WO2021125105A1 - 分析方法及びキット - Google Patents

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cancer
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mir
hsa
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美雅 稲田
橋本　幸二
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株式会社 東芝
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • Embodiments of the present invention relate to analytical methods and kits.
  • miRNA microRNA
  • An object to be solved by the present invention is to provide an analysis method, a kit, a primer set and a detection device capable of easily determining the presence or absence of cancer in a subject.
  • an analytical method for determining the presence or absence of cancer in a subject comprises quantifying hsa-miR-1301-3p in a sample derived from the subject.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an example of the analysis method of the first embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an example of the analysis method of the second embodiment.
  • FIG. 3 is a flowchart showing an example of the quantification step of the third embodiment.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of the quantification step of the third embodiment.
  • FIG. 5 is a box plot showing the experimental results of Example 1.
  • FIG. 6 is a box plot showing the experimental results of Example 1.
  • FIG. 7 is a boxplot showing the experimental results when the primer set A of Example 2 is used.
  • FIG. 8 is a box plot showing the experimental results of Example 2.
  • FIG. 9 is a box plot showing the experimental results of Example 2.
  • FIG. 10 is a boxplot showing the experimental results when the primer set J of Example 2 is used.
  • FIG. 11 is a box plot showing the experimental results of Example 2.
  • FIG. 12 is a box plot showing the experimental results of Example 2.
  • the analytical method according to the first embodiment includes quantifying hsa-miR-1301-3p in a sample derived from the subject (quantification step (S1)), as shown in FIG. 1 (a). This is a method for determining the presence or absence of cancer.
  • Cancer refers to malignant tumors, malignant neoplasms, cancers and sarcomas. Cancer is not limited, but for example, prostate cancer, breast cancer, colon cancer, stomach cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, esophageal cancer, liver cancer, brain cancer, bladder Cancer, sarcoma, uterine body cancer, uterine sarcoma, mesenteric tumor, pharyngeal cancer, maxillary cancer, oral cancer, tongue cancer, lip cancer, laryngeal cancer, thyroid cancer, neurotumor, neuroma Includes tumors, neuroblastomas, renal cell carcinomas, testis cancers, cervical cancers, skin cancers, malignant melanomas, bone tumors, leukemias, malignant lymphs and multiple myelomas.
  • Cancer includes those of any stage, for example, cancer staying in the organ of the origin, cancer spreading to surrounding tissues, and cancer metastasis to lymph nodes. This includes the condition where the cancer has spread to a distant organ and the condition where the cancer has spread to a distant organ.
  • the target is an animal to be analyzed in this method, that is, an animal for which a sample is provided.
  • the subject may be an animal having some disease or a healthy animal.
  • the subject may be an animal that may have cancer, an animal that has had cancer in the past, or the like.
  • the target is preferably a human.
  • the subject may be another animal.
  • Other animals are, for example, mammals, such as primates such as monkeys, rodents such as mice, rats or guinea pigs, companion animals such as dogs, cats or rabbits, and domestic animals such as horses, cows or pigs. Alternatively, it includes animals belonging to exhibited animals and the like.
  • the target-derived sample includes a sample collected from the target, a sample obtained by appropriately processing the sample, and the like.
  • the sample is preferably serum.
  • Samples include other body fluids such as blood, plasma, leukocytes, interstitial fluid, urine, stool, sweat, saliva, oral mucosa, nasal mucosa, runny nose, pharyngeal mucosa, sputum, digestive juices, gastric fluid, lymph, spinal cord. It may be fluid, tear fluid, breast milk, runny nose, semen, vaginal fluid, or the like.
  • the sample may be a tissue or a cell or the like, a tissue or a cell collected from a subject and cultured, or a supernatant thereof.
  • Samples can be taken using common methods according to the type.
  • the sample may be used as it is after collection, or may be treated so as not to inhibit the reaction for quantification of nucleic acid or to be in a state more suitable for the reaction.
  • the treatment is, for example, shredding, homogenizing, centrifugation, precipitation, extraction and / or separation, and can be performed by any known means.
  • Nucleic acid extraction kits include, for example, NucleoSpin (registered trademark) miRNA Plasma (manufactured by Takara Bio), Quick-cfRNA Serum & Plasma Kit (manufactured by Zymo Research), miRNeasy Serum / Plasma Kit (manufactured by Kiagen) (Manufactured by), PureLinkTM Total RNA Blood Kit (manufactured by Thermo Fisher), Plasma / Serum RNA Purification Kit (manufactured by Norgen Biotech), microRNA Extractor (registered trademark) SP Kit (manufactured by Wako) Etc. can be used.
  • the sample may be diluted with a buffer solution, heat-treated at 80 to 100 ° C., centrifuged, and the supernatant may be collected for extraction.
  • hsa-miR-1301-3p in the sample is quantified (quantification step (S1)).
  • hsa-miR-1301-3p has the following sequence: UUGCAGCUGCCUGGGGAGUGACUUC (SEQ ID NO: 1) It is a miRNA having.
  • hsa-miR-1301-3p is also referred to as "target miRNA”.
  • the quantification step (S1) can be performed using a general method for quantifying RNA, particularly short RNA such as miRNA.
  • the method is not limited, but it is preferable, for example, to reverse-transcribe the target miRNA, amplify the cDNA, and detect and quantify the amplification product.
  • amplification for example, PCR method, qPCR method, LAMP method and the like can be used.
  • Detection and quantification may be performed after amplification or over time during amplification.
  • a measurement method using a signal based on turbidity or absorbance a measurement method using an optical signal, a measurement method using an electrochemical signal, or a combination thereof can be used.
  • the target miRNA can be quantified.
  • the quantitative value of the target miRNA can be determined using a calibration curve showing the relationship between the detection result of the above signal and the abundance of the target miRNA.
  • a calibration curve can be created by detecting signals on multiple standard samples containing the target miRNA at different known concentrations. By comparing this calibration curve with the detection result of the signal obtained for the sample derived from the target, the abundance of the target miRNA in the sample can be calculated. For example, the abundance of target miRNA in a sample can be obtained as the copy number of target miRNA per unit amount of sample.
  • the quantification step (S1) may be performed using, for example, a commercially available kit.
  • commercially available kits are TaqMan® Advanced miRNA Assays (Thermo Fisher, ID: 477827_mir), miRCURY LNA miRNA PCR Assays (Kiagen, Catalog No. YP02103132), SYBR® (Manufactured by Origin Technologies) and the like, and can be used together with a primer that specifically amplifies the target miRNA.
  • the quantified value of the target miRNA obtained in the quantification step (S1) can be used to determine the presence or absence of cancer in the subject.
  • the analysis method of the first embodiment may further include a determination step (S2) that can be performed after the quantification step (S1), as shown in FIG. 1 (b).
  • the determination step (S2) when the quantitative value of the target miRNA is high, it is determined that the subject has cancer. Conversely, a subject may be determined not to have cancer if the quantitative value is low.
  • the level of the quantified value is determined based on, for example, the quantified value or the threshold value of the target miRNA in the control obtained in advance. For example, if the quantitative values are higher than those, it can be determined that the subject has cancer.
  • the control is, for example, a healthy body.
  • a healthy body is at least an individual who does not have cancer.
  • a healthy body is preferably a healthy individual having no disease or abnormality.
  • the individual selected as a control may be an individual different from the subject analyzed by this method, but an individual belonging to the same species, that is, if the subject is human, it is preferable to be human.
  • the physical conditions or number of controls such as age, sex, height and weight are not particularly limited, but the physical conditions may be the same as or similar to those to be examined by this analysis method. preferable.
  • the quantified value of the target miRNA in the control is, for example, a quantified value of the target miRNA obtained by using the same or similar sample derived from the control and using the same method used in the quantification step (S1).
  • the threshold is, for example, a quantified value of a target miRNA capable of separating a quantified value in a subject suffering from cancer from a quantified value in a control not suffering from cancer.
  • the threshold is used in the quantification step (S1), for example, using the same or similar sample derived from a standard subject whose presence or absence is known to have cancer, or a sample containing cancer cell lines. It can be determined from the quantitative value of the target miRNA obtained by the same method as in.
  • the threshold value is not limited and may be determined according to the quantification method used, the type of sample, the measurement conditions, and the like.
  • the threshold value may be determined for each object. For example, if the target miRNA quantification value of a healthy subject, which is regularly measured in a medical examination or the like, is monitored, by using it as a threshold value, the patient suffers from cancer when the quantification value is higher than that. You can issue an alarm as it may be. Thresholds can vary from individual to individual. For example, in a subject A quantitative value of the normal target miRNA had remained at about 103 copies, it may be that there is a possibility of cancer when a certain time 10 4 copies. On the other hand, in the subject B had remained at approximately 10 2 copies, it is possible to have the possibility of cancer when a certain time 10 3 copies.
  • the quantitative value or threshold value in the control may be determined from past findings such as literature.
  • being affected also includes the possibility of being affected. Conversely, not being affected also includes being less likely to be affected.
  • determining that the patient has cancer also includes determining the prognosis or recurrence of the cancer in the subject.
  • the analysis method includes a determination step (S3) for determining the prognosis or the presence or absence of recurrence of cancer in a subject from the result of the quantification after the quantification step (S1).
  • the determination step (S3) for example, when the quantitative value is high, it can be determined that the prognosis of the cancer in the subject is poor, the cancer has recurred, or the possibility is high.
  • the quantitative values and thresholds in the above control can also be used to determine the prognosis and recurrence. In particular, it may be preferable to use a threshold value determined for each object.
  • the analysis method is a type of treatment method or a type of drug to be applied to the subject from the judgment result after the judgment step (S2) and / or the judgment step (S3).
  • the selection step (S4) for selecting the above is included.
  • the treatment or drug is for the treatment of cancer.
  • the type of treatment or type of drug includes the amount, timing or duration of treatment or drug used.
  • the analysis method of the first embodiment described above it is possible to easily determine whether or not a subject has cancer by quantifying one type of target miRNA (hsa-miR-1301-3p). It is possible. In other words, according to this method, it is possible to easily distinguish between a subject suffering from cancer and a subject not suffering from cancer.
  • the analysis method of the embodiment can use serum that can be easily collected in a medical examination or the like, so that cancer can be detected at an early stage.
