CN109251982A - Adgrg6增强子的突变序列、检测方法、所用的特异性引物对和应用 - Google Patents

Adgrg6增强子的突变序列、检测方法、所用的特异性引物对和应用 Download PDF

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Abstract

本发明ADGRG6增强子的突变序列、检测方法、所用的特异性引物对和应用，属于生物技术领域。所述ADGRG6增强子的突变序列为：ADGRG6增强子chr.6：142,706,206位为G﹥A和chr.6：142,706,209位为C﹥T的突变序列。所述突变序列在体外膀胱癌组织样本中高频发生。在含有突变序列的体外膀胱癌组织样本中ADGRG6高表达并且新生血管密度大；特异性siRNA通过干扰ADGRG6的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力和膀胱癌细胞诱导血管内皮成小管的能力。本发明的优点：ADGRG6增强子的突变序列及其特异性引物可用来开发膀胱癌早期筛查与辅助诊断的商品化试剂盒。

Description

ADGRG6增强子的突变序列、检测方法、所用的特异性引物对和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及ADGRG6增强子的突变序列、检测方法、所用的特异性引物对和应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。2004年WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中膀胱癌的病理类型包括膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞状细胞癌、膀胱腺癌，其他罕见的还有膀胱透明细胞癌、膀胱小细胞癌、膀胱类癌。其中最常见的是膀胱尿路上皮癌，约占膀胱癌患者总数的90％以上，通常所说的膀胱癌就是指膀胱尿路上皮癌，既往被称为膀胱移行细胞癌。
大约有90％以上的膀胱癌患者最初的临床表现是血尿，通常表现为无痛性、间歇性、肉眼全程血尿，有时也可为镜下血尿。血尿可能仅出现1次或持续1天至数天，可自行减轻或停止，有时患者服药后与血尿自止的巧合往往给患者“病愈”的错觉。有些患者可能在相隔若干时间后再次出现血尿。血尿的染色由浅红色至深褐色不等，常为暗红色，有患者将其描述为洗肉水样、茶水样。出血量与血尿持续时间的长短，与肿瘤的恶性程度、大小、范围和数目并不一定成正比。有时发生肉眼血尿时，肿瘤已经很大或已属晚期；有时很小的肿瘤却出现大量血尿。有些患者是在健康体检时由B超检查时发现膀胱内有肿瘤。有10％的膀胱癌患者可首先出现膀胱刺激症状，表现为尿频、尿急、尿痛和排尿困难，而患者无明显的肉眼血尿。这多由于肿瘤坏死、溃疡、膀胱内肿瘤较大或数目较多或膀胱肿瘤弥漫浸润膀胱壁，使膀胱容量减少或并发感染所引起。膀胱三角区及膀胱颈部的肿瘤可梗阻膀胱出口，而出现排尿困难的症状。
对于40岁以上出现无痛性肉眼血尿，应考虑到泌尿系肿瘤的可能性，特别是膀胱癌。综合患者既往史、家族史，结合症状和查体做出初步判断，并进一步进行相关检查。检查方法包括尿常规检查、尿脱落细胞学、尿肿瘤标记物、腹部和盆腔B超等检查。根据上述检查结果决定是否行膀胱镜、静脉尿路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等检查明确诊断。其中，膀胱镜检查是诊断膀胱癌的最主要方法。
在我国，膀胱癌发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位，且近年来其发病呈逐年上升和年轻化趋势。膀胱癌多数(>90％)是膀胱上皮癌，这些膀胱癌被进一步分为浅表非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。浸润性膀胱癌病人预后不佳，5年生存率仅为20-40％，其中50％以上的患者会由于发生转移而死亡。降低膀胱癌转移率成为临床上迫切需要解决的重大问题。肿瘤血管生成是肿瘤原发部位或远端转移器官形成新生血管的病理过程，是癌症的典型特征，通过向癌细胞提供足够的营养并帮助肿瘤细胞转移到远端，促进肿瘤生长和进展。因此，靶向肿瘤血管新生是癌症治疗的有效靶点。膀胱癌是高度血管化的癌症，而其分子基础和涉及的信号传导途径还有待研究。阐明膀胱癌病理性血管生成与遗传变异之间关联，揭示其作用机理，有利于现有的抗血管生成药物在膀胱癌治疗中的应用，同时可为膀胱癌抗血管生成治疗提供潜在的新靶点。
膀胱癌是一种分子异质性疾病，其基因组包含有从核苷酸突变到染色体改变等各种形式的体细胞遗传改变。因此筛选和鉴定出与膀胱癌发生发展及转移密切相关的重要基因，并对其作用的分子机制进行深入研究，寻找到新的调控膀胱癌转移的关键分子，是目前进行预测和干预膀胱癌转移诊治、改善预后的关键，也是早期辅助诊断或特异性靶向治疗的理论基础。
发明内容
针对我国目前膀胱癌发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位，并且近年来其发病呈逐年上升和年轻化趋势的问题，我们急需筛选和鉴定出与膀胱癌发生发展及转移密切相关的重要基因。
