CN112322739A - 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒，其中，所述试剂盒包括chr.6:142,706,206G>A突变位点的引物(G>A)‑F，引物(G>A)‑R及探针(G>A)‑PF；chr.6:142,706,209C>T突变位点的引物(C>T)‑R，引物(C>T)‑F及探针(C>T)‑PR；内参引物Control‑F，内参引物Control‑R及探针Control‑PR。本发明提供的试剂盒能够有效检测ADGRG6高频突变位点的突变情况，其具有操作简单、灵敏度高、特异性高和成本低等优点，非常适用于临床ADGRG6序列高频突变位点的检测。

Description

一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及突变位点检测领域，特别涉及一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒。
背景技术
膀胱癌为泌尿生殖系统常见恶性肿瘤，近年来其发病率有上升的趋势，且发病趋于年轻化。目前，主要通过膀胱镜检查诊断膀胱癌，但其是一种有创检查，且费用高，部分患者因尿道生理原因不适合膀胱镜检。
因此需要探寻一些无创，灵敏度高，特异性好且操作方便的检测试剂盒，辅助膀胱癌的早期诊断及治疗。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、灵敏度高、特异性高其成本较低的检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，包括chr.6:142,706,206G>A突变位点(参考基因组hg19)的引物(G>A)-F，引物(G>A)-R及探针(G>A)-PF；chr.6:142,706,209C>T突变位点(参考基因组hg19)的引物(C>T)-R，引物(C>T)-F及探针(C>T)-PR；内参引物Control-F，内参引物Control-R及探针Control-PR。
所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，所述引物(G>A)-F的序列如SEQID.1所示；所述引物(G>A)-R的序列如SEQ ID.2所示；所述探针(G>A)-PF的序列如SEQ ID.3所示。
所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，所述引物(C>T)-R的序列如SEQID.4所示，所述引物(C>T)-F的序列如SEQ ID.5所示；所述探针(C>T)-PR的序列如SEQ ID.6所示。
所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，所述内参引物Control-F的序列如SEQ ID.7所示，所述内参引物Control-R的序列如SEQ ID.8所示；所述探针Control-PR的序列如SEQ ID.9所示。
所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，还包括10*PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs以及HSTaq酶。
一种检测ADGRG6高频突变位点的方法，其中，包括步骤：
采用本发明所述的试剂盒对待测样品进行PCR扩增，得到扩增后样品；
测量扩增后样品的ΔCt值＝Ct值FAM-Ct值HEX；
若chr.6:142,706,206G>A突变位点体系扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr.6:142,706,206G>A突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr.6:142,706,206G>A突变位点野生型。
若chr.6:142,706,209C>T突变位点体系扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr.6:142,706,209C>T突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr.6:142,706,209C>T突变位点野生型。
有益效果：本发明提供了一种检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，该试剂盒能够有效检测ADGRG6高频突变位点的突变情况，其具有操作简单、灵敏度高、特异性高和成本低等优点，非常适用于临床ADGRG6序列高频突变位点的检测。
附图说明
图1为本发明一种检测ADGRG6高频突变位点的方法较佳实施例的流程图。
图2为本发明实施例2中chr.6:142,706,206G>A突变比例最低检测限的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图3为本发明实施例2中chr.6:142,706,209C>T突变比例最低检测限的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图4为本发明实施例3中样本编号为5ng的人基因组DNA中chr.6:142,706,206G>A突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图5为本发明实施例3中样本编号为5ng+30copy的人基因组与突变质粒混合DNA中chr.6:142,706,206G>A突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图6为本发明实施例3中样本编号为5ng的人基因组DNA中chr.6:142,706,209C>T突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图7为本发明实施例3中样本编号为5ng+30copy的人基因组组与突变质粒混合DNA中chr.6:142,706,209C>T突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图8为本发明实施例7中膀胱癌样本-1chr.6:142,706,206G>A检测的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图9为本发明实施例7中膀胱癌样本-1chr.6:142,706,206G>A的测序结果分型结果图。