  • serum or the like the physical and economic burden on the subject can be greatly reduced as compared with cytodiagnosis and the like, and the procedure is simple, so that the burden on the examiner is small.
  • concentration of miRNA contained in serum is stable, it is possible to perform a more accurate test.
  • analytical methods are also provided to assist in determining the presence or absence of cancer in a subject, including quantifying the target miRNA in a sample from the subject (quantification step (S1)).
  • “Assisting the judgment” includes, for example, acquiring information on the possibility that the subject has cancer.
  • the "information” can be, for example, a quantitative value obtained in the quantitative step (S1). According to this method, it is necessary to obtain more accurate information for determining the presence or absence of cancer in a subject, determining the prognosis, determining the presence or absence of recurrence, or selecting a treatment method or drug applied to the subject. Can be done.
  • this analysis method can also be used for detection of cancer cells in a sample not derived from a subject.
  • cancer cells when cancer cells are artificially produced, it can also be used to confirm whether or not cancer cells are present in the produced cell-containing solution.
  • a marker for cancer detection including hsa-miR-1301-3p is provided.
  • the "marker” refers to a substance capable of determining whether or not the sample and / or the object from which the sample is derived is in a specific state by detecting the presence or absence or concentration thereof in the sample.
  • the marker for cancer detection of the first embodiment is, for example, by measuring its abundance (quantitative value) in a sample derived from a subject, as described above, determining the presence or absence of cancer in the subject, determining the prognosis, The presence or absence of recurrence can be determined, or the treatment method or drug applied to the subject can be selected.
  • a cancer detection kit is provided.
  • the kit includes a reverse transcription (RT) primer for reverse transcription of hsa-miR-1301-3p, an extension (EL) primer for extension of hsa-miR-1301-3p, and hsa-miR-1301-. It contains at least one nucleic acid selected from the group consisting of an amplification primer set for amplifying 3p and a nucleic acid probe for detecting hsa-miR-1301-3p.
  • RT reverse transcription
  • EL extension primer for extension of hsa-miR-1301-3p
  • hsa-miR-1301- contains at least one nucleic acid selected from the group consisting of an amplification primer set for amplifying 3p and a nucleic acid probe for detecting hsa-miR-1301-3p.
  • the RT primer is a primer for obtaining the cDNA of the target miRNA.
  • the RT primer contains a sequence complementary to the sequence of at least one part of the target miRNA.
  • the RT primer may further include an artificial sequence added to the cDNA that facilitates amplification of the cDNA of the target miRNA.
  • the EL primer is a primer for adding an artificial sequence to the cDNA in order to facilitate amplification of the cDNA of the target miRNA.
  • the EL primer may include a sequence complementary to the sequence of at least one portion of the cDNA of the target miRNA and a sequence added for extension of the cDNA.
  • the amplification primer set is, for example, for the PCR method, and includes at least a forward primer and a reverse primer.
  • the amplification primer set is for the LAMP method and contains at least a FIP primer and a BIP primer. If necessary, F3 primer, B3 primer and / or loop primer may be included.
  • Each primer included in the amplification primer set may be designed to bind to the cDNA of the target miRNA or its complementary sequence, or to the artificial sequence added by the RT and / or EL primers. May be done. Preferred sequences of RT primer, EL primer and amplification primer set will be described in the third embodiment.
  • a nucleic acid probe can have at least one sequence of the target miRNA, its cDNA, or its amplification product, or a complementary sequence thereof.
  • the nucleic acids included in the kit may be provided individually or in combination in a container together with an appropriate carrier. Suitable carriers are, for example, water, physiological solutions or buffers.
  • the container is, for example, a tube or a microtiter plate.
  • these nucleic acids may be provided by being immobilized on a solid phase such as a microfluidic chip.
  • the kit may contain reagents used for reverse transcription, elongation and / or amplification, such as enzymes, substrates and / or labeling substances that generate optical or electrical chemical signals used for detection.
  • the labeling substance is, for example, an indicator such as a fluorescent dye such as SYBR Green, EVA Green, or SYTO 82, or a metal complex such as ruthenium hexaamine when detecting a current.
  • the kit can be used for determining the presence or absence of cancer in a subject, determining the prognosis, determining the presence or absence of recurrence, selecting the type of treatment method or the type of drug, and the like.
  • the cancer detection kit is provided as a cancer diagnostic composition or diagnostic agent. Also, according to embodiments, the use of at least one of the above nucleic acids in the manufacture of a cancer diagnostic composition or cancer diagnostic agent is also provided.
  • the analysis method of the second embodiment includes quantifying hsa-miR-1301-3p in a sample derived from the subject (quantification step (S11)) for breast cancer in the subject.
  • a sample derived from the subject quantification step (S11)
  • Colon cancer, stomach cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, esophageal cancer, liver cancer, brain cancer, bladder cancer, prostate cancer, sarcoma and uterine body cancer It is a method of determining the presence or absence of one disease.
  • breast cancer, colon cancer, stomach cancer, lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, esophageal cancer, liver cancer, brain cancer, bladder cancer, prostate cancer, sarcoma and uterine body cancer Collectively referred to as "target cancer”.
  • the quantification step (S11) can be performed in the same manner as the quantification step (S1) of the first embodiment, but amplification can be performed by using the LAMP method.
  • the subject and sample can be similar to those of the first embodiment, but the subject may be affected by at least one of the target cancers, or at least one of the target cancers in the past. It may be an animal or the like that has been used.
  • the quantification result of the target miRNA obtained in the quantification step (S11) can be used to detect at least one of the target cancers in the subject.
  • the analysis method according to the second embodiment may further include a determination step (S12) that can be performed after the quantification step (S11) as shown in FIG. 2 (b).
  • the determination step (S12) if the quantitative value of the target miRNA is high, the subject can be determined to be affected by at least one of the target cancers.
  • the level of the quantified value is determined based on, for example, the quantified value or the threshold value of the target miRNA in the control obtained in advance.
  • the control refers to, for example, an individual not suffering from any of the target cancers.
  • the control may be a healthy body or an individual suffering from other diseases, but is preferably an individual suffering from other cancers.
  • Other cancers are cancers that are classified other than the target cancer.
  • Other cancers are, for example, uterine sarcoma.
  • the threshold is, for example, a quantified value of the target miRNA that can separate a quantified value in a subject suffering from the target cancer from a quantified value in a control not suffering from the target cancer. It is preferable that the quantitative value can be separated from the quantitative value in the affected subject and the quantitative value in the control suffering from uterine sarcoma.
  • the threshold is obtained from, for example, the same or similar sample derived from a standard subject whose cancer is affected or not, or the type of cancer in which the cancer is affected, or a sample containing cell lines of a target cancer, or the like. It can be determined from the determined target miRNA quantification value.
  • the threshold value is not limited and may be determined according to the quantification method used, the type of sample, the measurement conditions, and the like.
  • the quantitative value or threshold value in the control may be determined from past findings such as literature.
  • the quantitative value obtained in the quantitative step (S11) is high, it can be determined that the subject is not suffering from uterine sarcoma but suffers from at least one of the target cancers.
  • this analytical method it is possible to distinguish between a target cancer-affected subject and a uterine sarcoma-affected subject or a non-cancer-affected subject.
  • the presence or absence of the target cancer is determined based on the uterine sarcoma cancer. It can be accurately identified and judged.
  • the presence or absence of at least one target cancer in the subject can be easily determined. It is possible to judge.
  • the analysis method of the second embodiment is a determination step (S13) for determining the prognosis or the presence or absence of recurrence of the target cancer in the subject from the quantification result after the quantification step (S11). May include. Further, after the determination step (S12) and / or the determination step (S13), a selection step (S14) for selecting the type of treatment method or the type of drug to be applied to the subject according to the result may be included.
  • an analysis to assist in determining the presence or absence of at least one target cancer in a subject including quantifying the target miRNA in a sample from the subject (quantification step (S11)).
  • Quantification step (S11) quantifying the target miRNA in a sample from the subject.
  • a marker for target cancer detection including hsa-miR-1301-3p is also provided.
  • a kit for detecting a targeted cancer contains nucleic acids similar to those described in the first embodiment, but the primer set may be for the LAMP method.
  • the kit may further include the reagents required for the quantification step.
  • the kit according to the second embodiment may be provided as a diagnostic composition or a diagnostic agent for detecting at least one of the target cancers. Also provided according to the second embodiment is the use of at least one of the above nucleic acids in the manufacture of the diagnostic composition or diagnostic agent.
  • the quantitative value of hsa-miR-1301-3p obtained by the LAMP method can be used to universally detect the target cancer. For example, if the quantitative value of hsa-miR-1301-3p is equal to or higher than the threshold value in the cells obtained from the subject, it can be determined that the subject is affected by at least one of the target cancers. Furthermore, by quantifying other markers specific to each target cancer, it is possible to more accurately determine which of the target cancers the subject has.
  • markers are, for example, markers other than hsa-miR-1301-3p for detecting at least one of the target cancers.
  • hsa-miR-92a-3p which has a high expression level in prostate cancer
  • hsa-miR-92a-3p has the following sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU (SEQ ID NO: 2) It is a miRNA having.
  • hsa-miR-122a-5p which has a high expression level in pancreatic cancer
  • hsa-miR-122a-5p has the following sequence: UGGAGUGUGACAAUGGUGUGUUG (SEQ ID NO: 3) It is a miRNA having.
  • markers are not limited to the above, and any marker known as a marker for detecting any of the target cancers can be used.
  • the other marker does not have to be miRNA and may be DNA, peptide, protein or the like.
  • the kit in this example may further include an RT primer, an EL primer, an amplification primer set and / or a nucleic acid probe for detecting the other markers described above.
  • the target miRNA is specifically reverse-transcribed, an artificial sequence is added and elongated, the elongation product is amplified by the LAMP method, and the obtained amplification product is detected.
  • the sequence of the target miRNA (SEQ ID NO: 1) is also referred to as “first sequence”.
  • the quantification step (S1) includes, for example, the following step shown in FIG. (S1-1)
  • the first primer part of the reverse transcription (RT) primer containing the first primer part and the first LAMP recognition sequence that hybridize with the first sequence of the target miRNA is hybridized with the first sequence.