针对上述问题，本发明通过对65例膀胱癌进行全基因组测序，揭示了ADGRG6的增强子在两个位点上发生了显著高频突变，其在13(chr.6：142,706,206；G>A突变)和4(chr.6：142,706,209；C>T突变)例样品中被检测到。在验证的第三组膀胱癌队列(n＝196)中，提取石蜡包埋的肿瘤组织DNA，通过Sanger测序分析ADGRG6的增强子突变情况，检测到相似的突变发生率和频谱。
本发明的目的在于公开了一种ADGRG6增强子的突变序列。
本发明的第二个目的在于公开了上述突变序列的应用。
本发明的第三个目的在于公开了上述突变序列的检测方法。
本发明的第四个目的在于公开了上述检测方法所用的特异性引物对。
本发明的第五个目的在于公开了上述特异性引物对的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种ADGRG6增强子的突变序列，其中，所述ADGRG6增强子的突变序列为：
ADGRG6增强子chr.6：142,706,206位为G﹥A和chr.6：142,706,209位为C﹥T的突变序列。
上述技术方案所述的突变序列，其中：所述ADGRG6增强子的突变序列在体外膀胱癌组织样本中高频发生。
上述技术方案所述的突变序列，其中：在含有所述ADGRG6增强子的突变序列的体外膀胱癌组织样本中ADGRG6高表达并且新生血管密度大。
上述技术方案所述的突变序列，其中：在体外培养的含有所述ADGRG6增强子的突变序列的膀胱癌细胞系中利用特异性siRNA干扰ADGRG6的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力和膀胱癌细胞诱导血管内皮细胞成小管的能力；特异性siRNA为针对ADGRG6基因的特异性siRNA，包括siADGRG6#1和siADGRG6#2，其中siADGRG6#1的序列为：
siADGRG6#1：5’GUUCUUAUUUGCUUUAUAUAU3’
5’AUAUAAAGCAAAUAAGAACAG3’；
siADGRG6#2的序列为：
siADGRG6#2：5’GGAAUUAUCUAUAGAAUAUCC3’
5’AUAUUCUAUAGAUAAUUCCAU3’。
上述技术方案所述的突变序列在制备体外检测膀胱癌试剂盒中的应用。
一种ADGRG6增强子的突变序列的检测方法，包括下述步骤：
以包含ADGRG6增强子基因的待测基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增ADGRG6增强子基因，所述引物对P为：
F：5’TTCCAGCAACCCCCAAGAAA 3’
R：5’CAGCTCCACTCCACCAAGTC 3’；
PCR扩增完成后，对PCR产物进行sanger测序，得到ADGRG6增强子的突变序列，所述突变序列为：
ADGRG6增强子chr.6：142,706,206位为G﹥A和chr.6：142,706,209位为C﹥T的突变序列。
一种ADGRG6增强子的突变序列的检测方法所用的特异性引物对，其中，所述特异性引物对为ADGRG6特异性引物对P，序列为：
F：5’TTCCAGCAACCCCCAAGAAA 3’
R：5’CAGCTCCACTCCACCAAGTC 3’。
上述技术方案所述的特异性引物对在制备检测膀胱癌检试剂盒中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明公开了一种ADGRG6增强子的突变序列，该突变序列在体外膀胱癌组织样本中高频发生。
2、本发明揭示了在含有所述ADGRG6增强子的突变序列的体外膀胱癌组织样本中ADGRG6高表达并且新生血管密度大。
3、本发明揭示了特异性siRNA通过干扰ADGRG6的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力和膀胱癌细胞诱导血管内皮成小管的能力；
4、ADGRG6增强子的突变序列及其特异性引物可以用来开发膀胱癌早期筛查与辅助诊断的商品化试剂盒。
附图说明：
1、图1为ADGRG6增强子在65例膀胱癌样本中全基因组测序分析的结果。
2、图2为ADGRG6增强子突变的验证结果。
3、图3为ADGRG6增强子突变对ADGRG6表达及肿瘤组织中微血管生成的影响的结果。
4、图4为干扰ADGRG6抑制膀胱癌细胞血管生成能力的结果。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明ADGRG6增强子的突变序列、检测方法、所用的特异性引物对和应用作进一步的说明。
实施例1：样本收集与全基因组测序分析：
在符合医学伦理且征得患者同意的情况下，从深圳大学泌尿外科研究所中新近诊断的膀胱癌个体获得65对配对膀胱肿瘤组织和外周血样本，用于全基因组测序分析的65例膀胱癌患者的临床信息表如表1所示。
表1全基因组测序分析的65例膀胱癌患者临床信息表
对表1所示的65例膀胱癌患者提取基因组DNA进行全基因组测序。具体方法如下：