图10为本发明实施例7中膀胱癌样本-1chr.6:142,706,209C>T检测的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图11为本发明实施例7中膀胱癌样本-1chr.6:142,706,209C>T的测序结果分型结果图。
具体实施方式
本发明提供一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
膀胱癌全基因组遗传突变特征普分析发现，ADGRG6基因在膀胱癌中存在高频突变现象，其突变频率仅低于TERT。ADGRG6是一种新型粘附G蛋白偶联受体，具有重要的生物学功能，其表达与突变关联肿瘤预后。ADGRG6基因的高频突变率及重要生物学功能提示其突变位点可作为膀胱癌早期辅助诊断或特异性靶向治疗的新靶点。
健康人群中，ADGRG6序列为野生型；在膀胱癌患者组织中可特异性检出ADGRG6基因的两个高频突变位点(chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T)，存在突变位点的ADGRG6序列为突变型。
本发明提出基于扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory MutationSystem，ARMS)和荧光PCR技术可实现检测样本中ADGRG6高频突变位点chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T的检测。基于ARMS-PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3'碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出ADGRG6序列的两个高频突变。
为实现上述目的，本发明提供了一种检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其包括chr.6:142,706,206G>A突变位点的引物(G>A)-F，引物(G>A)-R及探针(G>A)-PF；chr.6:142,706,209C>T突变位点的引物(C>T)-R，引物(C>T)-F及探针(C>T)-PR；内参引物Control-F，内参引物Control-R及探针Control-PR。
在本实施例中，所述引物(G>A)-F,引物(G>A)-R及探针(G>A)-PF可识别并结合于位点chr.6:142,706,206G>A突变的ADGRG6序列；引物(C>T)-R,引物(C>T)-F及探针(C>T)-PR可识别并结合于chr.6:142,706,209C>T突变的ADGRG6序列；所述内参引物Control-F,内参引物Control-R及探针Control-PR可识别并结合于未突变的ADGRG6序列。所述(G>A)-PF和(C>T)-PR的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光猝灭基团BHQ-1，Control-PR的5’端连接有荧光报告基团HEX，3’端连接有荧光猝灭基团BHQ-1，故以下结果中FAM代表ADGRG6突变型序列，HEX代表野生型序列。
在一些实施方式中，所述引物(G>A)-F的序列如SEQ ID.1所示，具体为：5’TAATTCTAACTAAGTATTTCACTCTTTGTAAA 3’；引物(G>A)-R的序列如SEQ ID.2所示，具体为：5’AGCACCGTATAAATGTTCTTGGA 3’；所述探针(G>A)-PF的序列如SEQ ID.3所示，具体为：5’6FAM-CCTCTG/iXNA_T/GGTATT/iXNA_C/T/iXNA_C/CCT/iXNA_C/CAG-BHQ-1 3’。在本实施例中，所述序列中出现的/iXNA_T/、/iXNA_C/及/iXNA_G/表示锁核苷酸修饰，所述iXNA，即LNA，又称“锁核酸”(Locked nucleic acid，LNA)，是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物。iXNA_T、iXNA_C以及iXNA_G结构可降低核糖结构的柔韧性，增加磷酸盐骨架局部结构的稳定性。因此，所述锁核苷酸修饰可以增加探针的融解温度，加强探针的稳定性，还可以增加实验的特异性跟灵敏性。
在一些实施方式中，所述引物(C>T)-R的序列如SEQ ID.4所示，具体为：5’AGAATACCACAGAGGCTCTTTGTAAA 3’；所述引物(C>T)-F的序列如SEQ ID.5所示，具体为：5’CAAGGAGATTTATGATGGAGCAA 3’；所述探针(C>T)-PR的序列如SEQ ID.6所示，具体为：5’6FAM-CTACTG/iXNA_G/CTAGAGT/iXNA_C/CATG/iXNA_T/GAAA/iXNA_T/ATG-BHQ-1 3’。在本实施例中，所述序列中出现的/iXNA_T/、/iXNA_C/及/iXNA_G/表示锁核苷酸修饰，，所述iXNA，即LNA，又称“锁核酸”(Locked nucleic acid，LNA)，是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物。iXNA_T、iXNA_C以及iXNA_G结构可降低核糖结构的柔韧性，增加磷酸盐骨架局部结构的稳定性。因此，所述锁核苷酸修饰可以增加探针的融解温度，加强探针的稳定性，还可以增加实验的特异性跟灵敏性。
