不能将RNA沉淀完全干燥。 干燥后用无RNA酶水50μl溶解，55-60℃静置10min。

细胞RNA的提取：将细胞用胰蛋白酶消化下来后用PBS洗涤3次后转于EP管中，加入500μlTrizol(Invitrogen)，之后同组织RNA提取过程。

1.2.2提取总RNA的纯度与浓度检测

在无菌EP中加入2μlRNA提取液和98μl无RNA酶水混匀。用100ul无RNA酶水作 为空白对照，调节光度计测定零点后，测定每个样本的260nm与280nm处的OD值。计 算OD 260/280比值。RNA浓度计算公式：RNA浓度(μg/ml)＝OD 260×稀释倍数(50) ×40。检测时OD260/280在1.8～2.0则认为RNA纯度很高。

1.2.3合成cDNA.

利用逆转录试剂盒(东洋纺FSK-100TYOBO，Osaka，JaPan)合成cDNA。主要操作 步骤：在PCR管中加入Oligo(dT)20 1μl、小于1μg的总RNA和无RNA酶水至12μl，在 PCR仪(Biometra，Goettingen，Germany)中65℃加热5min使RNA热变性后立降温至0度。 然后加入2μl dNTP Mixture、4μ15×RT Buffer、1μl ReverTra Ace、1μl RNase Inhibitor配成 20μl反应体系，再根据30℃×10min、42℃×20min、99℃×5min、4℃×5min反应条 件在PCR仪上进行逆转录。逆转录完后取出瞬时离心，无酶水稀释10倍后放在-20℃储存。

1.2.4Real-time PCR实验

SPECC1L正向引物序列为：5’-TGGAGGATCAAAGAGGAACGC-3’，SPECC1L 反向引物序列为：5’-TATGTATGCAGGAGGGCACAG-3’，产物大小为133bp。GAPDH 正向引物序列为：5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’，GAPDH反向引物序列为： 5’-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’，产物的大小是532bP。引物由生工公司(上海， 中国)设计并构建，经NCBIPrimer-BLAST验证。按说明书用无酶水稀释引物后存储于-20℃ 冰箱。

Real-time PCR实验试剂盒购自罗氏公司Fast Start Universal SYBR GreenMaster(ROX) 试剂盒(Roche，Frankfurt，Germany)。首先向反应管(Axygen，Union city，CA)中依次 加入25μl Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)，19μl无RNA酶水，0.5μl正向引 物(10μM)，0.5μl反向引物(10μM)，5μl cDNA模板混匀配成50μl的体系。此过程在 冰上操作。封闭反应板，然后按罗氏试剂盒所提供的说明书设置反应步骤：95℃、3min， 1个循环；95℃、15sec，60℃、60sec，40个循环；65℃、20sec，95℃，20sec，1个循环(ABI 7300实时PCR反应系统(APPlied Biosysterm，Foster City，CA))。反应结束后从电脑系统中导出各样本的Ct值，并对结果行统计学分析。每个样本均重复检测3次，取其均值。

1.3蛋白质免疫印迹实验(western-blot)

1.3.1组织蛋白提取

所有蛋白提取操作步骤均在冰上进行。剪取约150mg冻存组织置入经高温消毒的研钵 中并剪碎。倒入液氮后，快速将组织磨成粉末状然后转到1.5ml EP管(Invitrogen，Carlsbad， CA)中。加1000ul的RIPA裂解液(每100ulRIPA中含1ul Protease inhibitor，1∶100)后 涡旋混匀，隔5min涡旋一次，每次15sec，共6次。4℃离心两次，每次取上清，14000rpm ×15min。分装标记并放入-80℃冰箱保存备用。

1.3.2细胞蛋白提取

所有蛋白提取步骤均在冰上操作。取培养瓶细胞，倒掉培基，加PBS液，冲洗2遍后吸尽PBS液。加入500μl的RIPA裂解液(每100ulRIPA中混有1ul Protease inhibitor，比 例1∶100)后用刮匙刮取细胞，移至1.5ml EP管中。每5min涡旋15sec，共6次，涡旋混 匀后4℃离心2次，每次保留上清，14000rpm×15min。分装标记保存于-80℃冰箱。

1.3.3蛋白浓度测定

采用BCA Protein Assay Kit试剂盒(Thermo Scientific，Waltham，MA)测定 蛋白浓度。起初向30mg BSA标品中加1000ul蛋白标品配制液，充分混匀后配成标准母液。 配制后可立即稀释使用，也可以-20℃长期保存。然后取母液配成2mg/ml。BSA标准品体系配制可参考下表。

按所需的量(总BCA工作液体积＝(标准品+待测样品)×重复数×每个样品所需要的 BCA工作液)，配制BCA工作液：50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂 B(A∶B＝50∶1)，充分混匀。按照比色皿检测方法(样品∶BCA工作液＝1∶20)每管各取0.1ml 标准品、待测样品和2.0ml BCA工作液，37℃孵30min。自然冷却后检测吸光度(波长 562nm)。在10分钟内对所有样品读数。然后以BSA标准品的值，绘制标准曲线。并按照 标准曲线和稀释倍数计算样品浓度。

1.3.4SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和western-blot实验

首先将提取的蛋白用5×Lodding Buffer按4∶1的比例混匀后在100℃水中煮10分钟， 温度降至室温后4℃离心14000g×10min。随后按照双蒸水4ml，30％Acr-Bis 3.3ml，1.5M Tris(PH8.8)2.5ml，10％过硫酸铵100μl，10％SDS 100μl和TEMED4μl配制10％的聚丙烯酰胺分离胶。凝集后再按双蒸水2.1ml，30％Acr-Bis 500μl，10％SDS 30μl，1.5M Tris(PH8.8)380μl，10％过硫酸铵30μl和TEMED 3μl配制5％的浓缩胶，倒入玻璃板后插 入齿梳。待凝胶凝固，将其固定在槽中，移除齿梳后每个槽隔中加5μl待测样品和Marker(Thermo，Waltham，California)。80V电压下电泳约30分钟(Mini ProteanTetra Systerm，BIO-RAD，Hercules，California)至Marker分离后再调至120V电压继续电泳。当Marker 指示目标蛋白分离后停止电泳。准备好聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(经甲醇浸泡2分钟)和 滤纸，将电泳好的凝胶以海绵-滤纸-(PVDF)膜-凝胶-滤纸-海绵的次序转移到转膜夹板上。 注意正负极，以200mA转膜3h(电泳仪(六一电子厂，北京，中国))。转膜完后用PBS 液将PVDF膜洗涤2min×2次。再用5％的脱脂牛奶完全浸没轻摇1h。取出PVDF膜，经 PBS-T溶液(1L PBS液中加入1ml的Tween-20)洗涤5min×3次后完全浸泡入用一抗稀 释液(LEAGENE，北京，中国)稀释的一抗中，4℃孵育过夜。第二日取出PVDF膜，常 温孵30min后用PBS-T溶液洗3次，每次5min。室温下孵育二抗40min后PBS-T溶液洗 涤10min×3次。将显影剂BrightTM ECL-sParyWestern bloting detection system (ADBANSTA，Menlo Park，CA)A和B两种试剂按1∶1混匀，PVDF膜摆放在保鲜膜上 并滴加显影剂，1min后去掉显影剂，夹好移入X-光片夹中。准备好显影液和定影液；暗 室里，在红灯下将X-光片(比膜的长、宽均大1厘米)放在膜上，注意不要移动。关上 X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱调整曝光时间以达最佳效果。曝光后，将X-光片快 速拿出放在显影液中，当出现明显条带后立刻转入定影液中至胶片透明为止；然后用水轻 洗后自然晾干。晾干后将胶片进行扫描或拍照(Bio-Rad MolecularImager Gel DocTM XR+ Imaging System凝胶成像系统(BIO-RAD，CA，USA))并分析目标带的分子量和净光密 度值。所有蛋白样本和试验重复三次，取其均值。