1、使用SOAPnuke(v.1.5)过滤原始数据以删除适配器顺序和低质量读数。通过Burrows-Wheeler Aligner(BWA)将高质量的读长与人参照基因组(hg19,NCBI GRCh37)按照默认参数进行比对。使用Genome Analysis Toolkit(v.1.0.6076)完成局部重新排列并提高准精度，分别使用Mutect(v1.1.4)和Strelka(v.1.0.15)软件检测点突变和小片段插入与缺失。Segseq(v1.01)和Meerkat(v0.185)软件使用默认设置识别拷贝数变化和结构变化。
2、非编码调控区域的SNV(Single nucleotide variation)和SV(structuralvariation)断点通过Funseq2软件包(funseq 2.1.2)注释；增强子区域通过将组蛋白修饰与基因表达数据相关联来鉴定。
3、使用Global和Local统计学方法分析具有SNV或SV断点的增强子区域的突变是否具有显著性。
结果：
ADGRG6(adhesion G protein-coupled receptor G6)基因编码一种新型黏附家族G蛋白偶联受体，在血管生成中起重要作用，NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)的登录号Gene ID:57211。
结果如图1所示，在全基因组测序分析的65例膀胱癌样本中，ADGRG6的增强子在两个位点上发生了显著高频突变，其在13(chr.6：142,706,206；G>A突变)和4(chr.6：142,706,209；C>T突变)例样品中被检测到。
实施例2：ADGRG6增强子突变的验证：
在符合医学伦理的情况下，从深圳大学泌尿外科研究所样本库保存的膀胱癌石蜡切块中筛选196例没有经过放化疗治疗的样本，该196例样本的信息如表2所示。
表2靶向验证的196例膀胱癌患者临床信息表
为了进一步验证ADGRG6基因增强子在膀胱癌中的突变情况，设计了针对ADGRG6增强子突变区的特异性引物，通过Sanger测序的方法在新入组的196例膀胱癌样本中进行靶向验证。具体操作过程为：
对表2所示的196例样本使用TIANamp FFPE DNA试剂盒(Tiangen Biotech)提取DNA，通过Sanger测序的方法，分析验证ADGRG6增强子在膀胱癌组织中的突变情况。用于Sanger测序的ADGRG6特异性引物对P(序列如下)，在自动化ABI测序仪上进行Sanger测序分析。
所述引物对P为：
F：5’TTCCAGCAACCCCCAAGAAA 3’
R：5’CAGCTCCACTCCACCAAGTC 3’。
结果：
结果如图2所示，膀胱癌石蜡切块样本中ADGRG6增强子发生了高频突变。
实施例3：ADGRG6增强子突变对ADGRG6表达及肿瘤组织中微血管生成的影响：
为了进一步探究在膀胱癌中ADGRG6基因增强子突变对肿瘤的影响，通过免疫组化的方法分析了ADGRG6基因编码的蛋白在肿瘤组织中的表达情况，同时基于ADGRG6具有促进血管生成的生物学功能，分析了ADGRG6增强子突变对肿瘤组织中血管密度的影响。具体步骤如下：
在196例验证ADGRG6增强子突变的膀胱癌肿瘤样本中，利用免疫组化的方法分别对ADGRG6增强子突变与野生型的样本中ADGRG6蛋白的表达及肿瘤组织中微血管的生成进行分析。
微血管的数目通过CD31的免疫组化结果进行评估。利用特异性抗体抗ADGRG6(Abcam，目录号ab117092)和抗CD31(Abcam，目录号ab28364)，按照免疫组化分析的标准流程开展组化分析实验。具体步骤如下：
(1)、将组织切片在60℃烤箱中烘烤1h后脱蜡与水化(二甲苯I 10min；二甲苯II10min；100％乙醇I 5min；100％乙醇II 5min；95％乙醇5min；90％乙醇5min；80％乙醇5min；70％乙醇5min；蒸馏水5min)；
(2)、用0.3％过氧化氢溶液避光室温孵育30min，封闭内源性过氧化物酶的活性，再用蒸馏水冲洗3次，每次2min；
(3)、在0.01M枸橼酸盐缓冲液中微波修复抗原15min，室温冷却至常温，PBS洗3次，每次2min，再用PBST漂洗3次，每次5min；
(4)、5％BSA(PBS配制)室温孵育封闭30min；
(5)、一抗4℃冰箱孵育过夜后，用PBS洗涤3次，5min/次；
(6)、将切片在PBST溶液中过水一次,滴加50uL二抗室温孵育30min，用PBS洗涤3次，5min/次；
(7)、DAB显示液滴片，观察显色反应，及时流水终止；
(8)、苏木素复染1min，自来水漂洗干净；
(9)、梯度酒精脱水和二甲苯透明(蒸馏水5min；70％乙醇5min；80％乙醇5min；90％乙醇5min；95％乙醇5min；100％乙醇II 5min；100％乙醇I 5min；二甲苯II 10min；二甲苯I 10min)；
(10)、通风橱里晾30min后中性树脂封片，镜检。
每列样本中所检测蛋白的免疫反应评分以染色细胞的百分比(0％-100％)与染色强度(无＝1，弱＝2，中等＝3，强＝4)的乘积表示。以肿瘤组织中微血管的密度评估血管生成情况：使用抗CD31抗体来鉴定肿瘤组织中的血管内皮细胞；通过40X倍率的低倍镜扫描整个切片后指定新生血管热点区域，然后在200X倍率的高倍镜下计数新生血管的数目；与相邻微血管或其他结缔组织分离的任何染色的内皮细胞被认为代表单个微血管；使用数字成像软件(Image-Pro Plus 6.0)对微血管进行计数，每个病例选取三个新血管热点进行统计分析。