  • S1-2 Dissociation step of dissociating the reverse transcriptase and the target miRNA
  • S1-3 The second primer portion that hybridizes with the first sequence and the second primer portion of the extension (EL) primer containing the second LAMP recognition sequence are hybridized with the first sequence of the reverse transcript.
  • S1-4 An amplification step of amplifying an extension product by a LAMP reaction to obtain an amplification product, and (S1-5) a detection step of detecting the obtained amplification product.
  • a substrate such as RT primer 3, reverse transcriptase, salt and deoxynucleoside triphosphate (dNTP) (thickening agent as a reaction reagent, for pH adjustment, if necessary).
  • dNTP deoxynucleoside triphosphate
  • a reverse transcription solution containing a buffer material, a surfactant, an ion that increases annealing specificity and / or an ion that is a cofactor of reverse transcriptase is used.
  • the reverse transcriptase for example, M-MuLV reverse transcriptase, AMV reverse transcriptase, transcrypter reverse transcriptase, SuperScript® transcriptase reverse transcriptase, MultiScribe reverse transcriptase and the like can be used.
  • RT primer 3 contains a first primer portion 4a and a first LAMP recognition sequence 4b.
  • the first primer portion 4a is a nucleic acid sequence that hybridizes with the first sequence 2 and acts as a primer for reverse transcribing the first sequence 2 to generate cDNA (sequence 5 of the first a).
  • the first primer portion 4a has, for example, a complementary sequence of at least five consecutive base sequences including the 3'end of the first sequence 2.
  • the first LAMP recognition sequence 4b is a nucleic acid base sequence containing a sequence (recognition sequence) to which the amplification primer binds in the amplification step (S1-4).
  • the recognition sequence may be one that is generally used in primers for LAMP amplification.
  • the first LAMP recognition sequence 4b may contain the B1 sequence, the B2 sequence, the B3 sequence, and / or the LB sequence in the order from the first primer portion 4a side toward the 5'end.
  • the concentration of RT primer 3 in the reverse transcription solution is preferably 5 to 50 nM. Within this concentration range, the specificity and efficiency of the reaction can be further improved.
  • the reverse transfer step (S1-1) it is preferable to mix the reverse transfer solution with the sample and maintain the temperature at, for example, about 10 ° C to 55 ° C.
  • the first primer portion 4a hybridizes with the first sequence 2 and reverse-transcribes the first sequence 2 to obtain a reverse transcriptase 6 containing the cDNA of the target miRNA1 (sequence 5 of the first a).
  • the dissociation step (S1-2) can be performed, for example, by heating the reaction solution after reverse transcription to 80 ° C. to 100 ° C. By maintaining this condition, the reverse transcriptase 6 and the target miRNA1 are dissociated.
  • extension step (S1-3) for example, substrates such as EL primer 7, DNA polymerase, salt and dNTP (thickening agent, pH adjusting buffer, surfactant and ions, if necessary) are reversed.
  • An extension solution containing photo product 6 is used.
  • the EL primer 7 includes a second primer portion 8a and a second LAMP recognition sequence 8b.
  • the second primer portion 8a is a nucleic acid sequence that hybridizes with the sequence 5 of the first a and acts as a primer for producing the complementary sequence 9.
  • the second primer portion 8a has, for example, a complementary sequence of at least five consecutive base sequences including the 3'end of the sequence 5 of the first a.
  • the second LAMP recognition sequence 8b is a nucleic acid base sequence containing a sequence (recognition sequence) to which the amplification primer binds in the amplification step (S1-4).
  • the second LAMP recognition sequence 8b may contain an F1 sequence, an F2 sequence, an F3 sequence and / or an LF sequence in the order from the side of the second primer portion 8a toward the 5'end.
  • the concentration of EL primer 7 in the extension solution is preferably 5 to 100 nM. Within this concentration range, the specificity and efficiency of the reaction can be further improved.
  • extension step (S1-3) it is preferable to mix the extension solution and the reaction solution containing the reverse transcriptase 6 after the dissociation step and maintain the temperature at about 10 ° C to 80 ° C.
  • the second primer portion 8a of the EL primer 7 hybridizes with the sequence 5 of the first a of the reverse transcript 6 and the EL primer 7 and the reverse transcript 6 extend using each other as a template, and the sequence 5 of the first a
  • An extension product 10 containing the complementary sequence 9 ie, the DNA sequence corresponding to the first sequence
  • the first primer part 4a and the second primer part 8a may be composed of DNA only, or may contain LNA and / or PNA. The more these are contained, the stronger the binding force of hybridization can be. Therefore, the number of LNA and / or PNA may be determined according to the desired Tm value with the sequence to be hybridized. For example, when LNA and / or PNA is included, the reverse transcription step (S1-1) and the extension step (S1-3) can be performed at a higher temperature, and non-specific binding can be suppressed. is there. As a result, the target miRNA can be reverse transcribed and elongated more accurately.
  • the first LAMP recognition sequence 4b and the second LAMP recognition sequence 8b preferably contain a recognition sequence in the combination of (1) to (7) below.
  • the order of each of the following recognition sequences is the order from the first primer portion 4a or the second primer portion 8a side toward the 5'end.
  • C means a complementary sequence of the sequence described immediately before it.
  • LBc sequence means a complementary sequence of LB sequence.
  • the "dummy sequence” is a nucleic acid sequence having a base sequence different from the first a sequence, F2 sequence, F1 sequence, LF sequence, B1 sequence, B2 sequence, LB sequence and its complementary sequence.
  • the first LAMP recognition sequence 4b contains a B2 sequence.
  • the second LAMP recognition sequence 8b includes a B1c sequence, an F1 sequence and an F2 sequence.
  • the first LAMP recognition sequence 4b contains an LBc sequence and a B2 sequence.
  • the second LAMP recognition sequence 8b includes a B1c sequence, an F1 sequence and an F2 sequence.
  • the first LAMP recognition sequence 4b contains a dummy sequence and a B2 sequence.
  • the second LAMP recognition sequence 8b includes a B1c sequence, an F1 sequence and an F2 sequence.
  • the first LAMP recognition sequence 4b contains a B1 sequence and a B2 sequence.
  • the second LAMP recognition sequence 8b comprises the F1 sequence, the LFc sequence and the F2 sequence.
  • the first LAMP recognition sequence 4b contains the B2 sequence.
  • the second LAMP recognition sequence 8b comprises the F1 sequence, the LFc sequence and the F2 sequence.
  • the first LAMP recognition sequence 4b contains an LBc sequence and a B2 sequence.
  • the second LAMP recognition sequence 8b contains an F1 sequence and an F2 sequence.
  • the first LAMP recognition sequence 4b contains a B1 sequence and a B2 sequence.
  • the second LAMP recognition sequence 8b contains the LFc sequence and the F2 sequence.
  • the spacer sequence is a nucleic acid sequence that is different from the sequence of the first a, each recognition sequence and their complementary sequence, and does not adversely affect the amplification reaction of the extension product described later.
  • the spacer sequence may be composed of DNA only or may contain LNA and / or PNA.
  • the spacer sequence is 1 to 16 bases, and is preferably a poly T sequence, a poly A sequence, or the like.
  • the amplification step (S1-4) is performed using the LAMP method.
  • an amplification solution containing a primer set for amplification, a strand-substituted DNA polymerase, a salt, a substrate such as dNTP (thickening agent, a buffer material for pH adjustment, a surfactant and an ion, if necessary) and the like. Is used.
  • the type and sequence of the amplification primer set are selected according to the sequences of the first LAMP recognition sequence 4b and the second LAMP recognition sequence 8b.
  • the amplification primer set includes FIP and BIP primers corresponding to the sequences of the first LAMP recognition sequence 4b and the second LAMP recognition sequence 8b.
  • loop primers such as F3 primer, B3 primer and / or LF primer or LB primer may be further included.
  • the amplification primer set is preferably the following combination.
  • the following (1) to (7) correspond to the above (1) to (7), respectively.
  • FIP primer containing B2 sequence and B1c sequence BIP primer containing F2 sequence and F1c sequence, and LF primer containing LF sequence.
  • FIP primer containing F2 sequence and F1c sequence BIP primer containing complementary sequence 9 of B2 sequence and sequence 1a, and LF primer containing LF sequence.
  • FIP primer containing F2 sequence and F1c sequence BIP primer containing complementary sequence 9 of B2 sequence and sequence 1a, and LB primer containing LB sequence.
  • primer sets A to D or primer sets J shown in Table 1 below as the RT primer 3, the EL primer 7, and the primer set for amplification are particularly stable over other primer sets.
  • primer set J is more stable and more preferable. Excellent stability means that when multiple detections are performed, the results are less likely to deviate, non-specific amplification is less likely to occur, and more reliable results can be obtained.
  • each primer is not limited to that shown in the above table, and one of the above sequences having a deletion, substitution, addition or insertion of one or two bases can also be used.
  • the concentrations of the FIP primer, the BIP primer, and the LB primer in the amplified solution are preferably 0.8 ⁇ M to 2.4 ⁇ M for the FIP primer and the BIP primer, and 0.4 ⁇ M to 1.2 ⁇ M for the LB primer. Within this concentration range, the specificity and efficiency of the reaction can be further improved.
  • a mixture of the solution containing the extension product 10 and the amplification solution is maintained under isothermal amplification reaction conditions.
  • the isothermal amplification condition may be an isothermal temperature of 50 to 75 ° C. for 30 to 90 minutes, but the temperature is preferably 60 to 70 ° C.
  • the extension product 10 is amplified, and an amplification product containing the cDNA of the target miRNA1 (sequence 5 of the first a) and its complementary sequence is obtained.
  • a signal that changes according to an increase in amplification products over time is detected during the amplification step (S1-4), the rise time of the signal is measured, and as a result, the target miRNA is quantified. It is preferable to do so.
  • the time-lapse may be continuous or may be detected at a plurality of time points at a desired time interval.
  • the signal for example, it is preferable to use the turbidity of the reaction solution, an optical signal from the reaction solution, an electrochemical signal, or the like.
  • an optical signal for example, it is preferable to carry out the amplification reaction in the presence of a labeling substance that produces an optical signal that changes as the amplification product increases.
  • the labeling substance is an indicator such as a fluorescent reagent or an intercalator.