本实验所用的抗体为：兔抗人SPECC1L蛋白(117kDa)多克隆抗体(北京乐博生物，北京，中国)、鼠抗人β-Actin蛋白(43kDa)单克隆抗体(Sigma，Los Angeles，CA)、HRP 标记的ft羊抗兔IgG抗体(Santa Cruz，CA，USA)；ft羊抗小鼠、ft羊抗兔IgG抗体(中杉 金桥，北京，中国)等。

1.4免疫组织化学实验

采用二步法免疫组化检测系统(中杉金桥，北京，中国)。免疫染色步骤：1、脱蜡、水化处理组织切片：将切片经65℃烤片60min后立即放入100％的二甲苯中10分钟×2次，然后在梯度浓度的酒精中浸泡(100％×10min，95％×3min，70％×3min，50％×3 min)，再用自来水冲洗5min。2、切片组织预处理(抗原修复)：配制1L柠檬酸修复液(18ml 柠檬酸修复液A液、82ml B液、双蒸水900ml)在微波炉中煮至沸腾，然后正面朝上放入 其中，继续煮沸10min×2次；待自然冷却后用新配PBS浸泡5min×2次。3、阻断内源 性HRP酶：蒸馏水中过一下后滴3％H₂O₂后孵30min，再经蒸馏水、PBS浸泡，各5min。 4、血清封闭：滴加60μl 5％BSA封闭液后37℃孵育30min。5、滴加一抗：滴加稀释(依 抗体说明书中推荐浓度)的一抗，37℃孵半小时，后再置于4℃冰箱过夜。6、孵育二抗： 第二天，取出在37℃下复温半小时，经PBS泡2分钟×3次后滴检测试剂1，37℃孵半小 时；PBS泡2min×3次，滴检测试剂2，37℃孵半小时。PBS冲洗2min×3次。7、DAB 溶液显色：首先配置显色剂，用移液枪在1.5ml无菌EP管中(EP管用锡箔纸包好避光) 加入1ml DAB底物液，再滴一滴约50μl的DAB溶液，移液枪混匀。配好的显色剂最好 30min内使用。滴显色剂后镜下观测。把握显色程度，以显现阳性显色而背景没有非特异 显色尚为宜。染色完成后，自来水充分冲洗5min。8、苏木素复染；滴苏木素复染约10sec， 水洗10min。9、返蓝、脱水、透明：复染过色用反蓝液反蓝后水洗5min；然后脱水、透 明(50％酒精3min；70％酒精3min；95％酒精3min；无水酒精3min；100％二甲苯5min)。 10、封片：滴中性树脂后盖盖玻片。11、镜下阅片：使用于LEICADM5000B显微镜(Leica， Solms，Germany)进行观察并照相。免疫反应强度采用积分法来评定：免疫反应积分(IRS) ＝强度(SI)×百分比(PP)。(SI评分标准：阴性为0，弱阳性为1，中等阳性为；2，强阳 性为3；PP评分标准：低于5％平为0，5％-25％之间为1，25％-50％之间为2，51％-75％之间 为3，超过75％为4；以IRS不超过2为低表达，3-12之间为高表达)。

1.5细胞培养及构建SPECC1L过表达和敲除质粒的慢病毒转染肝癌细胞株

1.5.1细胞系来源

本研究中采用了L02，Huh7，HepG2，SMMC7721，PLC/PRF5，Hep3B，MHCC97H，MHCC97L，HCCLM3细胞系。L02、Huh7，SMMC7721来自中科院上海生科院细胞资源中 心(httP：//www.cellbank.org.cn/)，MHCC97L，MHCC97H，HCCLM3上海复旦大学肝癌研 究所惠赠；HepG2，PLC/PRF5，Hep3B来自美国ATCC细胞库(http：//www.atcc.org/)。

1.5.2细胞复苏与冻存

开启水浴箱预热水温到37℃，酒精消毒离心机和生物安全工作台(AIRTECH，苏州，中国)并开启紫外线照射30min。拿出冻存细胞，浸入水浴箱中使其融化。再在安全工作 台用无菌吸管将细胞移到离心管并加10倍以上培养液，摇匀后离心5分钟×1000rpm。去 上清液，加1ml含10％FBS的完全培养液，吹散后用吸管转到瓶中，再加10ml含10％ 牛血清的DMEM高糖完全培养液，37℃、5％CO2培养箱(Thermo Forma，Marietta，Ohio) 静置培养。第二天去除培养液再加入新的接着培养。

在生物安全工作台，取扩增期的细胞，倒掉培基，PBS冲洗1遍，加1000ul 0.25％Trypsin 并放入37℃培养箱中约1min，待细胞脱落下来后加2ml培基中和。吸管弄散细胞后离心，800rpm×5min。倒掉培养液，加3ml冻存液(凯基，南京，中国)，重新弄散细胞后分装到冻存管，每管1000～1500ull，做好标记后冻存(程序降温盒)。

1.5.3细胞传代

取对数生长、密度达到80％以上的细胞进行传代。在生物安全工作台上，把细胞用PBS 洗一遍后加入1ml 0.25％Trypsin消化。待镜下看到细胞回缩并脱落后，立即加养基中和并 弄散细胞。用移液管按1∶3分装入新的培养瓶中，加培基继续培养。

1.5.4慢病毒转染

本研究所用过表达与敲除慢病毒均由山东维真生物科技有限公司(山东，中国)包装 构建。慢病毒转染预实验：主要操作步骤如下：1、细胞的准备。准备96孔板，接种细胞 培养贴壁过夜。2、病毒的稀释。用培养液做10-1～10-7稀释。3、感染目的细胞。用病毒 稀释液更换96孔板中的培养液，保留空白孔。4、观察荧光荧光显微镜下观察细胞荧光。

慢病毒转染目的细胞试验：1、细胞的准备。准备24孔板，接种细胞(数目依据预实验结果)。2、病毒的准备。按照预实验结果，稀释病毒原液。3、感染目的细胞。加入病毒 液，培养过夜。4.更换培养液。根据情况及时更换培养液。5、感染效率检测定时观测细 胞荧光。realtime-PCR和western-blot验证SPECC1L过表达和敲除情况。