结果：
实验结果如图3所示，其中图3(a)表明ADGRG6增强子突变的样本中ADGRG6蛋白表达量高；图3(b)表明ADGRG6增强子突变的膀胱癌样本中新生血管密度大。
实施例4：干扰ADGRG6表达对膀胱癌细胞系5637与SW780表型的影响：
进一步在膀胱癌细胞系5637与SW780中探究了干扰ADGRG6基因表达对膀胱癌细胞的表型，特别是血管生成能力的影响。首先，根据ADGRG6基因的序列，设计特异性的干扰siRNA，通过RT-qPCR与Western blotting免疫印迹的方法验证siRNA的干扰效率。然后，在膀胱癌细胞5637与SW780中利用siRNA干扰ADGRG6表达，通过血管内皮招募实验与成血管实验分析在膀胱癌细胞中干扰ADGRG6对其血管生成能力的影响。
具体步骤为：
本发明使用的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和膀胱癌细胞系5637与SW780均来源于ATCC(American Tissue Culture Collection)。所有细胞经检测，确定无支原体感染。将这些细胞在RPMI-1640(5637)，DMEM(SW780)或ECM(HUVECs)培养基中(补充10％胎牛血清)，置于37℃，5％CO2的培养箱条件中培养。
一、细胞转染和条件培养基收集：
(一)、合成针对人ADGRG6(siADGRG6)和非靶向阴性对照siRNA(siCon)的siRNA寡核苷酸(序列如下)，用来转染膀胱癌5637和SW780细胞，敲低目的基因。
siRNA序列如下：
siADGRG6#1：GUUCUUAUUUGCUUUAUAUAU(Sense)
AUAUAAAGCAAAUAAGAACAG(Antisense)
siADGRG6#2：GGAAUUAUCUAUAGAAUAUCC(Sense)
AUAUUCUAUAGAUAAUUCCAU(Antisense)
siCon：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(Sense)
ACGUGACACGUUCGGAGAATT(Antisense)
(二)、将5637和SW780细胞接种到6孔板中，并将siRNA和LipofectamineRNAiMAX试剂(Invitrogen)的混合液加入6孔板中，每个孔siRNA终浓度为30nM。siRNA转染24h后，将培养基更换为0.2％FBS RPMI-1640或DMEM，继续培养24h后收集条件培养基，用于后续的成管实验。siRNA转染及条件培养基收集的具体步骤如下：
(1)、在转染的前一天将5637和SW780细胞接种到6孔板中，待细胞长到70％～80％时进行转染；
(2)、按照LipofectamineRNAiMAX试剂(Invitrogen)的说明书准备A与B两种混合液(A液：siRNA储存液加入至150uLopti-MEM培养基中混匀；B液：9uLLipofectamineRNAiMAX试剂加入至150uLopti-MEM培养基中混匀)；
(3)、混匀A、B液，室温孵育5分钟；
(4)、取混合液250μL添加到移除培养基的6孔板细胞中，并加入750μL不含FBS的RPMI-1640或DMEM培养基，轻轻摇匀，每孔siRNA的终浓度为30nM,转染6h后加入1mL含10％胎牛血清的新鲜培养基；
(5)、siRNA转染24h后，将培养基更换为0.2％FBS RPMI-1640或DMEM培养基，继续培养24h后收集培养基，0.22um过滤器过滤后保存在-20℃作为条件培养基用于后续的成管实验。
二、RT-qPCR与Western blotting：
通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)与Western blotting免疫印迹的方法检测分析siRNA寡核苷酸对目标蛋白ADGRG6表达的干扰效率。
(一)、使用Total RNA Kit(Omega Bio-tek)试剂盒，按照说明书流程提取总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒(Takara)进行cDNA合成。cDNA合成的具体步骤如下：
(1)、基因组DNA去除：在冰上配制RT-PCR反应体系，42℃，反应2min。
(2)、逆转录反应：37℃，15min；85℃，5s；4℃，5min。
(二)、结合ADGRG6或GAPDH引物(序列如下)，用TransStart Tip Green
qPCRSuperMix(TransGen)进行RT-qPCR。GAPDH作为实验内参。
引物序列如下：
ADGRG6：TCACACCTTCTGAGTACCGC(F)
AGTTCTGCCCATCAGCAGTT(R)
GAPDH：GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG(F)