  • an electrochemical signal for example, it is preferable to carry out the amplification reaction in the presence of a labeling substance that produces an electrochemical signal that changes as the amplification product increases.
  • the labeling substance is, for example, a redox probe or the like.
  • the detection is preferably performed using, for example, a detection device.
  • the detection device includes, for example, a chip.
  • the chip is an amplification detection unit that amplifies the target miRNA and detects the amplification product, and includes, for example, a substrate and one or more detection regions provided on one surface of the substrate.
  • the reverse transfer step (S1-1) to the amplification step (S1-4) can be performed on the one surface, and in the presence of the amplification product, the signal can be detected in the detection region.
  • the detection device may further include a calculation unit that calculates a quantitative value of the target miRNA from the detection result obtained by the amplification detection unit.
  • the detection area is, for example, an optical sensor.
  • the detection region is, for example, an electrode when an electrochemical signal is used.
  • the electrode is preferably gold, for example, because it has good sensitivity.
  • a reverse transcription primer for reverse transcribing the target miRNA, an extension primer for extending the target miRNA, and / or an amplification primer set for amplifying the target miRNA are freely fixed in the vicinity of the detection region. You may.
  • a nucleic acid probe may be used in the detection step (S1-5).
  • the nucleic acid probe has a sequence that hybridizes with the amplification product, and the amplification product can be detected by detecting hybridization between the nucleic acid probe and the amplification product.
  • the nucleic acid probe may be fixed in the vicinity of the detection region of the detection device.
  • the target miRNA in the sample is quantified from the rise time of the signal obtained in the detection step (S1-5). For example, it can be determined that the earlier the rise time, the higher the abundance of the target miRNA. For example, it is preferable to quantify the target miRNA in the sample by using a calibration curve showing the relationship between the rise time and the abundance of the target miRNA.
  • the target miRNA can be more specifically and efficiently reverse transcribed, elongated, amplified and detected. Therefore, by performing the quantification step (S1) of the first embodiment and the quantification step (S11) of the second embodiment in the quantification step of the third embodiment, the cancer, particularly at least one of the target cancers, is more accurately performed. It is possible to determine the presence or absence of one illness.
  • RNA extraction efficiency may vary depending on the cell type. Therefore, it is preferable that the quantified value obtained in the quantification step is corrected based on the RNA extraction efficiency before being used in the determination step.
  • the correction can be performed, for example, as follows. A known amount of standard miRNA is added to the sample in advance. For example, standard miRNA is added (spike-in) to a reagent for extracting RNA from a sample. Then, the standard miRNA is extracted together with the target miRNA, and the standard miRNA is quantified as well as the target miRNA. Then, the extraction efficiency can be evaluated from the quantitative value of the standard miRNA, and the quantitative value of the target miRNA can be corrected.
  • the standard miRNA is quantified by using a dedicated primer set, for example, by the method shown in FIG. 4 in the same manner as the quantification of the target miRNA.
  • the standard miRNA it is preferable to use a miRNA that does not exist in the subject.
  • the standard miRNA for example, cel-miR-39-3p present in C. elegans can be used.
  • Cel-miR-39-3p has the following sequence: UCACCGGGUGUAAAAUCAGCUUG (SEQ ID NO: 49) It is a miRNA having.
  • Cel-miR-39-3p can be quantified using the primer set K shown in Table 2 below.
  • each primer is not limited to that shown in the above table, and one of the above sequences having a deletion, substitution, addition or insertion of one or two bases can also be used.
  • a corrected value can be obtained by dividing the quantitative value of the target miRNA by the quantitative value of the standard miRNA. By using the correction value in the next determination step, it is possible to make a more accurate determination.
  • kits for determining the presence or absence of cancer or target cancer preferably includes, for example, any of the above RT primers 3, EL primers 7, amplification primer sets, and / or nucleic acid probes.
  • the kit preferably contains at least one selected from the primer sets A to D and J shown in Table 1 above.
  • kits may further include an RT primer, an EL primer, and an amplification primer set for other markers.
  • the kit further contains any of the primer sets E to G shown in Table 3 below.
  • the LB primer either SEQ ID NO: 25 or 26 can be used in any primer set.
  • each primer is not limited to that shown in the above table, and one of the above sequences having a deletion, substitution, addition or insertion of one or two bases can also be used.
  • hsa-miR-122-5p When hsa-miR-122-5p is used in combination, it is preferable to use the primer sets H or I shown in Table 4 below.
  • the LB primer either SEQ ID NO: 39 or 40 can be used in any primer set.
  • each primer is not limited to that shown in the above table, and one of the above sequences having a deletion, substitution, addition or insertion of one or two bases can also be used.
  • hsa-miR-92a-3p and hsa-miR-122-5p can be quantified more specifically. As a result, the detection accuracy of prostate cancer and pancreatic cancer is further improved.
  • the primer sets for other markers included in the kit are not limited to those described above, and any other primer set can be included in the kit.
  • the quantification step and kit of the third embodiment can detect and quantify the target miRNA more specifically, the detection can be detected even when the target miRNA is used for the detection of other diseases using the target miRNA as a marker. It can be done more accurately.
  • other diseases include neuropathy, dementia, hepatitis, heart disease, autoimmune diseases such as rheumatism, and the like.
  • the kit according to the third embodiment may include a primer set or a nucleic acid probe for quantifying miRNA for correction.
  • the kit may further include the primer set K shown in Table 2.
  • Example 1 Quantification of hsa-miR-1301-3p in healthy subjects and cancer patients using qRT-PCR method 29 healthy subjects, 15 breast cancer patients, 6 colon cancer patients, 5 gastric cancer patients, 3 lung cancer patients, 5 ovarian cancer patients, 8 pancreatic cancer patients, 5 bile duct cancer patients, 5 esophageal cancer patients, 5 liver cancer patients, 5 brain tumor patients, 4 bladder cancer patients, prostate cancer A total of 114 sera obtained from 5 patients, 5 sarcoma patients, 4 endometrial cancer patients, and 5 uterine sarcoma patients were prepared.
  • RNA was extracted from all sera. Extraction was performed using NucleoSpin® miRNA Plasma (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.). Synthetic RNA of cel-miR-39-3p was spike-in and extracted.
  • RNA present in the extracted sample was reverse transcribed to synthesize and amplify the cDNA.
  • Synthesis is performed according to the instruction manual of TaqMan (registered trademark) Advanced miRNA Assay (trade name, manufactured by Thermo Fisher Scientific), and TaqMan (registered trademark) Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (trade name, Thermo Fisher Scientific). Manufactured by).
  • TaqMan PCR was measured using TaqMan (registered trademark) Fast Advanced Master Mix (trade name, manufactured by Thermo Fisher Scientific) and TaqMan (registered trademark) Advanced miRNA Assay ID: 477897_mir.
  • a calibration curve was obtained by reacting with the sample in the same manner using synthetic RNAs of SEQ ID NO: 1 (10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 copies / ⁇ L) having different concentrations.
  • FIG. 5 shows a box-and-whisker plot of the correction value of the quantitative value of hsa-miR-1301-3p in healthy subjects and each cancer patient.
  • the correction values were distributed in the range of 0 to about 0.4 in healthy subjects and in the range of about 0.55 to more than about 1 in cancer patients. From this result, it was shown that the abundance of hsa-miR-1301-3p in serum was high in cancer patients.
  • FIG. 6 is a box-and-whisker plot showing the results of classifying the correction values into the healthy subject group and the cancer patient group.
  • the cancer patient group is a combination of the results of all cancer patients other than healthy subjects, and was distributed at a higher value than that of healthy subjects.
  • the AUC (Area Under Curve) that separates the healthy subject group and the cancer patient group was 0.98.
  • hsa-miR-1301-3p was shown to have high performance as a marker for distinguishing and detecting healthy subjects and cancer patients.
  • Example 2 Quantification of hsa-miR-1301-3p in healthy subjects and cancer patients using the LAMP method (quantification of hsa-miR-1301-3p) Serum obtained from the same sample as in Example 1 was prepared. RNA was extracted from the sample by the same method as in Example 1. 2 ⁇ L of the extracted sample was reverse transcribed under the conditions of a reaction volume of 20 ⁇ L, 16 ° C. for 10 minutes, 42 ° C. for 5 minutes, and 85 ° C. for 5 minutes.
  • the composition of the reverse transcription reaction solution is 67unit MultiScribe (registered trademark) Reverse Transcriptase (*), 1 ⁇ RT Buffer (*), 0.1 mM dNTPs (*), and 4U RNaseOUT (trade name, Thermo Fisher Scientific). (Manufactured by), and a 10 nM RT primer was used. Those marked with "*" were all included in the High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (trade name, manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the extension solution contained DeepVent (exo-) DNA polymerase (0.5 U, New England bio) in 25 ⁇ L and had a final concentration of 0.2 ⁇ ThermoPol Buffer (with DeepVent (exo-) DNA polymerase), 0.2 mM. It was adjusted to be an EL primer of sulfonyl 4, 0.12 mM dNTPs and 10 nM.
  • the LAMP amplification solution contains 8 U of Tin (exo-) LF DNA polymerase (Optigene) and 0.5 ⁇ L of EvaGreen® (Biotium) with final concentrations of 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 50 mM, respectively.
  • KCl 8 mM sulfonyl 4 , 10 mM (NH4) SO4, 0.1% Tween-20, 0.8 M betaine, 1.4 mM dNTPs each, 1.6 ⁇ M FIP primer, 1.6 ⁇ M BIP primer , And 0.8 ⁇ M LB primer.
  • the fluorescence intensity was measured over time with a real-time PCR device, and the time exceeding the threshold value was measured.
  • the primer set A or the primer set J in Table 1 was used as the RT primer, EL primer, FIP primer, BIP primer and LB primer.
  • RNA of SEQ ID NO: 1 at a known concentration was reverse transcribed, extended and LAMP amplified using the above primers, and the rise time of fluorescence intensity was measured in the same manner.
  • concentration of the synthetic RNA, for the primer set A 0, 10 3, 10 4, 10 5 and 10 6 copies / [mu] L, ⁇ 0, 5 for primer sets J 10 2, 5 ⁇ 10 3 , 5 ⁇ 10 4, It was 5 ⁇ 10 5 copies / ⁇ L.