实验选取SPECC1L内源性低表达的HepG2细胞和SPECC1L内源性高表达的 HCCLM3细胞进行研究。细胞复苏、传代和冻存按细胞培养说明常规进行。SPECC1L内 源性低表达的HepG2细胞拟进行SPECC1L全长质粒慢病毒转染构建HepG2过表达 SPECC1L细胞和相应的HepG2对照组细胞；SPECC1L内源性高表达的HCCLM3细胞拟 进行SPECC1L的敲除质粒慢病毒转染构建HCCLM3敲除SPECC1L细胞和相应的 HCCLM3对照组细胞。

慢病毒过表达质粒载体：pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro，过表达的基因序列号 为：NM_001145468。

慢病毒敲除质粒载体：pLent-U6-GFP-Puro，采用上述方法共构建HCCLM3-shSPECC1L 序列4条：

shRNA1：GATCCGCGAGGCCGGGTATACAATTATTCAAGAGATAATTGTATACCCGGCCTCGCTTTTTTA为所附序列表中SEQ ID NO.1所示的基因序列。

shRNA2：GATCCGGAATGGGACTGAGTAGAAGGTTCAAGAGACCTTCTACTCAGTCCCATTCCTTTTTTA为所附序列表中SEQ ID NO.2所示的基因序列。

shRNA3：GATCCGCCAGAGAATATGGAGGATCATTCAAGAGATGATCCTCCATATTCTCTGGCTTTTTTA为所附序列表中SEQ ID NO.3所示的基因序列。

shRNA4：GATCCGCAGAACGTGATGCTGTATGTTTCAAGAGAACATACAGCATCACGTTCTGCTTTTTTA为所附序列表中SEQ ID NO.4所示的基因序列。

通过后续实验发现，上述4条序列的SPECC1L基因对于肝癌均具有较优的治疗效果和术后预防复发或转移效果，其中，HCCLM3shSPECC1L4中SPECC1L mRNA和蛋白的 表达水平最低。

1.6体外功能试验

1.6.1划痕愈合试验

取扩增期细胞，均匀铺到6孔板，细胞贴满板底后，枪头划痕。冲洗三遍后加入无血清培养基，拍照记录。连续培养并拍照。收集图片分析实验结果。细胞的愈合率计算公式：细胞愈合率＝(起始宽度-截止宽度)/起始宽度。

1.6.2Transwell试验

Transwell板(Corning Costar CorP，Corning，NY)、matrigel胶(BDBiosciences，Franklin Lakes，NJ)、TiP头、EP管等在4℃冰箱中预冷24h。在生物安全工作台上将transwell小室 的聚碳酸酯膜用20μl 1∶4稀释后的Matrigel浸湿后水平放置培养箱中24小时使其凝集。 取对数生长细胞，弃培基、PBS冲洗后加胰蛋白酶，把细胞从培养瓶上消化下来，用PBS 洗2遍后再用无血清培基重悬细胞。调整细胞密度至1×106/ml。向Transwell小室加0.1ml 细胞，下室加0.5ml完全培基。继续培养。24h后将小室用PBS冲洗2次，棉签去除上室 基质胶和细胞。放入0.1％结晶紫中(碧云天)20min。然后用双蒸水泡洗数次，在擦拭内 侧后自然风干。镜下多个高倍视野进行观测并照相。每组细胞重复检测3次取其均值。

1.6.3MTT试验

取生长其细胞经消化后用培基配成悬液，准备96孔培养板，加200ul细胞(约103-104)， 每组细胞6个孔。将96孔板移入培养箱中。每孔加20ul MTT溶液(4mg/ml)，放入培养箱中4h后吸除孔内液体。再加入0.2ml DMSO，摇晃10min，使其完全溶解。在EX900 型全自动酶标仪(Bio-Tek，Burlington，Vermont)上测定光吸收值(波长490nm)，记录并绘 制曲线。

1.6.4集落形成试验

取扩增期细胞，经消化弄散后，用培基稀释到103个/ml。然后每皿接种500个，再加2ml完全培基。晃动培养皿均匀分布细胞。持续培养2周，根据情况替换培基。当皿中长 出可见集落时，去除培基，PBS液轻洗2次，甲醇侵泡15min后结晶紫显色10min，用水 轻洗数次，自然干燥。用相机(Nikon，东京，日本)拍照并计录直径大于40μm的集落数 目。

1.6.5细胞骨架试验

将盖玻片用75％酒精浸泡24h后用无菌PBS溶液洗净，铺在6孔板中。取扩增期细胞， 经消化弄散后，每孔5×104个均匀铺在孔里玻片上，再加入2ml完全培基，接着培养12h。 吸去培基，PBS轻洗盖玻片3次，每次30sec；然后2％的甲醛/PBS液固定细胞3min；再用0.5％的三硝基甲苯/PBS处理3次×10min后PBS漂洗3次；再用5μg/ml鬼笔环肽 (Sigma)暗室里显色30min。再用PBS轻洗3次；DAPI复染10sec后PBS液再次轻洗 细胞3次。用60％甘油+荧光防淬剂封片；荧光显微镜DMI4000B(Leica，Berlin，Germany) 下观察并拍照保存。

1.7体内试验

所用细胞和动物：稳定表达荧光素的HCCLM3和HepG2细胞(上海科远迪生物科技有限公司，上海，中国)，BALB/c-nu/nu裸鼠(湖南斯莱克景达，长沙，中国)。全部试验 均在中南大学动物学部的SPF级无菌实验室完成。所有动物试验经伦理审批，符合《实验 动物管理条例》的相关规定。

1.7.1裸鼠皮下成瘤试验

取扩增期的细胞，消化后用预冷的PBS洗两遍，再用PBS制成悬浮液(约5×107/ml)。 取5-6周龄裸鼠酒精擦拭右前腋窝。吹散细胞后，注射器皮下接种0.2ml。每周测量和记录 皮下瘤的长、短径2次。约4周后(肿瘤不要超过1000mm³)处死裸鼠取皮下瘤并拍照。皮下瘤体积计算公式：体积(cm³)＝最长径×最短径2/2。

1.7.2裸鼠原位成瘤及IVIS试验

待皮下瘤长到花生粒大小时取出置于无菌生理盐水中，取无坏死肿瘤组织剪成1mm3 小块。腹腔注射麻醉后(5％戊巴比妥钠)，腹部经75％酒精消毒后在上腹部靠左做一个横 切口，显露肝脏。将切成1mm的肿瘤组织植入裸鼠肝右叶被膜下，并用明胶海绵压塞止血，缝合关腹。