GAGCCCCAGCCTTCTCCATG(R)
1、qPCR的具体操作如下：
(1)、在冰上配制RT-PCR反应体系。
(注：每个样本设三个平行孔。)
(2)、反应条件：
融解曲线分析产物特异性。
2、Western blotting免疫印迹实验过程如下：
(1)、在添加有蛋白酶抑制剂的RIPA混合液中裂解细胞收集物，12,000 g离心15min，取上清；
(2)、Bradford法测定每个样品蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离各样本中的蛋白组分，电泳结束后将凝胶分离的蛋白转移到甲醇活化的PVDF膜上；
(3)、转印结束后，5％的脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1 h；
(4)、根据目的蛋白的大小与预染蛋白Marker的指示，将膜剪成两部分，分别含有目的蛋白与内参蛋白，分别用ADGRG6(Abcam，ab75356)和GAPDH(Cell Signaling，2118S)的一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10min；
(5)、用辣根过氧化物酶标记的二抗(CST，7074S)室温避光孵育PVDF膜1h，使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法显示蛋白条带。
三、脐静脉血管内皮细胞招募与成管实验：
(一)、将HUVECs(1×104)接种到用Matrigel(10mg/ml)包被的96孔板中，并在上述收集的指定条件培养基：ECM培养基(1:2)中培养。大约4-6小时后，在相差显微镜下拍照，并在三个孔中计数成管数。具体步骤如下：
(1)、将基质胶Matrigel提前一天置于4℃冰箱过夜，使其溶解，并预冷实验所需的枪头、EP管等实验耗材；
(2)、将融化后的基质胶加入96孔板，50ul/孔，37℃、5％CO2的培养箱内包被1小时；
(3)、将HUVECs细胞悬液50ul/孔(含1×104细胞)接种于基质胶包被好的96孔板中，在上述收集的指定条件培养基：ECM培养基(1:2)中培养，设置3个重复组；
(4)、在培养箱培养大约4-6小时后，在相差显微镜下拍照，并在三个重复孔中计数成管数。
(二)、血管内皮细胞招募实验在聚碳酸酯薄膜的transwell套板(24孔，孔径8.0um)中进行测定：用指定的siRNA转染接种在下室中的5637和SW780细胞(8×104/孔)，孵育36小时后，换成0.2％FBS ECM培养基；然后在上室中接种悬浮在50uL 0.2％FBS ECM培养基中血清饥饿的HUVEC细胞(6×104个)；在37℃共培养30小时后，结晶紫染色迁移到膜下表面的HUVEC细胞，并光学显微镜下计数5个视野/孔中的细胞迁移数。
结果：
干扰ADGRG6抑制膀胱癌细胞血管生成能力的实验结果如图4所示，实验结果表明干扰ADGRG6基因的表达能明显抑制了膀胱癌细胞5637与SW780的成血管能力；图4(a)为RT-qPCR与Western blotting免疫印迹表明针对ADGRG6的特异性siRNA能干扰膀胱癌细胞ADGRG6的表达；图4(b)为干扰ADGRG6的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力；图4(c)为干扰ADGRG6的表达从而抑制了膀胱癌细胞诱导血管内皮成小管的能力。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 深圳市罗湖区人民医院
<120> ADGRG6增强子的突变序列、检测方法、所用的特异性引物对和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物对P的正向引物()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 1
ttccagcaac ccccaagaaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物对P的反向引物()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 2
cagctccact ccaccaagtc 20
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> siadgrg6#1的正义链()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 3
guucuuauuu gcuuuauaua u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> siADGRG6#1的反义链()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 4