  • a calibration curve of the number of copies of RNA of SEQ ID NO: 1 and the rise time was prepared, and the number of copies of RNA was calculated from the rise time of each sample using this calibration curve.
  • Cel-miR-39-3p (SEQ ID NO: 49) of the above serum sample was quantified. Extraction, lengthening and amplification of cel-miR-39-3p were carried out in the same manner as for hsa-miR-1301-3p. A 20 nM RT primer was used for reverse transcription of cel-miR-39-3p, and a 40 nM EL primer was used for lengthening. For amplification, 1.6 ⁇ M FIP primer, 1.6 ⁇ M BIP primer, and 0.8 ⁇ M LB primer were used.
  • the primer set K shown in Table 2 was used as the RT primer, EL primer, FIP primer, BIP primer and LB primer.
  • a calibration curve was prepared by reacting cel-miR-39-3p at 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 copies / [mu] L. Quantitative values of cel-miR-39-3p were obtained by comparison with the calibration curve.
  • FIG. 7 shows a box-and-whisker plot of the correction value of hsa-miR-1301-3p in healthy subjects and each cancer patient when the primer set A is used.
  • hsa-miR-1301-3p is distributed in the range of about 0.15 to about 0.55 in healthy subjects, whereas it is in the high value range of about 0.35 to about 0.95 in cancer patients. It was distributed in. It was also distributed in the higher value range of about 0.5 to about 0.95 in patients with target cancers other than uterine sarcoma. From this result, it was shown that the abundance of hsa-miR-1301-3p in serum is high in cancer patients, especially patients with target cancer.
  • FIG. 8 is a box-and-whisker plot showing the results of classifying the correction values of FIG. 7 into a healthy subject group and a cancer patient group.
  • the cancer patient group is a combination of the results of all cancer patients other than the above-mentioned healthy subjects, and was distributed at a higher value than the healthy subjects.
  • the AUC that separates the healthy subject group and the cancer patient group was 0.93.
  • FIG. 9 is a box-and-whisker plot showing the results of classifying the correction values of FIG. 10 into a target cancer patient group and a uterine sarcoma patient group.
  • the other cancer patient group was distributed at a higher value than the healthy subject group, and the target cancer patient group was distributed at a higher value than the uterine sarcoma patient group.
  • the AUC that separates the other cancer patient group from the four cancer patient groups was 0.95.
  • FIG. 10 shows the correction values of hsa-miR-1301-3p in healthy subjects and each cancer patient when the primer set J was used.
  • hsa-miR-1301-3p is distributed in the range of about 0.25 to about 0.50 in healthy subjects, whereas it is in the high value range of about 0.42 to about 0.80 in cancer patients. It was distributed in. In addition, it was distributed in a range of higher values than uterine sarcoma in patients with target cancer. From this result, it was shown that the abundance of hsa-miR-1301-3p in serum is high in cancer patients, especially patients with target cancer.
  • FIG. 11 is a box-and-whisker plot showing the results of classifying the correction values of FIG. 10 into a healthy subject group and a cancer patient group.
  • the cancer patient group is a combination of the results of all cancer patients other than the above-mentioned healthy subjects, and was distributed at a higher value than the healthy subjects.
  • the AUC that separates the healthy subject group and the cancer patient group was 0.90.
  • FIG. 12 is a box-and-whisker plot showing the results of classifying the correction values of FIG. 10 into a target cancer patient group and a uterine sarcoma patient group.
  • the other cancer patient group was distributed at a higher value than the healthy subject group, and the target cancer patient group was distributed at a higher value than the uterine sarcoma patient group.
  • the AUC that separates the uterine sarcoma group from the four cancer patient groups was 0.92.
  • hsa-miR-1301-3p is used as a marker for distinguishing and detecting a healthy person and a cancer patient, or as a marker for distinguishing and detecting a target cancer from a healthy person or a uterine sarcoma patient. It was shown to be high performance.
  • a calibration curve was prepared by quantifying a known copy number of hsa-miR-1301-3p using a plurality of types of primer sets. For amplification, the fluorescence intensity was measured over time with a real-time PCR device, and the time exceeding the threshold value was measured. The measurement was performed in duplicate, and the average value and CV of the time when the threshold value was exceeded were calculated. The quantification was repeated multiple times to evaluate the reproducibility of the calibration curve equation. Table 5 shows the results of primer set A with excellent results, and Table 6 shows the results of primer set J with better results. Calibration curves were prepared 6 times (run 1 to 6) for primer set A and 5 times (run 1 to 5) for primer set J.
  • the slope of the calibration curve in the primer set A was in the range of 2.15 to 2.72, and there was little variation. Therefore, it was revealed that the primer set A is an excellent primer set capable of quantifying miRNA more stably.
  • the slope of the calibration curve in the primer set J was 2.75 to 2.90, and the variation was further smaller than that in the primer set A. Further, in any of run 1 to 5, when the concentration of miRNA was 0 copy, the rise of fluorescence was not observed, and it was clarified that non-specific amplification was unlikely to occur. Further, in the primer set J, there is little variation when compared at the same concentration as the primer set A. For example, although the rise time when the primer set A at 106 copies there is a variation in each run, the rise time of 5 ⁇ 10 5 is less variation in each run for primer set J.
  • the primer set J is a better primer set capable of quantifying miRNA more stably.
  • Example 3 Electrochemical detection A primer solution containing the FIP primer, BIP primer (48 ⁇ M each) and LB primer (24 ⁇ M) used in Example 2 was prepared. 100 nL of primer solution was spotted on a silicone flow path packing (flow path width x height: 1 mm x 1 mm) using a micro dispenser. A DNA chip substrate (glass (0.8 mm) / titanium (500 nm) / gold (2000 nm)) in which electrodes were patterned and the flow path packing were incorporated into a cassette to prepare a chip.
  • a DNA chip substrate glass (0.8 mm) / titanium (500 nm) / gold (2000 nm)
  • Example 2 1 ⁇ L of the expanded template used in Example 2 was added to the above LAMP amplification reaction solution, and electrochemical measurement was performed under the conditions shown in Table 8.

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Abstract

実施形態によれば、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを定量することを含む、対象におけるがんの罹患の有無を判定する分析方法が提供される。