按说明将荧光素酶(上海科远迪生物科技有限公司，上海，中国)用生理盐水配成15mg/ml的溶液并避光(现用现配)。备5％戊巴比妥。裸鼠成瘤术后，每周检测一次活体 荧光以观测肿瘤生长情况。首先将裸鼠腹部皮肤75％酒精消毒后，用注射器将配好的荧光 素酶溶液20ul注入裸鼠腹腔内，然后用5％戊巴比妥进行腹腔麻醉。麻醉后将裸鼠在IVISLumina II(Xenogen，Hopkinton，MA)暗室内摆好体位进行活体荧光成像测量荧光强度、计算 肿瘤细胞光子数Total flux(×107，P/S)并保存图片。原位成瘤术后第六周，处死裸鼠后 解剖肝脏观测肿瘤大小并拍照。

1.8统计学分析方法

统计分析使用SPSS 19.0软件进行，采用t检验和ANOVA检验比较各组之间的差异；采用Spearman秩相关分析检测SPECC1L表达水平与肝癌患者临床病例特征的相关性。采 取Kaplan-Meier法绘制总体和无病生存曲线；使用Log-rank检验比较生存率。以Cox比 例风险模型分析危险因素，其中单因素有意义才纳入多因素分析。以P＜0.05定为差异具有 统计学意义的界值。

2.实验结果

2.1SPECC1L在肝细胞癌中呈相对高表达

首先利用real-time PCR检测各肝癌细胞系以及随机选取的32对新鲜冰冻的肝癌组织 和匹配ANLT的SPECC1L mRNA表达水平。结果显示：肝癌组织中的SPECC1L mRNA 表达水平显著高于匹配的ANLT的(P＜0.01)；在32例HCC标本中有87.5％(28/32)的癌 组织中SPECC1L mRNA表达水平高于匹配的ANLT，有78.1％(25/32)的癌组织中SPECC1LmRNA表达高于匹配的ANLT 2倍以上(图1A)。各肝癌细胞系的SPECC1LmRNA 水平均高于正常的L02细胞(图1.B)，且在HCCLM3中最高；在HepG2中相对较低，但 仍高于L02。

Western-blot检验各肝癌细胞、1例肝血管瘤旁肝组织以及从32对中随机选取的4对 新鲜冰冻的肝癌组织和匹配的ANLT中的SPECC1L蛋白水平。结果显示：肝癌中SPECC1L蛋白水平同样显著高于匹配的ANLT以及正常对照(P＜0.001，图1.C)；而且肝癌细胞系 中SPECC1L表达水平也显著高于正常L02细胞，其中在HCCLM3、MHCC97-H、Hep3B 细胞中表达较高，而在HepG2、SMMC-7721细胞中的表达相对较低(图1.D)。进一步利 用免疫组化检测training cohort(n＝130)和validation cohort(n＝120)两个队列中石蜡 切片标本中SPECC1L蛋白的表达情况。结果显示：SPECC1L蛋白主要定位于胞浆，肝癌组 织中的SPECC1L水平高于匹配的ANLT及正常对照(图1.E)。

图1 SPECC1LmRNA和蛋白在肝癌细胞系以及肝细胞癌组织中呈高表达。

A.Real-time PCR检测SPECC1L mRNA在32例肝癌组织和匹配的邻近非肿瘤肝组织(ANLT)中的表达情况。计算方法采用的是2^(-Δ ΔCt)。以ANLT中表达水平作为参照， 将其设为1，匹配的癌组织表达水平用比值表示。32对组织中有87.5％(28/32)的癌组织中SPECC1LmRNA表达高于匹配的ANLT，有78.1％(25/32)的癌组织中SPECC1L mRNA 表达高于匹配的ANLT 2倍以上。

B.Real-time PCR检测在肝癌细胞系和正常肝细胞系L02细胞中SPECC1LmRNA的表达情况，以L02中SPECC1L表达水平作为参照，将其设为1，其他细胞中表达水平采用 相对值表示。在肝癌细胞中SPECC1LmRNA表达都高于正常L02细胞，且以HCCLM3细 胞中表达最高，HepG2细胞表达相对较低但仍高于L02细胞。

C.Western-blot检测4对癌组织和ANLT及1对正常肝组织中SPECC1L蛋白表达， 癌中SPECC1L蛋白均高于匹配的ANLT，也高于对照的肝血管瘤旁的正常肝组织。

D.Western-blot检测人肝细胞系L02与8种肝癌细胞系中SPECC1L蛋白表达水平。结 果显示，肝癌细胞系中SPECC1L蛋白表达均高于L02细胞，且以HCCLM3、MHCC97-H、 Hep3B细胞中表达较高，在HepG2、SMMC-7721细胞中的表达相对较低。

E.IHC检测正常癌组织、肝癌及匹配的ANLT中SPECC1L表达的代表性图片，结果 显示SPECC1l蛋白主要定位于细胞质，在肝癌组织(T)中SPECC1L蛋白表达高于匹配的 ANLT以及对照的肝血管瘤旁正常肝组织对照(NL)。

2.2癌组织高表达SPECC1L与差的临床病理特征密切相关

根据实验方法中免疫组织化学染色的评分方法，将SPECC1L的表达分为了四个等级， 即阴性(-)、弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)，进一步将-和+定义为低表达，而 ++和+++定义为高表达。进而将两个队列中所有病例分为SPECC1L高表达组和低表达组 (图3.A)。统计分析training cohort(n＝130)和validation cohort(n＝120)中所有石蜡标本切片的免疫组化结果以及SPECC1L高低表达与患者的临床病理特征。

参照图2，随机选取390例2004年1月至2010年12月在湘雅医院进行手术治疗的肝肿瘤病人，经病理科医师检查排除38例肝内胆管癌与25例肝血管瘤的病人，然后从中随 机选取130例进入training cohort。免疫组化检测SPECC1L蛋白的表达水平。免疫组化评 分结果显示：其中有73例(56.1％)肝癌组织SPECC1L呈高表达，53例(43.9％)低表达。 进行统计分析建立预后模型。同时随机选取358例同一时间段内在湖南省肿瘤医院进行手 术治疗的肝肿瘤患者，排除29例肝内胆管癌与28例肝血管瘤的病例，然后从中随机选取 120例进入validation cohort。同样进行IHC检测SPECC1L蛋白的表达。免疫组化评分结 果其中有77(64.1％)例肝癌组织SPECC1L高表达，43例(35.9％)呈低表达。再进行统 计分析验证预后模型，通过Kaplan-Meier法进行生存分析确定SPECC1L的表达对HCC患 者生存的影响，最后采用Cox比例风险回归模型预测影响患者总体生存和无瘤生存的独立 危险因素。

结果显示：在Training cohort中有73例(56.1％)呈高表达，57例(43.9％)呈低表达。在validation cohort例中有77例(64.1％)呈高表达，43例(35.9％)呈低表达。