auauaaagca aauaagaaca g 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> siADGRG6#2的正义链()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 5
ggaauuaucu auagaauauc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> siADGRG6#2的反义链()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 6
auauucuaua gauaauucca u 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> siCon的正义链()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 7
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> siCon的反义链()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 8
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> ADGRG6的正向引物()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 9
tcacaccttc tgagtaccgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> ADGRG6的反向引物()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 10
agttctgccc atcagcagtt 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> GAPDH的正向引物()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<400> 11
gaaatcccat caccatcttc cagg 24
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> GAPDH的反向引物()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 12
gagccccagc cttctccatg 20

Claims (8)

1.一种ADGRG6增强子的突变序列，其特征在于，所述ADGRG6增强子的突变序列为：
ADGRG6增强子chr.6：142,706,206位为G﹥A和chr.6：142,706,209位为C﹥T的突变序列。
2.根据权利要求1所述的突变序列，其特征在于：所述ADGRG6增强子的突变序列在体外膀胱癌组织样本中高频发生。
3.根据权利要求1所述的突变序列，其特征在于：在含有所述ADGRG6增强子的突变序列的体外膀胱癌组织样本中ADGRG6高表达并且新生血管密度大。
4.根据权利要求3所述的突变序列，其特征在于：在体外培养的含有所述ADGRG6增强子的突变序列的膀胱癌细胞系中利用特异性siRNA干扰ADGRG6的表达从而抑制了膀胱癌细胞招募血管内皮细胞的能力和膀胱癌细胞诱导血管内皮细胞成小管的能力；特异性siRNA为针对ADGRG6基因的特异性siRNA，包括siADGRG6#1和siADGRG6#2，其中siADGRG6#1的序列为：
siADGRG6#1：5’GUUCUUAUUUGCUUUAUAUAU3’
5’AUAUAAAGCAAAUAAGAACAG3’；
siADGRG6#2的序列为：
siADGRG6#2：5’GGAAUUAUCUAUAGAAUAUCC3’
5’AUAUUCUAUAGAUAAUUCCAU3’。
5.权利要求1～4中任一权利要求所述的突变序列在制备体外检测膀胱癌试剂盒中的应用。
6.一种ADGRG6增强子的突变序列的检测方法，包括下述步骤：
以包含ADGRG6增强子基因的待测基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增ADGRG6增强子基因，所述引物对P为：
F：5’TTCCAGCAACCCCCAAGAAA 3’
R：5’CAGCTCCACTCCACCAAGTC 3’；
PCR扩增完成后，对PCR产物进行sanger测序，得到ADGRG6增强子的突变序列，所述突变序列为：
ADGRG6增强子chr.6：142,706,206位为G﹥A和chr.6：142,706,209位为C﹥T的突变序列。
7.一种ADGRG6增强子的突变序列的检测方法所用的特异性引物对，其中，所述特异性引物对为ADGRG6特异性引物对P，序列为：
F：5’TTCCAGCAACCCCCAAGAAA 3’
R：5’CAGCTCCACTCCACCAAGTC 3’。
8.权利要求7所述的特异性引物对在制备检测膀胱癌检试剂盒中的应用。
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