在一些实施方式中，所述内参引物Control-F的序列如SEQ ID.7所示，具体为：5’CTGCTTATTCCATCCAGTTCA 3’；所述内参引物Control-R的序列如SEQ ID.8所示，具体为：5’AGGTCCTCCAGTGTCTTC 3’；所述探针Control-PR的序列如SEQ ID.9所示，具体为：5’6HEX-TGTACCTTGGATTCACTGGCCTGTC-BHQ-1 3’。
在一些实施方式中，所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒还包括10*PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs以及HSTaq酶。
在一些具体的实施方式中，所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒包括如表1，表2所示的反应体系：
表1反应体系1
试剂 体积
10×PCR缓冲液 5ul
MgCl<sub>2</sub>(40mM) 4ul
dNTP(2.5mM) 2.5ul
(G>A)-F(10pM) 2.5ul
(G>A)-R(10pM) 2.5ul
(G>A)-PR(10pM) 0.5ul
Control-F(10pM) 0.2ul
Control-R(10pM) 0.2ul
Control-PR(10pM) 0.5ul
HSTaq酶 0.2ul
DNA模板(0.2*TE，不超过2ng/ul) 5ul
无菌双蒸水 Up to 50ul
表2反应体系2
试剂 体积
10×PCR缓冲液 5ul
MgCl<sub>2</sub>(40mM) 4ul
dNTP(2.5mM) 2.5ul
(C>T)-F(10pM) 2.5ul
(C>T)-R(10pM) 2.5ul
(C>T)-PF(10pM) 0.5ul
Control-F(10pM) 0.2ul
Control-R(10pM) 0.2ul
Control-PR(10pM) 0.5ul
HSTaq酶 0.2ul
DNA模板(0.2*TE，不超过2ng/ul) 5ul
无菌双蒸水 Up to 50ul
在一些实施方式中，基于所述试剂盒，还提供一种检测ADGRG6高频突变位点的方法，如图1所示，其包括步骤：
S10、采用本发明所述的试剂盒对待测样品进行PCR扩增，得到扩增后样品；
S20、测量扩增后样品的ΔCt值＝Ct值FAM-Ct值HEX；
S30、若chr.6:142,706,206G>A突变位点体系(反应体系1)扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr.6:142,706,206G>A突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr.6:142,706,206G>A突变位点野生型；
S40、若chr.6:142,706,209C>T突变位点体系(反应体系2)扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr.6:142,706,209C>T突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr.6:142,706,209C>T突变位点野生型。
在本实施例中，所述PCR扩增的反应程序如下所示：1、95℃条件下反应5min；2、进行8个循环，每个循环包括：95℃条件下反应30sec，65℃条件下反应30sec，72℃条件下反应45sec；3、进行40个循环，每个循环包括：95℃条件下反应30sec，60℃条件下反应30sec，72℃条件下反应40sec。
下面通过具体实施例对本发明一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒做进一步的解释说明：
实施例1
提供一种检测ADGRG6两个高频突变位点chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T的试剂盒，其包括chr.6:142,706,206G>A突变位点的引物(G>A)-F，引物(G>A)-R及探针(G>A)-PF；chr.6:142,706,209C>T突变位点的引物(C>T)-R，引物(C>T)-F及探针(C>T)-PR；内参引物Control-F，内参引物Control-R及探针Control-PR，其中，
(G>A)-F：5’TAATTCTAACTAAGTATTTCACTCTTTGTAAA 3’
(G>A)-R：5’AGCACCGTATAAATGTTCTTGGA 3’
(G>A)-PF：5’6FAM-CCTCTG/iXNA_T/GGTATT/iXNA_C/
T/iXNA_C/CCT/iXNA_C/CAG-BHQ-1 3’
(C>T)-R：5’AGAATACCACAGAGGCTCTTTGTAAA 3’
(C>T)-F：5’CAAGGAGATTTATGATGGAGCAA 3’
(C>T)-PR:5’6FAM-CTACTG/iXNA_G/CTAGAGT/iXNA_C/
CATG/iXNA_T/GAAA/iXNA_T/ATG-BHQ-1 3’
Control-F：5’CTGCTTATTCCATCCAGTTCA 3’
Control-R：5’AGGTCCTCCAGTGTCTTC 3’
Control-PR：5’6HEX-TGTACCTTGGATTCACTGGCCTGTC-BHQ-1 3’。
实施例2
研究实施例1反应体系中突变比例的最低检测限评估
在突变比例最低检测限评估中，chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T两种ADGRG6突变类型分别设置3个突变比例(人基因组DNA提取液中分别添加相应的突变质粒，人基因组DNA的终浓度为10ng/ul,突变质粒的终浓度分别为10、20与30copy/ul，其对应的突变比例分别约为0.33％、0.66％与1.00％；3000拷贝的人单倍体基因组质量约为10ng)，每个特定的突变比例进行20次重复检测，通过3次重复试验，评估ADGRG6两种突变的最低检测限；最终确定两种突变位点在10ng基因组DNA背景下不低于95％检出率的最低检测限均为30copy/ul，即突变比例的最低检测限约为1.00％。ADGRG6两个高频突变位点chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T的最低检测限的FAM及HEX荧光扩增曲线分别如图2和图3所示。