为了研究的可靠性，首先对training cohort与validation cohort两个队列中所有临床病 理资料进行可比性分析。结果显示两个队列HCC临床病理特征不具有统计学差异(表1)， 具有可比性可以进行下一步研究。利用Spearman相关性分析training cohort中所有石蜡切 片SPECC1L蛋白水平高低与患者临床病例特征的相关性。结果显示：SPECC1l的表达高 低与肿瘤结节数目(P＝0.027)、有无包膜(P＝0.019)、有无大血管侵犯(P＝0.010)、有无 微血管侵犯(P＝0.015)、Edmondson-Steiner分级(P＝0.049)、TNM分期(P＝0.029)和肝癌亚型(P＝0.009)存在密切相关(表2)。进一步对validation cohort的数据进行分析，结果也显示：SPECC1L的表达高低与肿瘤结节数目(P＝0.042)、有无包膜(P＝0.026)、 有无大血管侵犯(P＝0.046)和微血管侵犯(P＝0.043)、Edmondson-Steiner分级(P＝0.030)、BCLC分期(P＝0.005)、TNM分期(P＝0.022)肝癌亚型(P＝0.026)显著相关(表3)。 基于上述分析，两个队列统计分析结果都显示SPECC1L的表达水平与肝细胞癌差的临床 病理特征密切相关。这明显提示高表达SPECC1L有可能预示肝癌术后差的生存结局，而 且SPECC1L基因可能与肝细胞癌的发生发展密切相关。

表1.训练队列和验证队列的临床病理特征比较

表2.训练队列中SPECC1L的表达与肝细胞癌临床病理特征相关性分析

表3.验证队列中SPECC1L的表达与肝细胞癌临床病理特征相关性分析

2.3高表达SPECC1l预示肝癌患者差的术后生存结局

参照图3.A.IHC检测training cohort与validationcohort石蜡标本中肝癌组织中SPECC1L 的表达情况，并按照免疫反应积分法标准将所有标本分为高表达组和低表达组。免疫反应积 分法标准可参照文献Wang Y，Bu F，Royer C，et al.ASPP2 controlsepithelial plasticity and inhibits metastasis through β-catenin-dependentregulation of ZEB1[J].Nature Cell Biology， 2014，16(11)：1092-1104.和文献Lei X，Li Y F，Chen G D，et al.Ackl overexpression promotes metastasis and indicatespoor prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget， 2015，6(38)：40622-40641.的方法进行。免疫反应积分(IRS)＝染色强度(SI)×阳性细胞百 分比(PP)。(SI评分标准：阴性为0，弱阳性为1，中等阳性为2，强阳性为3；PP评分标准： 低于5％评为0，5％-25％之间为1，25％-50％之间为2，51％-75％之间为3，超过75％为4；以IRS 不超过2为低表达，3-12之间为高表达)。图3.B.通过Kaplan-Meier方法分析training cohort 中SPECC1L高表达组(73例)与SPECC1L低表达组(57例)总体生存时间的差异。结果 显示：高SPECC1L组HCC病人术后总体生存率明显低于低SPECC1L组(1，3，5年总体 生存率69.5％，37.2％，22.5％vs.93.0％，71.7％，48.4％，P＜0.001)。图3.C.Kaplan-Meier方 法分析trainingcohort中SPECC1L高表达组(73例)与SPECC1L低表达组(57例)无瘤生 存时间的差异。结果显示：SPECC1L高表达组HCC病人的无瘤生存时间也明显低于低表达 组(1、3、5年无瘤生存时间69.5％，37.2％，22.5％vs.93.0％，71.7％，48.4％，P＜0.001)。D.采 用Kaplan-Meier方法分析validation cohort SPECC1L高表达组(77例)与SPECC1L低表达 组(43例)总体生存时间的差异，结果显示：SPECC1L高表达组HCC病人术后总体生存率 也显著低于SPECC1L低表达组(1，3，5年总体生存率：76.6％，35.5％，19.1％vs.91.2％，74.4％， 50.2％，P＜0.001)。图3.E.分析Validation cohort中SPECC1L高表达组(77例)与SPECC1L 低表达组(43例)HCC病人术后无瘤生存时间的差异。结果显示：SPECC1L高表达组的无 瘤生存时间也明显低于低表达组1，3，5年无瘤生存率(68.8％，32.8％，13.7％vs.86.0％，69.8％，42.7％，P＜0.001)。

在training cohort中，采用Cox风险比例回归模型进行单、多因素分析HCC病人的临床 病理特征以及SPECC1L的高低表达水平对总体生存和无瘤生存的影响。单因素分析结果显 示：肿块数目(P＜0.001)、有无包膜(P＜0.001)、大血管(P＝0.001)及微血管侵犯(P＜0.001)、 Edmondson-Steiner病理分级(P＝0.004)、Child-Pugh分期(P＝0.005)、TNM分期(P＜0.001) 及BCLC分期(P＜0.001)、SPECC1L表达水平(P＜0.001)是预测影响HCC病人总体生存 的危险因素。多因素分析结果进一步显示：肿瘤结节数目(P＝0.002)、肿瘤包膜(P＝0.001)、 大血管侵犯(P＝0.038)、微血管侵犯(P＝0.007)、TNM分期(P＝0.013)、BCLC分期(P＝0.002) 以及SPECC1L的表达水平(P＝0.003)是预测影响HCC术后总体生存的独立危险因素(表4)。 单因素分析结果显示：肿瘤结节数目(P＜0.001)、肿瘤包膜(P＜0.001)、有无大血管侵犯 (P＝0.001)及微血管侵犯(P＜0.001)、Edmondson-Steiner病理分级(P＝0.004)、Child-Pugh 肝功能分级(P＝0.005)、TNM分期(P＜0.001)及BCLC分期(P＜0.001)、SPECC1L的表 达水平(P＜0.001)是预测影响HCC病人术后无瘤生存的危险因素。多因素分析则显示肿块 数目(P＝0.002)、有无包膜(P＝0.001)、有无大血管侵犯(P＝0.044)及微血管侵犯(P＝0.010)、 TNM分期(P＝0.014)及BCLC分期(P＝0.003)、SPECC1L的表达水平(P＝0.002)被认为是 预测影响HCC病人术后无瘤生存的独立危险因素(表5)。