Description

分析方法及びキット
　本発明の実施形態は、分析方法及びキットに関する。
　近年、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と疾患との関係が注目されている。ｍｉＲＮＡは遺伝子発現を調節する機能を持ち、種々の疾患でその種類や発現量が初期の段階から変化していることが報告されている。即ち、ある疾患を持つ患者では、特定のｍｉＲＮＡ量が健常者と比較して増加又は減少している。そのため、被検者から採取された試料中の該ｍｉＲＮＡの量を調べることは、患者がその疾患に罹患しているか否かを知る手段となる。
　本発明が解決しようとする課題は、対象におけるがんの罹患の有無を簡便に判定することができる分析方法、キット、プライマーセット及び検出デバイスを提供することである。
　実施形態によれば、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを定量することを含む、対象におけるがんの罹患の有無を判定する分析方法が提供される。
図１は、第１実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。 図２は、第２実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。 図３は、第３実施形態の定量工程の一例を示すフローチャートである。 図４は、第３実施形態の定量工程の一例を示す模式図である。 図５は、例１の実験結果を示す箱ひげ図である。 図６は、例１の実験結果を示す箱ひげ図である。 図７は、例２のプライマーセットＡを用いた場合の実験結果を示す箱ひげ図である。 図８は、例２の実験結果を示す箱ひげ図である。 図９は、例２の実験結果を示す箱ひげ図である。 図１０は、例２のプライマーセットＪを用いた場合の実験結果を示す箱ひげ図である。 図１１は、例２の実験結果を示す箱ひげ図である。 図１２は、例２の実験結果を示す箱ひげ図である。
　以下に、図面を参照しながら実施形態の分析方法及びキットについて説明する。
　・第１実施形態
（分析方法）
　第１実施形態に従う分析方法は、図１の（ａ）に示すように、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを定量すること（定量工程（Ｓ１））を含む、対象におけるがんの罹患の有無を判定する方法である。
　がんは、悪性腫瘍、悪性新生物、癌及び肉腫をいう。がんは限定されるものではないが、例えば、前立腺がん、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん、子宮肉腫、中皮腫、咽頭がん、上顎がん、口腔がん、舌がん、口唇がん、喉頭がん、甲状腺がん、神経腫瘍、神経謬腫、神経芽細胞腫、腎細胞がん、精巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、悪性黒色腫、骨腫瘍、白血病、悪性リンパ及び多発性骨髄腫等を含む。
　がんは、何れの病期のものも含み、例えば、発生母地の臓器内にがんが留まった状態、更に周辺の組織までがんが及んだ状態、更にリンパ節へがんが転移した状態、及び更に離れた臓器へのがんの転移がある状態等を含む。
　対象は、本方法において分析に供される動物、即ち、試料を提供する動物である。対象は、何らかの疾患を有する動物であってもよいし、健常な動物であってもよい。例えば、対象は、がんに罹患している可能性がある動物、或いは過去にがんに罹患したことのある動物等であってもよい。
　対象はヒトであることが好ましい。或いは、対象は他の動物であってもよい。他の動物は、例えば哺乳動物であり、例えば、サル等の霊長類、マウス、ラット又はモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ又はウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ又はブタ等の家畜動物、或いは展示動物等に属する動物を含む。
　対象由来の試料とは、対象から採取された試料又はそれを適切に処理した試料等を含む。試料は、好ましくは、血清である。試料は、その他の体液、例えば、血液、血漿、白血球、間質液、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、鼻腔内粘膜、鼻水、咽頭粘膜、喀痰、消化液、胃液、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、精液又は膣液等であってもよい。或いは、試料は、組織又は細胞等であってもよく、対象から採取され、培養された組織又は細胞、或いはその上清であってもよい。
　以下、第１実施形態の分析方法の手順の一例について説明する。
　まず、対象由来の試料を用意する。試料は、その種類に従う一般的な方法を用いて採取することができる。試料は、採取後そのまま使ってもよいし、核酸の定量のための反応を阻害しない状態又は反応により適した状態となるように処理してもよい。処理は、例えば、細切、ホモジナイズ、遠心、沈殿、抽出及び／又は分離等であり、公知の何れかの手段により行うことができる。
　例えば、抽出は、市販の核酸抽出キットを用いて行ってもよい。核酸抽出キットとして、例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　ｍｉＲＮＡ　Ｐｌａｓｍａ（タカラバイオ製）、Ｑｕｉｃｋ－ｃｆＲＮＡ　Ｓｅｒｕｍ　＆　Ｐｌａｓｍａ　Ｋｉｔ（ザイモリサーチ製）、ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ　キット（キアゲン製）、ｍｉＲＶａｎａ　ＰＡＲＩＳ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）、Ｐｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ　ＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｎｏｒｇｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製)、ｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）　ＳＰ　Ｋｉｔ(和光純薬)、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ｍｉＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ製）等を用いることができる。或いは、市販のキットを使用せずに、例えば、試料を緩衝液で希釈し、８０～１００℃の加熱処理を行い、遠心分離し、その上清を採取することによって抽出を行ってもよい。
　次に、試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量を行う（定量工程（Ｓ１））。ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐは、下記の配列：
ＵＵＧＣＡＧＣＵＧＣＣＵＧＧＧＡＧＵＧＡＣＵＵＣ（配列番号１）
を有するｍｉＲＮＡである。以下、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを「標的ｍｉＲＮＡ」とも称する。
　定量工程（Ｓ１）は、ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡ等の短鎖のＲＮＡを定量するための一般的な方法を用いて行うことができる。その方法は限定されるものではないが、例えば、標的ｍｉＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を検出及び定量することが好ましい。増幅には、例えば、ＰＣＲ法、ｑＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等を用いることができる。検出及び定量は、増幅の後に行われてもよいし、増幅中に経時的に行われてもよい。検出及び定量には、例えば、濁度若しくは吸光度に基づく信号を用いる測定法、光学的信号を用いる測定法又は電気化学的信号を用いる測定法、或いはこれらの組み合わせ等を用いることができる。例えば、増幅産物量に応じて得られる上記信号の強度又は変化量、或いは信号が閾値に達するまでの時間（立ち上がり時間）又はＰＣＲ法を用いる場合はサイクル数（立ち上がりサイクル数）等の検出結果から標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことができる。
　標的ｍｉＲＮＡの定量値は、上記信号の検出結果と標的ｍｉＲＮＡの存在量との関係を表す検量線を用いて決定され得る。検量線は、異なる既知の濃度で標的ｍｉＲＮＡを含む複数の標準試料について信号の検出を行うことにより作成することができる。この検量線と、対象由来の試料について得られた信号の検出結果とを比較することによって、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量が算出され得る。例えば、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量は、試料の単位量当たりの標的ｍｉＲＮＡのコピー数として得られ得る。
　定量工程（Ｓ１）は、例えば、市販のキットを用いて行ってもよい。市販のキットの例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍｉＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ（サーモフィッシャー製、ＩＤ：４７７８２７＿ｍｉｒ）、ｍｉＲＣＵＲＹ　ＬＮＡ　ｍｉＲＮＡ　ＰＣＲ　Ａｓｓａｙｓ（キアゲン製、カタログＮｏ．ＹＰ０２１０３１３２）、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ　ｑＰＣＲ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ検出システム（オリジンテクノロジーズ製）等であり、標的ｍｉＲＮＡを特異的に増幅するプライマーとともに用いられ得る。
　より好ましい定量工程（Ｓ１）の例については、第３実施形態で説明する。
　定量工程（Ｓ１）で得られた標的ｍｉＲＮＡの定量値は、対象におけるがんの罹患の有無を判定するために用いることができる。
　例えば、第１実施形態の分析方法は、図１の（ｂ）に示す通り、定量工程（Ｓ１）の後に行われ得る判定工程（Ｓ２）を更に含み得る。判定工程（Ｓ２）では、標的ｍｉＲＮＡの定量値が高い場合に対象ががんに罹患していると判定する。反対に、定量値が低い場合に対象はがんに罹患していないと判定され得る。定量値の高低は、例えば、予め得られた対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値又は閾値等を基準として判定される。例えば、定量値がそれらよりも高い場合には、対象ががんに罹患していると判定され得る。
　対照とは、例えば、健常体である。健常体とは、少なくともがんに罹患していない個体をいう。健常体は、疾患や異常を有さない健康な個体であることが好ましい。対照として選択される個体は、本方法で分析される対象とは別の個体であってもよいが、同じ種に属する個体、即ち対象がヒトであればヒトであることが好ましい。また、対照の年齢、性別及び身長体重等の身体的条件又は人数は特に限定されるものではないが、身体的条件は、本分析方法で検査を受ける対象のものと同じ又は類似であることが好ましい。
　対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値は、例えば、対照由来の同じ又は類似の試料を用いて、定量工程（Ｓ１）で用いられるのと同じ方法を用いて得られた標的ｍｉＲＮＡの定量値である。
　閾値は、例えば、がんに罹患している対象における定量値と、がんに罹患していない対照における定量値とを切り分けることができる標的ｍｉＲＮＡの定量値である。閾値は、例えば、がんに罹患しているか否かが既知である標準対象由来の同じ若しくは類似の試料又はがんの株化細胞を含む試料等を用いて、定量工程（Ｓ１）で用いられるのと同様の方法によって得られた標的ｍｉＲＮＡの定量値から決定することができる。閾値は限定されるものではなく、用いられる定量方法、試料の種類及び測定条件等に従って決定され得る。
　或いは、閾値は対象ごとに決定されてもよい。例えば、健康診断等で定期的に測定される対象の健常なときの標的ｍｉＲＮＡ定量値をモニターしていれば、それを閾値として用いることにより、それより定量値が高いときにがんに罹患している可能性ありとしてアラームを出すことができる。閾値は個人ごとに異なり得る。例えば、通常標的ｍｉＲＮＡの定量値が約１０３コピーで推移していた対象Ａにおいて、あるとき１０４コピーとなった場合がんの可能性ありとすることができる。一方で、約１０２コピーで推移していた対象Ｂにおいては、あるとき１０３コピーとなった場合にがんの可能性ありとすることができる。
　対照における定量値又は閾値は文献等の過去の知見から決定してもよい。
　ここで、罹患しているとは、罹患している可能性が高いことも含む。反対に、罹患していないとは、罹患している可能性が低いことも含む。
　更なる実施形態によれば、がんに罹患していると判定することは、対象におけるがんの予後又は再発を判定することも含む。例えば、分析方法は、図１の（ｃ）に示すように、定量工程（Ｓ１）の後、定量の結果から対象におけるがんの予後又は再発の有無を判定する判定工程（Ｓ３）を含む。判定工程（Ｓ３）においては、例えば、定量値が高い場合には、対象におけるがんの予後が不良である、又はがんが再発している、或いはその可能性が高いと判定することが可能である。予後、再発の判定にも上記対照における定量値、閾値を用いることができる。特に対象ごとに決定された閾値を用いることが好ましい場合もあり得る。
　また、判定工程（Ｓ２）及び／又は判定工程（Ｓ３）の後、判定結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択することも可能である。例えば、分析方法は、図１の（ｄ）に示すように、判定工程（Ｓ２）及び／又は判定工程（Ｓ３）の後、判定結果から対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程（Ｓ４）を含む。ここで治療法又は薬剤は、がんの治療のためのものである。治療法の種類又は薬剤の種類は、治療法又は薬剤の使用量、タイミング若しくは期間を含む。
　以上に説明した第１実施形態の分析方法によれば、１種類の標的ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐ）を定量することにより、簡便に対象におけるがんの罹患の有無を判定することが可能である。言い換えれば、本方法によればがんに罹患した対象とがんに罹患していない対象とを簡単に識別することができる。
　特に、実施形態の分析方法は、健康診断等で容易に採取できる血清を用いることが可能であるため、がんを早期に発見することができる。血清等を用いることで、細胞診等と比較して対象の肉体的及び経済的負担を大きく軽減することができるとともに、手順が容易であるため検査者にとっても負担が少ない。また、血清は、そこに含まれるｍｉＲＮＡ濃度が安定しているため、より正確な検査を行うことが可能である。
　更なる実施形態によれば、対象由来の試料中の標的ｍｉＲＮＡを定量すること（定量工程（Ｓ１））を含む、対象におけるがんの罹患の有無を判定を補助するための分析方法も提供される。