实施例3
本实施例利用实施例1所述试剂盒对不同提取浓度人基因组DNA背景中ADGRG6两个高频突变位点chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T的检出情况进行检测。
1、反应体系配置
按表1，表2分别配置反应体系，严格的避光条件下，在冰上配置反应体系，按上述反应程序进行反应。所述DNA模板分为两组，A组为5ng/ul,8ng/ul及10ng/ul的基因组DNA，B组为在A组的基因组DNA浓度基础上，每个浓度加入ADGRG6突变质粒DNA，使其终浓度为30copy/ul。
2、结果判断标准
本发明试剂盒可用于检测ADGRG6两个高频突变位点，从而对ADGRG6突变情况进行诊断。检测结果可用ΔCt值＝Ct值FAM-Ct值HEX判断：
(1)ADGRG6 chr.6:142,706,206G>A突变位点野生型：FAM及HEX荧光扩增曲线平滑，呈“S”型；且ΔCt值>14；
(2)ADGRG6 chr.6:142,706,206G>A突变位点突变型：FAM及HEX荧光扩增曲线平滑，呈“S”型；且ΔCt值<14；
(3)ADGRG6 chr.6:142,706,209C>T突变位点野生型：FAM及HEX荧光扩增曲线平滑，呈“S”型；且ΔCt值>14；
(4)ADGRG6 chr.6:142,706,209C>T突变位点突变型：FAM及HEX荧光扩增曲线平滑，呈“S”型；且ΔCt值<14。
3、检测结果
按上述配置的DNA模板中，各浓度的DNA具有均有两条平滑的扩增曲线，呈“S”型；检测结果均符合判断标准，检测结果如表3，表4所示，当提取的检测样本基因组DNA浓度大于5ng/ul，突变序列的浓度在30copy/ul且突变比例大于等于1％时，ADGRG6两个高频突变位点chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T均能检出，且检测结果与实际分型符合率为100％。
表3混合质粒chr.6:142,706,206G>A突变位点检测结果
Figure BDA0002795744290000101
Figure BDA0002795744290000111
表4混合质粒chr.6:142,706,209C>T突变位点检测结果
Figure BDA0002795744290000112
Figure BDA0002795744290000121
表3，表4中，样本编号为5ng的基因组DNA的chr.6:142,706,206G>A突变位点及chr.6:142,706,209C>T突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线如图4和图6所示；样本编号为5ng+30copy的基因组与突变质粒混合DNA的chr.6:142,706,206G>A突变位点及chr.6:142,706,209C>T突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线如图5和图7所示。
实施例4
研究反应体系中Mg2+添加体积对检测结果的影响
PCR反应体系中Mg2+以外其他组分的体积同表2，按反应程序，进行不同Mg2+添加体积的检测。分别配置添加以下Mg2+体积的反应体系：3ul、4ul、5ul和6ul。结果表明，当Mg2+在反应体系中的添加体积在3～6ul时均能实现检测，其中，当Mg2+在反应体系中的添加体积为4ul时，检测体系的扩增效率好且野生型与突变型Ct的差值最大(检测结果最佳)，因此其它实施例中都采用的是添加4ul Mg2+的反应体系。
实施例5
研究反应体系中dNTP添加体积对检测结果的影响
PCR反应体系中dNTP以外其他组分的体积同表2，按反应程序，进行不同dNTP添加体积的检测。分别配置添加以下dNTP体积的反应体系：2ul、2.5ul和3ul。结果表明，当dNTP在反应体系中的添加体积在2～3ul时均能实现检测，其中，当dNTP在反应体系中的添加体积为2.5ul时，检测体系的扩增效率好且野生型与突变型Ct的差值最大(检测结果最佳)，因此其它实施例中都采用的是添加2.5ul dNTP的反应体系。
实施例6
研究反应体系中探针添加体积对检测结果的影响
PCR反应体系中探针以外其他组分的体积同表2，按反应程序，进行不同探针添加体积的检测。分别配置添加0.4ul、0.5ul与0.6ul探针(C>T)-PR的反应体系和0.4ul、0.5ul与0.6ul探针Control-PR的反应体系。结果表明，在反应体系中添加以上探针体积，均能实现检测，其中，当探针(C>T)-PR和Control-PR在反应体系中的添加体积均为0.5ul时，检测体系的扩增效率好且野生型与突变型Ct的差值最大(检测结果最佳)，因此其它实施例中都采用的是添加(G>A)-PR/(C>T)-PR和Control-PR探针各0.5ul的反应体系。
实施例7
本实施例对2例膀胱癌患者的临床样本进行了ADGRG6两个高频突变位点chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T的突变检测。取2例膀胱癌患者的膀胱癌组织，提取DNA后利用实施例1所述试剂盒，按照表1，表2所述检测方法进行检测。检测结果显示在2例膀胱癌组织样本中ADGRG6均发生了chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T位点的突变。其检测结果如表5，表6所示：
表5临床样本chr.6:142,706,206G>A位点突变检测结果
Figure BDA0002795744290000131
Figure BDA0002795744290000141
表6临床样本chr.6:142,706,209C>T位点检测结果
Figure BDA0002795744290000142