表4.单多因素分析训练队列中影响肝细胞癌患者总体生存的危险因素

表5.单多因素分析训练队列中影响肝细胞癌患者无瘤生存的危险因素

表6.单多因素分析验证队列中影响肝细胞癌患者总体生存的危险因素

表7.单多因素分析验证队列中影响肝细胞癌患者无瘤生存的危险因素

同样地，在validation cohort中，单因素分析显示：肿块数目(P＜0.001)、有无包膜(P ＜0.001)、有无大血管(P＜0.001)及微血管侵犯(P＜0.001)、Edmondson-Steiner病理分级 (P＜0.001)、Child-Pugh肝功能分级(P＝0.015)、TNM分期(P＜0.001)及BCLC分期(P ＜0.001)、SPECC1L的表达水平(P＜0.001)是预测影响HCC病人术后总体生存时间的危险 因素。进一步多因素分析结果显示：肿瘤结节数目(P＝0.029)、肿瘤有无包膜(P＝0.003)有 无大血管侵犯(P＝0.003)及微血管侵犯(P＝0.001)、Child-Pugh肝功能分级(P＝0.001)、TNM 分期(P＝0.020)及BCLC分期(P＝0.003)、SPECC1L的表达水平(P＝0.014)是影响影响HCC 病人术后总体生存的独立危险因素(表6)。单因素分析结果显示：肿块数目(P＜0.001)、有 无包膜(P＜0.001)、有无大血管(P＜0.001)及微血管侵犯(P＜0.001)、Edmondson-Steiner 病理分级(P＜0.001)、Child-Pugh肝功能分级(P＝0.014)、TNM分期(P＜0.001)及BCLC 分期(P＜0.001)、SPECC1L的表达水平(P＜0.001)是影响HCC病人术后无瘤生存时间的 独立危险因素。多因素分析结果显示：肿瘤结节数目(P＝0.019)、肿瘤有无包膜(P＝0.003)、 有无大血管侵犯(P＝0.002)及微血管侵犯(P＝0.001)、Child-Pugh肝功能分级(P＝0.001)、 TNM分期(P＝0.021)及BCLC分期(＝0.002)、SPECC1L的表达水平(P＝0.020)是预测影 响HCC病人术后无瘤生存的独立危险因素(表7)。这些结果均表明，SPECC1L高表达预示 肝癌患者术后差的生存结局。

2.4SPECC1L具有促进肝癌细胞在体外增殖的功能

为了研究SPECC1L对肝癌细胞增殖的作用，根据肝癌细胞中SPECC1L的表达情况及侵 袭、增殖能力的特点，选择了HepG2和HCCLM3两个细胞系进行细胞功能学研究。对SPECC1L 相对较高的HCCLM3进行基因敲除，构建敲除SPECC1L表达的细胞HCCLM3-shSPECC1L和 对照HCCLM3-shcontrol；对SPECC1L相对较低的HepG2进行基因过表达，构建SPECC1L 过表达的细胞HepG2-SPECC1L和对照HepG2-vector。利用real-time PCR和western-blot验证 敲除和过表达后细胞SPECC1L表达。

结果显示：HCCLM3-shSPECC1L细胞中SPECC1LmRNA和蛋白的表达水平较对照HCCLM3-shcontrol明显降低(图4.A，图4.C)(P＜0.05)，其中HCCLM3-shSPECC1L4中表 达最低，因此选择该细胞敲除株用于后续研究。HepG2-SPECC1L中SPECC1LmRNA和蛋白 的表达水平较对照HepG2-vector表达明显升高(图4.B，图4.D)(P＜0.05)。敲除和过表达效 率均较高，满足细胞功能研究要求。

继之，采用集落形成试验和MTT实验研究SPECC1L对肝癌细胞系增殖作用的影响。集 落形成试验结果显示：HCCLM3-shSPECC1L细胞的集落形成能力显著低于对照的HCCLM3-shcontrol细胞系(P＜0.01)；HepG2-SPECC1L细胞形成的集落数目显著高于HepG2-vector(P＜0.01，图4.E)。MTT实验结果显示：HCCLM3-shSPECC1L细胞较对照HCCLM3-shcontrol细胞的增殖速度明显减慢(P＜0.01)。而HepG2-SPECClL细胞较 HepG2-vector细胞增殖明显要快(P＜0.01，图4.F)。上述研究结果均证实SPECC1L在体外 具有显著的促进肝癌细胞增殖的功能。

利用敲除和过表达慢病毒转染细胞实验，敲除肝癌细胞系HCCLM3细胞中SPECC1L基 因表达；而对HepG2细胞系进行SPECC1L基因过表达。

2.5SPECC1L在体外能够显著促进肝癌细胞迁移与侵袭

为了了解SPECC1L对肝癌细胞迁移与侵袭能力的影响。进行了划痕愈合实验和transwell 实验。划痕愈合实验结果显示：HCCLM3-shSPECC1L细胞较HCCLM3-shcontrol细胞24h划 痕愈合率明显降低(P＜0.01)。而HepG2-SPECC1L细胞较HepG2-vector细胞24h划痕愈合率 明显增快(P＜0.01，图5.A)。Transwell实验结果显示：在穿过transwell膜到达小室下方的 细胞数量上，HCCLM3-shSPECC1L细胞较HCCLM3-shcontrol细胞明显减少(P＜0.01)， 而HepG2-SPECC1L细胞则较HepG2-vector细胞明显增多(P＜0.01，图5.B)。这些结果均证 实SPECC1L在体外能显著促进肝癌细胞的迁移与侵袭。因此，SPECC1L过表达可促进肝癌 细胞侵袭转移，敲除SPECC1L可抑制肝癌细胞侵袭转移。

进一步利用IHF技术对肝癌细胞中F-actin进行荧光染色，观察SPECC1L对其形态的影 响。结果显示：HCCLM3-shcontrol细胞呈梭行、伸出伪足，细胞骨架F-actin纤维粗大明亮； 而HCCLM-shSPECC1L细胞圆滑，伪足少，F-actin纤维排列紊乱。HepG2-vector细胞呈圆缩， 伪足少，F-actin纤维排列杂乱；而HepG2-SPECC1L细胞形态舒展、有伪足申出，细胞骨 架F-actin纤维粗大明亮(图5.C)。这些结果提示SPECC1L能影响肝细胞癌细胞骨架的改变， 从而促进肝癌细胞的迁移运动，提示SPECC1L在体外具有明显促进肝癌细胞侵袭转移作用。

2.6SPECC1L促进肝癌细胞在体内生长及转移

为了进一步在体内验证SPECC1L对肝癌细胞的作用。我们选用BALB/C-nu/nu裸鼠，利 用稳定表达荧光素酶的HCCLM3-shSPECC1L、HCCLM3-shcontrol细胞以及HepG2-SPECC1L和HepG2-vector细胞分别建立皮下瘤模型；继之再将皮下瘤剪成1mm3大小的瘤块，将其种植于另外四组裸鼠的肝被膜下建立肝原位瘤模型。待裸鼠皮下瘤长到25天后，取出皮下瘤进 行测量并拍照。结果显示：HCCLM3-shSPECC1L细胞所成皮下瘤体积显著小于 HCCLM3-shcontrol细胞所成皮下瘤的体积(P＜0.01)；而HepG2-SPECC1L所成的皮下瘤体 积明显大于HepG2-vector所成皮下瘤体积(P＜0.01，图6A)。采用IVIS定期荧光检测原位移 植瘤模型裸鼠肿瘤生长情况。IVIS监测结果显示：4周后HCCLM3-shSPECC1L细胞所成原位 瘤荧光光子量明显少于HCCLM3-shcontrol细胞所成原位瘤荧光光子量(P＜0.01)，且出现肺 部转移瘤荧光的数目少(图6.C)；HepG2-SPECC1L细胞所成原位瘤荧光光子量明显多于 HepG2-vector细胞所成原位瘤荧光光子量(P＜0.01，图6.C)，并且出现肺部转移瘤荧光的数 目较多(图6.C)。6周后解剖裸鼠，取出肝脏原位瘤进行检测并拍照。结果显示： HCCLM3-shSPECC1L细胞所成的原位瘤体积较HCCLM3-shcontrol细胞所成原为瘤体积明显 要小(P＜0.01)；HepG2-SPECC1L所成原位瘤体积明显大于HepG2-vector所成瘤的体 积(P＜0.01，图6.B)。以上结果表明，在体内SPECC1L能够显著促进肝癌细胞生长及转移。