　「判定を補助する」とは、例えば、対象ががんに罹患している可能性に関する情報を取得することを含む。「情報」とは、例えば、定量工程（Ｓ１）で得られる定量値であり得る。本方法によれば、対象におけるがんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うためのより精度の高い情報を取得することができる。
　更なる実施形態によれば、本分析方法は、対象由来でない試料中におけるがん細胞の検出等にも使用することができる。例えば、がん細胞を人工的に製造する場合に、製造された細胞含有溶液中にがん細胞が存在するか否かを確かめる際等にも使用することができる。
　（マーカー）
　第１実施形態によれば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを含む、がん検出用マーカーが提供される。
　ここで、「マーカー」は、試料中のその有無又は濃度を検出することで、試料及び／又はその由来となる対象が特定の状態であるか否かを判定することのできる物質をいう。
　第１実施形態のがん検出用マーカーは、例えば、対象由来の試料中のその存在量（定量値）を測定することで、上記したように対象におけるがんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うことができる。
　（キット）
　第１実施形態によれば、がん検出用キットが提供される。
　当該キットは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを逆転写するための逆転写用（ＲＴ）プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを伸長するための伸長用（ＥＬ）プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを増幅するための増幅用プライマーセット及びｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む。
　ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを得るためのプライマーである。ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１部の配列に相補的な配列を含む。ＲＴプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅しやすくするｃＤＮＡに付加する人工配列を更に含んでもよい。
　ＥＬプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡを増幅しやすくするために、ｃＤＮＡに人工配列を付加するためのプライマーである。ＥＬプライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡの少なくとも１部の配列に相補的な配列と、ｃＤＮＡの伸長用に付加する配列とを含み得る。
　増幅用プライマーセットは、例えばＰＣＲ法用であり、少なくともフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む。或いは増幅用プライマーセットはＬＡＭＰ法用であり、少なくともＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーを含む。必要に応じて、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー及び／又はループプライマーを含んでもよい。
　増幅用プライマーセットに含まれる各プライマーは、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ又はその相補配列と結合するように設計されてもよいし、ＲＴプライマー及び／又はＥＬプライマーによって付加された人工配列と結合するように設計されてもよい。ＲＴプライマー、ＥＬプライマー及び増幅用プライマーセットの好ましい配列については、第３実施形態で説明する。
　核酸プローブは、標的ｍｉＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、或いはその増幅産物の少なくとも１部の配列又はその相補配列を有し得る。
　キットに含まれる上記核酸は、個別に又は何れかが組み合わされて適切な担体とともに容器に収容されて提供されてもよい。適切な担体は、例えば、水、生理的溶液又は緩衝液等である。容器は、例えば、チューブ又はマイクロタイタープレート等である。或いは、これら核酸はマイクロ流体チップ等の固相に固定されて提供されてもよい。
　キットは、上記核酸の他に、逆転写、伸長及び／又は増幅に用いられる試薬、例えば酵素、基質及び／又は検出に用いられる光学的信号又は電気的化学信号を生じる標識物質等を含んでもよい。標識物質は、例えば、ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎやＥＶＡ　Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ　８２などの蛍光色素、電流検出する場合はルテニウムヘキサアミンなどの金属錯体等の指示薬である。
　キットは、例えば、上記のように対象におけるがんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、治療法の種類又は薬剤の種類の選択等に使用することができる。
　更なる実施形態によれば、がん検出用キットは、がんの診断用組成物又は診断薬として提供される。また、実施形態によれば、がんの診断用組成物又はがんの診断薬の製造における上記核酸の少なくとも１種の使用も提供される。
　・第２実施形態
　（分析方法）
　第２実施形態の分析方法は、図２の（ａ）に示すように、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを定量すること（定量工程（Ｓ１１））を含む、対象における乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つの罹患の有無を判定する方法である。
　乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんを、以下ではまとめて「標的がん」とも称する。
　定量工程（Ｓ１１）は、第１実施形態の定量工程（Ｓ１）同様に行うことができるが、増幅はＬＡＭＰ法を用いて行われ得る。対象及び試料は、第１実施形態と同様とすることができるが、対象は標的がんの少なくとも１つに罹患している可能性がある動物、或いは過去に標的がんの少なくとも１つに罹患したことのある動物等であってもよい。
　定量工程（Ｓ１１）で得られた標的ｍｉＲＮＡの定量結果は、対象における標的がんの少なくとも１つを検出するために用いることができる。
　例えば、第２実施形態に従う分析方法は、図２の（ｂ）に示すように定量工程（Ｓ１１）の後に行われ得る判定工程（Ｓ１２）を更に含み得る。判定工程（Ｓ１２）では、標的ｍｉＲＮＡの定量値が高い場合に、対象は、標的がんの少なくとも１つに罹患していると判定され得る。定量値の高低は、例えば、予め得られた対照における標的ｍｉＲＮＡの定量値又は閾値等を基準として判定される。
　第２実施形態において対照は、例えば、標的がんの何れにも罹患していない個体をいう。対照は、健常体や他の疾患を罹患する個体であってもよいが、他のがんに罹患した個体であることが好ましい。他のがんは、標的がん以外に分類されるがんである。他のがんは例えば子宮肉腫である。
　閾値は、例えば、標的がんに罹患している対象における定量値と、標的がんに罹患していない対照における定量値とを切り分けることができる標的ｍｉＲＮＡの定量値であるが、標的がんに罹患している対象における定量値と、子宮肉腫に罹患している対照における定量値とを切り分けることができる定量値であることが好ましい。閾値は、例えば、がんに罹患しているか否か又は罹患しているがんの種類が既知である標準対象由来の同じ若しくは類似の試料又は標的がんの株化細胞を含む試料等から得られた標的ｍｉＲＮＡ定量値から決定することができる。閾値は限定されるものではなく、用いられる定量方法、試料の種類及び測定条件等に従って決定され得る。
　対照における定量値又は閾値は文献等の過去の知見から決定してもよい。
　定量工程（Ｓ１１）で得られた定量値が高い場合に、対象は、子宮肉腫ではなく、標的がんの少なくとも１つに罹患していると判定することができる。言い換えれば、本分析方法によれば、標的がんに罹患した対象と、子宮肉腫に罹患した対象又はがんに罹患していない対象とを識別することが可能である。
　判定工程（Ｓ１２）を子宮肉腫の対照の定量値及び／又は標的がんと子宮肉腫とを切り分けるための閾値を基準として行うことにより、標的がんの罹患の有無を、子宮肉腫がんとより正確に識別して判定することができる。
　以上に説明した第２実施形態の分析方法によれば、１種類の標的ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐ）を定量することにより、簡便に対象における標的がんの少なくとも１つの罹患の有無を判定することが可能である。
　第２実施形態の分析方法は、図２の（ｃ）に示すように、定量工程（Ｓ１１）の後、定量結果から対象における標的がんの予後又は再発の有無を判定する判定工程（Ｓ１３）を含んでもよい。また、判定工程（Ｓ１２）及び／又は判定工程（Ｓ１３）の後に、その結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程（Ｓ１４）を含んでもよい。
　更なる実施形態によれば、対象由来の試料中の標的ｍｉＲＮＡを定量すること（定量工程（Ｓ１１））を含む、対象における標的がんの少なくとも１つの罹患の有無の判定を補助するための分析方法も提供される。本方法によれば、対象における標的がんの罹患の有無判定、予後判定、再発の有無判定、又は対象に適用される治療法若しくは薬剤の選択等を行うためのより精度の高い情報を取得することができる。
　第２実施形態によれば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを含む、標的がん検出用マーカーも提供される。
　第２実施形態によれば、標的がん検出用キットも提供される。第２実施形態に係るキットは、第１実施形態に説明したものと同様の核酸を含むが、プライマーセットはＬＡＭＰ法用のものであり得る。キットは、定量工程に必要な試薬を更に含んでもよい。第２実施形態に係るキットは、標的がんの少なくとも１つを検出するための診断用組成物又は診断薬として提供されてもよい。また第２実施形態によれば当該診断用組成物又は診断薬の製造における上記核酸の少なくとも１種の使用も提供される。
　ＬＡＭＰ法によって得られたｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量値は、標的がんをユニバーサルに検出するために用いることができる。例えば、対象から得られた細胞においてｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量値が閾値以上であった場合、対象は標的がんの少なくとも１つに罹患していると判定することができる。更に各標的がんに特異的な他のマーカーを定量することにより、対象が標的がんのうち何れに罹患しているかを更に正確に判定することも可能である。
　他のマーカーは、例えば、標的がんの少なくとも１つを検出するための、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐ以外のマーカーである。
　例えば、前立腺がんで発現量の多いｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐを併用することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐは次の配列：
ＵＡＵＵＧＣＡＣＵＵＧＵＣＣＣＧＧＣＣＵＧＵ（配列番号２）
を有するｍｉＲＮＡである。標的ｍｉＲＮＡとｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐとの両方の定量値が高いとき、対象が前立腺がんに罹患していると判定することができる。
　また、膵臓がんで発現量の多いｈｓａ－ｍｉＲ－１２２ａ－５ｐを併用することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２ａ－５ｐは次の配列：
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ（配列番号３）
を有するｍｉＲＮＡである。標的ｍｉＲＮＡとｈｓａ－ｍｉＲ－１２２ａ－５ｐとの両方の定量値が高いとき、対象が膵臓がんに罹患していると判定することができる。
　他のマーカーの定量値は、定量工程（Ｓ１）と同様の方法で取得することが好ましい。
　他のマーカーは上記のものに限定されるものではなく、標的がんの何れかを検出するためのマーカーとして知られる何れのマーカーも使用することが可能である。他のマーカーはｍｉＲＮＡでなくともよく、ＤＮＡ、ペプチド又はタンパク質等であってもよい。
　この例におけるキットは、上記他のマーカーを検出するためのＲＴプライマー、ＥＬプライマー、増幅用プライマーセット及び／又は核酸プローブを更に含んでもよい。
　・第３実施形態
　第３実施形態では、標的ｍｉＲＮＡを定量する工程の好ましい一例について説明する。この例においては、標的ｍｉＲＮＡを特異的に逆転写し、人工配列を付加して伸長し、伸長産物をＬＡＭＰ法により増幅し、得られた増幅産物を検出する。以下では、標的ｍｉＲＮＡの配列（配列番号１）を「第１の配列」とも称する。
　定量工程（Ｓ１）は、例えば、図３に示す次の工程を含む：
（Ｓ１－１）標的ｍｉＲＮＡの第１の配列とハイブリダイズする第１プライマー部及び第１ＬＡＭＰ認識配列を含む逆転写用（ＲＴ）プライマーの、第１プライマー部を第１の配列とハイブリダイズさせ、第１の配列を逆転写し、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ（第１ａの配列）を含む逆転写産物を得る逆転写工程、
（Ｓ１－２）逆転写産物と標的ｍｉＲＮＡとを解離させる解離工程、
（Ｓ１－３）第１ａの配列とハイブリダイズする第２プライマー部、及び第２ＬＡＭＰ認識配列を含む伸長用（ＥＬ）プライマーの第２プライマー部を逆転写産物の第１ａの配列とハイブリダイズさせ、ＥＬプライマー及び逆転写産物を、互いを鋳型として伸長させて、第１ａの配列５の相補配列（即ち、第１の配列に対応するＤＮＡ配列）を含む伸長産物を得る伸長工程、
（Ｓ１－４）伸長産物をＬＡＭＰ反応により増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
（Ｓ１－５）得られた増幅産物を検出する検出工程。
　以下、各工程について、図４を用いて詳細に説明する。
　逆転写工程（Ｓ１－１）には、例えば、ＲＴプライマー３、逆転写酵素、塩及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等の基質（必要に応じて反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン及び／又は逆転写酵素の補因子となるイオン）等を含む逆転写溶液が用いられる。逆転写酵素として、例えば、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、トランスクリプター逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）トランスクリプター逆転写酵素、又はＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素等を用いることができる。