所述表5中，膀胱癌样本-1chr.6:142,706,206G>A位点突变检测的FAM及HEX荧光扩增曲线图如图8所示，所述膀胱癌样本-1对应位点的测序结果如图9所示。所述表6中，膀胱癌样本-1chr.6:142,706,209C>T位点突变检测的FAM及HEX荧光扩增曲线图如图10所示，所述膀胱癌样本-1对应位点的测序结果如图11所示。上述实验结果显示，检测的膀胱癌患者临床样本检出的ΔCt值均小于14，2例膀胱癌样本中均存在ADGRG6序列高频突变位点chr.6:142,706,206G>A和chr.6:142,706,209C>T的突变，都属于突变型，其分型结果与一代测序结果完全符合。以上结果表明本发明试剂盒在用于ADGRG6序列高频突变位点检测时具有很好的准确性。
综上所述，本发明提供了一种检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，该试剂盒能够有效检测ADGRG6高频突变位点的突变情况，其具有操作简单、灵敏度高、特异性高和成本低等优点，非常适用于临床ADGRG6序列高频突变位点的检测。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
<110> 深圳市罗湖区人民医院
<120> 一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒
<160> 9
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
taattctaac taagtatttc actctttgta aa 32
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
agcaccgtat aaatgttctt gga 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
cctctgtggt attctccctc cag 23
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
agaataccac agaggctctt tgtaaa 26
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
caaggagatt tatgatggag caa 23
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
ctactggcta gagtccatgt gaaatatg 28
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
ctgcttattc catccagttc a 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 8
aggtcctcca gtgtcttc 18
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 9
tgtaccttgg attcactggc ctgtc 25

Claims (6)

1.一种检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其特征在于，包括chr.6:142,706,206G>A突变位点的引物(G>A)-F，引物(G>A)-R及探针(G>A)-PF；chr.6:142,706,209C>T突变位点的引物(C>T)-R，引物(C>T)-F及探针(C>T)-PR；内参引物Control-F，内参引物Control-R及探针Control-PR。
2.根据权利要求1所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其特征在于，所述引物(G>A)-F的序列如SEQ ID.1所示；所述引物(G>A)-R的序列如SEQ ID.2所示；所述探针(G>A)-PF的序列如SEQ ID.3所示。
3.根据权利要求1所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其特征在于，所述引物(C>T)-R的序列如SEQ ID.4所示，所述引物(C>T)-F的序列如SEQ ID.5所示；所述探针(C>T)-PR的序列如SEQ ID.6所示。
4.根据权利要求1所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其特征在于，所述内参引物Control-F的序列如SEQ ID.7所示，所述内参引物Control-R的序列如SEQ ID.8所示；所述探针Control-PR的序列如SEQ ID.9所示。
5.根据权利要求1所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其特征在于，还包括10*PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs以及HSTaq酶。
6.一种检测ADGRG6高频突变位点的方法，其特征在于，包括步骤：
采用权利要求1-5任一所述的试剂盒对待测样品进行PCR扩增，得到扩增后样品；
测量扩增后样品的ΔCt值＝Ct值FAM-Ct值HEX；
若chr.6:142,706,206G>A突变位点体系扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr.6:142,706,206G>A突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr.6:142,706,206G>A突变位点野生型；
若chr.6:142,706,209C>T突变位点体系扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr.6:142,706,209C>T突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr.6:142,706,209C>T突变位点野生型。
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