在本发明中检测了L02和肝癌细胞系、癌组织和匹配ANLT以及正常对照中的SPECC1LmRNA和蛋白水平。结果发现肝癌细胞系中的SPECC1LmRNA和蛋白水平高于正 常L02细胞，并且在侵袭能力较强的肝癌细胞(HCCLM3、Huh7、Hep3B、MHCC97-L、 MHCC97-H)中较侵袭转移能力较弱的肝癌细胞(HepG2、SMMC7721、PLC/PRF5)中表达 更高，在肝癌组织中SPECC1LmRNA和蛋白水平也明显高于匹配的ANLT及正常肝组织。这 提示SPECC1L可能在肝癌发展过程中表达上调并对肝癌细胞的侵袭运动有促进作用。接着 建立training cohort和validation cohort两个队列，利用Spearman相关性分析研究SPECC1L的 表达水平与与患者临床病例特征的相关性。发现其与大血管侵犯和微血管侵犯(MVI)、多个肿 块、肿瘤无包膜、高的Edmondson-Steiner分级、BCLC分期和TNM分期等临床病理特征相 关。而肿瘤细胞侵入微血管和大血管是发生侵袭转移的直接佐证，是影响患者不良生存结局 的重要独立危险因素。多个肿块结节、高的Edmondson-Steiner分级和TNM分期也同样提示 肝癌不良的生物学特性，是预测长期预后的独立危险因素，所以，推测SPECC1L可能是影响 肝癌长期预后的独立危险因素，也同样可以作为一种预测肝癌患者长期生存的预后标志物。 进一步按照REMARK指南进行肿瘤预后标志物研究发现：在training cohort中高SPECC1L 组的总体生存率和无瘤生存率均显著低于低SPECC1L组(1，3，5年总体生存率：69.5％， 37.2％，22.5％vs.93.0％，71.7％，48.4％，P＜0.001；1，3，5年无瘤生存率：69.5％，37.2％，22.5％vs.93.0％，71.7％，48.4％，P＜0.001)。而在validation cohort中得到了同样的结果(1，3，5年总 体生存率：76.6％，35.5％，19.1％vs.91.2％，74.4％，50.2％，P＜0.001；1，3，5年无瘤生存率：68.8％， 32.8％，，13.7％vs.86.0％，69.8％，42.7％，P＜0.001)。这些结果证实HCC高表达SPECC1L能 够预测HCC病人不良的生存预后。Cox单因素和多因素回归模型统计结果也证实HCC高 表达SPECC1L是预测影响肝癌病人不良生存结局的独立危险因素。综合以上结果，SPECC1L 基因在肝细胞癌中上调是预测影响肝癌长期生存的独立危险因素，并且可以作为预测肝癌生 存预后的标志物。这进一步提示SPECC1L可能在肝癌侵袭转移过程中发挥重要作用，从而导 致患者差的生存结局。

为了研究SPECC1L对肝癌侵袭转移的功能，申请人利用慢病毒转染建立基因敲除和过表 达肝癌细胞系，探究敲除和过表达SPECC1L基因后对肝癌细胞增殖和细胞侵袭能力的影响。 根据SPECC1L的表达情况及肝癌细胞系侵袭、增殖能力的特点，申请人选择了HepG2和 HCCLM3两个细胞系进行下一步功能研究。对表达SPECC1L最高的HCCLM3进行基因敲除， 对表达SPECC1L相对较低的HepG2进行基因过表达。并利用细胞集落形成实验、MTT实验、 划痕和transwell实验来验证SPECC1L基因的功能。细胞集落形成实验和MTT实验发现上调 SPECC1L后可以明显促进HepG2的集落形成和细胞增殖，敲除SPECC1L后可显著抑制HCCLM3细胞的集落形成和增殖。划痕和transwell实验发现上调HepG2细胞SPECC1L表达 后可以明显促进HepG2细胞的迁移与侵袭，而敲除HCCLM3细胞SPECC1L表达后可显著抑 制HCCLM3的迁移与侵袭转移。这些说明SPECC1L基因在体外可以促进肝癌细胞的增殖与 侵袭。而利用IHF技术对细胞F-actin进行荧光染色观察SPECC1L对细胞形态的影响时发现HCCLM3细胞呈梭行、伸出伪足，细胞骨架F-actin纤维粗大明亮；但敲除SPECC1L后HCCLM3细胞就变得圆滑，伪足少，F-actin纤维排列紊乱。而HepG2细胞圆缩，伪足少，F-actin纤维排列杂乱；但过表达SPECC1L后HepG2细胞形态变得舒展、有伪足伸出，细胞骨架F-actin 纤维也粗大明亮。说明SPECC1L可以改变细胞形态，这也证实了之前的研究结果，即SPECC1L可以作用于细胞肌动蛋白骨架，调控骨架蛋白重组进而改变细胞形态。另外这种细胞形态的 改变也类似于上皮细胞-间质转化(EMT)过程，而EMT是细胞迁移运动的一种方式，也是肝癌 细胞局部浸润继而向远处转移的重要过程，在肝细胞癌侵袭转移过程中也发挥着重要作用。 在EMT的过程中也涉及了许多细胞粘附分子、细胞骨架的变化。而SPECC1L是否具有调控 EMT功能进而促进肝癌侵袭转移尚有待进一步研究。

为了更好的验证SPECC1L促进肝癌增殖和侵袭转移的能力，申请人用裸鼠进行动物体内 实验来更进一步的验证。通过构建裸鼠皮下瘤和原位瘤模型，发现敲除HCCLM3细胞SPECC1L表达后所成皮下瘤和原位瘤体积显著小于对照细胞所成瘤的体积；而HepG2过表达SPECC1L后所成皮下瘤和原位瘤的体积明显大于对照组所成瘤体积。并在4周后荧光检测原位移植瘤模型裸鼠。结果发现HCCLM3敲除SPECC1L后原位瘤荧光光子量明显少于对照细胞，且出现肺部转移瘤荧光的裸鼠数目少；而HepG2过表达SPECC1L后所成原位瘤荧光光 子量明显多于未敲除组，并且出现肺部转移瘤荧光的裸鼠数目较多。这些实验结果均证实了SPECC1L在体内有着促进肝癌增殖与侵袭转移的功能。

综上所述，申请人证实了SPECC1L基因在肝癌组织中显著上调，并证实了SPECC1L上 调与不良的临床病理特征密切相关，而且肝癌中高SPECC1L表达预示了不良的生存结局，是 影响肝癌患者总体生存和无瘤生存的独立危险因素；也通过干扰SPECC1L基因表达的方法， 用体内、外证实了SPECC1L具有促进肝癌增殖侵袭的功能。这些研究结果进一步拓展了对肝 癌细胞增殖和侵袭转移分子机制的认识，探究了SPECC1L对肝癌的生物学功能。然而 SPECC1L基因调控肿瘤细胞增殖和迁移侵袭的机制仍不是十分清楚，已有研究发现SPECC1L 参与了细胞Integrin信号、P13K-AKT信号及Wnt信号通路的调节，并在这些信号中发挥正调 控。但是SPECC1L在肝癌细胞中是否也参与了这些信号通路的改变，是否通过这些信号通路 发挥促进肝癌侵袭转移，还需要进一步深入探究。

SPECC1L基因在治疗肝癌和/或抑制肝癌术后癌细胞增殖与侵袭转移的药物中的应用，包 括在慢病毒载体中携带SPECC1L基因的敲除质粒的给药方式。

作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种药物组合物，包含用于敲除表达SPECC1L 基因的负载于慢病毒载体的shSPECC1L。该药物组合物的主要作用是通过向癌细胞核给药抑 制由SPECC1L基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式不限于上述给药方式，也可 以为其它能实现输送作用的给药方式。

具体给药方式说明如下：

1、慢病毒敲除SPECC1L质粒载体尾静脉注射给药。

载体为PLent-U6-GFP-Puro，使用最优选的敲除序列为： GATCCGCAGAACGTGATGCTGTATGTTTCAAGAGAACATACAGCATCACGTTCTGCTTT TTTA。shSPECC1L质粒经慢病毒转染后进入宿主细胞，在宿主细胞内经转录翻译，抑制 SPECC1L蛋白的表达，从而在体内发挥作用。该方法在最近如Ambrogio，C.等(Lentiviral-based approach for the validation ofcancer therapeutic targets in vivo.Biotechniques，2014，57(4)：179， 181-187)的研究中被采用静脉注射法进行体内实验，获得了良好的体内治疗效果。慢病毒属于 逆转录病毒科，为RNA病毒，经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。 慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表 达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细 胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达，从而达到良好的基因治疗效果。因慢病毒作用时间长且滴度稳定，裸鼠成瘤一般在1-2个月以内，因此可在成瘤周期的第一周内 仅注射一次即可。

给药方法：裸鼠尾静脉注射方法：1.使用尾静脉注射架将裸鼠固定好，将尾巴拉直，绷紧； 2.用酒精棉球擦拭尾巴，使血管扩张，有利于注射，注射状态为尾巴发白，紧靠白色的尾骨两 侧清晰可见两根红色静脉；3.用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾巴固定；4.注射 时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，一般选择距裸鼠尾尖1/4或1/3处进针，使用1ml胰岛素注射 器注射，进针时针头与桌面平行，针尖稍稍朝下，从中指及无名指与拇指接触处稍上方进针； 5.针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，推注时无阻力则成功。

由上可见，采用上述敲除质粒方法给药时SPECC1L基因序列为序列表中SEQ IDNO.4所 示的基因序列疗效最优。其他序列表中SEQ ID NO.1所示的基因序列、SEQ ID NO.2所示的 基因序列以及SEQ ID NO.3所示的基因序列虽然也对肝癌有疗效，但效果相较SEQID NO.4 基因序列稍微差一些。

作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种药物组合物，包含用于敲除表达SPECC1L 基因的shSPECC1L以及与shSPECC1L相连接的递送载体。该药物组合物的主要作用是通过 向癌细胞核给药抑制由SPECC1L基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式不限于上 述给药方式，也可以为其它能实现输送作用的给药方式。优选地，递送载体为电荷翻转型药 物载体。

2、经电荷翻转型药物载体给药。

阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)和聚L赖氨酸(polylysine，PLL)以及聚 酰胺胺(PAMAM)树枝状大分子等被广泛地用来作为基因载体。实验表明它们能够进入细胞核 内，也能够将生物活性物质输送到细胞核中。然而，这些带正电荷的聚合物会被网状内皮系 统(reticuloendothelialsystem，RES)识别而很快被清除出血液循环系统，因此，理想的方法是对 这些阳离子聚合物进行可逆修饰，使其在血液中带负电荷，以抑制它们与正常细胞和组织的 作用，而到达肿瘤组织或癌细胞内后去掉这些修饰而再生原来的阳离子聚合物，重新获得细 胞核定位的能力。实体瘤组织间液和细胞的溶酶体呈酸性，因此可以应用肿瘤组织和细胞中 的酸性环境作为信号来触发阳离子保护基团的离去。根据癌组织内容易产生代谢性酸中毒导 致肿瘤细胞内PH低于7.4，因此有关利用pH响应的载体输送抗癌药物已有大量的报道。这 些高分子载体能够在细胞间质和溶酶体的酸性pH刺激下将药物释放在细胞间隙或溶酶体中， 但是无法将药物输送至细胞核中。羧基酰胺基团具有在酸性条件下自催化水解的性质。因此 申有青(电荷翻转型药物载体用于肿瘤细胞核靶向药物输送的研究。高分子通 报，2010，(12)：22-29。)等设计了对胺基进行可逆保护，用1，2环己二酸酐与聚己内酯-聚乙烯 亚胺的嵌段共聚物(PCLbPEI)的PEI段反应，将PEI的胺基酰胺化为羧基酰胺，得到带负电荷 的酰胺化PEI(PEI/amide)。

根据这一理论将靶向敲除shSPECC1L治疗进一步引入到PEI/amide上。在正常生理条件 下，双亲性的PCLPEI/amide-shSPECC1L自组装成为带负电的纳米颗粒；在pH小于6时，羧基 酰胺基团自催化水解，重新生成胺基，使得载体带正电荷。而在肿瘤组织、内涵体或溶酶体 中显正电性，使纳米颗粒在细胞内能够成功地实现电荷翻转。根据这一研究得到了得到不同 结构的羧基酰胺化的PLL，使原来阳离子聚合物PLL呈负电性，避免了伯胺基团带来的系统 生物毒性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员 来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等 同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中南大学湘雅医院

<120> SPECC1L在治疗肝癌和/或术后预防肝癌复发的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial seqence)

<400> 1

gatccgcgag gccgggtata caattattca agagataatt gtatacccgg cctcgctttt 60

tta 63

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial seqence)

<400> 2

gatccggaat gggactgagt agaaggttca agagaccttc tactcagtcc cattcctttt 60

tta 63

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial seqence)

<400> 3

gatccgccag agaatatgga ggatcattca agagatgatc ctccatattc tctggctttt 60

tta 63

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial seqence)

<400> 4

gatccgcaga acgtgatgct gtatgtttca agagaacata cagcatcacg ttctgctttt 60

tta 63

Claims (4)

1.SPECC1L基因在制备治疗肝癌和/或抑制肝癌术后癌细胞增殖与侵袭转移的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述应用包括在慢病毒载体中携带所述SPECC1L基因的敲除质粒的给药方式。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，

所述SPECC1L基因的敲除序列为序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的基因序列中的一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，

所述SPECC1L基因的敲除序列为序列表中SEQ ID NO.4所示的基因序列。