　ＲＴプライマー３は、第１プライマー部４ａ及び第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂを含む。第１プライマー部４ａは、第１の配列２とハイブリダイズして、第１の配列２を逆転写してｃＤＮＡ（第１ａの配列５）を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。第１プライマー部４ａは、例えば、第１の配列２の３’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列の相補配列を有する。
　第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂは、増幅工程（Ｓ１－４）において増幅用プライマーが結合する配列（認識配列）を含む核酸塩基配列である。認識配列は、一般にＬＡＭＰ増幅用のプライマーにおいて用いられるものであってもよい。例えば、第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂは、第１プライマー部４ａ側から５’末端に向かう順番で、Ｂ１配列、Ｂ２配列、Ｂ３配列及び／又はＬＢ配列を含んでもよい。
　逆転写溶液中におけるＲＴプライマー３の濃度は、５～５０ｎＭであることが好ましい。この濃度範囲であることによって反応の特異性及び効率をより向上させることができる。
　逆転写工程（Ｓ１－１）においては、逆転写溶液と試料と混合し、例えば約１０℃～５５℃に維持することが好ましい。それによって、第１プライマー部４ａが第１の配列２とハイブリダイズし、第１の配列２を逆転写し、標的ｍｉＲＮＡ１のｃＤＮＡ（第１ａの配列５）を含む逆転写産物６が得られる。
　解離工程（Ｓ１－２）は、例えば、逆転写後の反応液を８０℃～１００℃に加熱することによって行うことができる。この条件に維持することによって、逆転写産物６と標的ｍｉＲＮＡ１とが解離する。
　伸長工程（Ｓ１－３）には、例えば、ＥＬプライマー７、ＤＮＡポリメラーゼ、塩及びｄＮＴＰ等の基質（必要に応じて増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤及びイオン）等を、逆転写産物６を含む伸長溶液が用いられる。
　ＥＬプライマー７は、第２プライマー部８ａ、及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂを含む。第２プライマー部８ａは、第１ａの配列５とハイブリダイズして、その相補配列９を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。第２プライマー部８ａは、例えば、第１ａの配列５の３’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列の相補配列を有する。
　第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂは、増幅工程（Ｓ１－４）において増幅用プライマーが結合する配列（認識配列）を含む核酸塩基配列である。例えば、第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂは、第２プライマー部８ａ側から５’末端に向かう順番で、Ｆ１配列、Ｆ２配列、Ｆ３配列及び／又はＬＦ配列を含んでもよい。
　伸長溶液中におけるＥＬプライマー７の濃度は、５～１００ｎＭであることが好ましい。この濃度範囲であることによって反応の特異性及び効率をより向上させることができる。
　伸長工程（Ｓ１－３）においては、伸長溶液と解離工程後の逆転写産物６を含む反応液とを混合し約１０℃～８０℃に維持することが好ましい。それによって、ＥＬプライマー７の第２プライマー部８ａが逆転写産物６の第１ａの配列５とハイブリダイズし、ＥＬプライマー７及び逆転写産物６が互いを鋳型として伸長し、第１ａの配列５の相補配列９（即ち、第１の配列に対応するＤＮＡ配列）を含む伸長産物１０が得られる。
　第１プライマー部４ａ、第２プライマー部８ａは、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。これらを多く含むほどハイブリダイゼーションの結合力を強くすることができる。従って、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡの数は、ハイブリダイゼーションさせる配列との所望のＴｍ値に従って決定されればよい。例えば、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含ませると、より高い温度で逆転写工程（Ｓ１－１）及び伸長工程（Ｓ１－３）を行うことができ、非特異的な結合を抑制することが可能である。その結果より精度よく標的ｍｉＲＮＡを逆転写及び伸長することが可能である。
　第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂ及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂは、下記の（１）～（７）の組み合わせで認識配列を含むことが好ましい。ここで、下記の各認識配列の順番は、第１プライマー部４ａ又は第２プライマー部８ａ側から５’末端に向かう順番である。「ｃ」は、その直前に記載された配列の相補配列を意味する。例えば、「ＬＢｃ配列」は、ＬＢ配列の相補配列を意味する。「ダミー配列」は、第１ａの配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、ＬＦ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列、ＬＢ配列及びその相補配列とは異なる塩基配列を有する核酸配列である。
（１）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ２配列を含み、
　　　第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
　　　（この場合、第１ａの配列の相補配列９の少なくとも１部をＬＢ配列とする。）
（２）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
　　　第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（３）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはダミー配列及びＢ２配列を含み、
　　　第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（４）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ１配列及びＢ２配列を含み、
　　　第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（５）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ２配列を含み、
　　　第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（６）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
　　　第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＦ１配列及びＦ２配列を含む。
（７）第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂはＢ１配列及びＢ２配列を含み、
　　　第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂはＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
　ＲＴプライマー３の第１プライマー部４ａと第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂとの間、ＥＬプライマー７の第２プライマー部８ａと第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂとの間、及び／又は各ＬＡＭＰ認識配列に含まれる各認識配列の間には、スペーサー配列が存在していてもよい。スペーサー配列は、第１ａの配列、各認識配列及びそれらの相補配列の配列とは異なり、かつ後述する伸長産物の増幅反応に悪影響を与えない核酸配列である。スペーサー配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。例えば、スペーサー配列は、１塩基～１６塩基であり、ポリＴ配列又はポリＡ配列等であることが好ましい。
　増幅工程（Ｓ１－４）は、ＬＡＭＰ法を用いて行われる。この工程においては、例えば、増幅用プライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、塩及びｄＮＴＰ等の基質（必要に応じて増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤及びイオン）等を含む増幅溶液が用いられる。
　増幅用プライマーセットの種類及び配列は、第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂ及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂの配列に従って選択される。例えば、増幅用プライマーセットは、第１ＬＡＭＰ認識配列４ｂ及び第２ＬＡＭＰ認識配列８ｂの配列に対応するＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーを含む。必要であれば、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー及び／又はＬＦプライマー若しくはＬＢプライマー等のループプライマーを更に含んでもよい。
　ＲＴプライマー３、及びＥＬプライマー７のＬＡＭＰ認識配列の組み合わせを上記（１）～（７）とする場合、増幅用プライマーセットは、以下の組み合わせとすることが好ましい。なお、下記（１）～（７）は、上記（１）～（７）にそれぞれ対応するものである。
（１）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー、
　　　Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
　　　第１ａの配列の相補配列９を含むＬＢプライマー。
（２）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
　　　Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
　　　ＬＢ配列を含むＬＢプライマー。
（３）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
　　　Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
　　　第１ａの配列の相補配列９を含むＬＢプライマー。
（４）Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
　　　Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
　　　ＬＦ配列を含むＬＦプライマー。
（５）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
　　　Ｂ２配列及び第１ａの配列の相補配列９を含むＢＩＰプライマー、及び
　　　ＬＦ配列を含むＬＦプライマー。
（６）Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマー
　　　Ｂ２配列及び第１ａの配列の相補配列９を含むＢＩＰプライマー、及び
　　　ＬＢ配列を含むＬＢプライマー。
（７）Ｆ２配列及び第１ａの配列５を含むＦＩＰプライマー
　　　Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマー、及び
　　　ＬＦ配列を含むＬＦプライマー。
　上記（１）の組み合わせとする場合がより好ましい。また、上記（１）の組み合わせとする場合、ＲＴプライマー３、ＥＬプライマー７、増幅用プライマーセットとして、例えば、以下の表１に示すプライマーセットＡ～Ｄ又はプライマーセットＪを用いることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　特に、プライマーセットＡ又はＪを用いることが好ましい。これらのプライマーセットは他のプライマーセットよりも特に安定性に優れている。プライマーセットＪはより安定性に優れており、より好ましい。安定性に優れているとは、複数回検出行った場合結果にずれが生じにくく、また非特異的増幅が起こりにくく、より信頼性の高い結果が得られることをいう。
　各プライマーの配列は上記表に示すものに限定されるものではなく、上記配列のうち１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも使用することができる。
　ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＢプライマーの増幅溶液中の濃度は、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーは０．８μＭ～２．４μＭ、ＬＢプライマーは、０．４μＭ～１．２μＭであることが好ましい。この濃度範囲であることによって反応の特異性及び効率をより向上させることができる。
　増幅工程（Ｓ１－４）においては、伸長産物１０を含む溶液と、増幅溶液との混合物を等温増幅反応条件下で維持する。例えば、等温増幅条件は、温度５０～７５℃の等温を３０～９０分間などとすればよいが、温度は、６０～７０℃であることが好ましい。それにより伸長産物１０が増幅され、標的ｍｉＲＮＡ１のｃＤＮＡ（第１ａの配列５）及びその相補配列を含む増幅産物が得られる。
　検出工程（Ｓ１－５）は、増幅工程（Ｓ１－４）中に経時的に増幅産物の増加に応じて変化する信号を検出し、信号の立ち上がり時間を測定し、その結果標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことが好ましい。経時的とは、連続的であってもよいし、所望の時間間隔で複数の時点で検出することであってもよい。
　信号として、例えば反応液の濁度、又は反応液からの光学的信号若しくは電気化学的信号等を用いることが好ましい。光学的信号を用いる場合、例えば、増幅産物の増加に応じて変化する光学的信号を生ずる標識物質の存在下で増幅反応を行うことが好ましい。この場合、標識物質は、例えば蛍光試薬又はインターカレータ等の指示薬である。電気化学的信号を用いる場合、例えば、増幅産物の増加に応じて変化する電気化学的信号を生ずる標識物質の存在下で増幅反応を行うことが好ましい。この場合、標識物質は、例えばレドックスプローブ等である。
　検出は、例えば、検出用デバイスを用いて行うことが好ましい。検出用デバイスは、例えばチップを含む。チップは、標的ｍｉＲＮＡを増幅し、増幅産物を検出する増幅検出部であり、例えば、基板と、基板の１つの面上に備えられた１つ以上の検出領域とを備える。例えば、前記１つの面上で逆転写工程（Ｓ１－１）～増幅工程（Ｓ１－４）を行うことができ、増幅産物が存在すると、検出領域で信号を検出することができる。また、検出デバイスは増幅検出部で得られた検出の結果から標的ｍｉＲＮＡの定量値を算出する算出部を更に備え得る。
　検出領域は、光学的信号を用いる場合、例えば光学センサである。検出領域は、電気化学的信号を用いる場合、例えば電極である。電極は、例えば金であれば感度が良好であるため好ましい。
　検出領域の付近には標的ｍｉＲＮＡを逆転写するための逆転写用プライマー、標的ｍｉＲＮＡを伸長するための伸長用プライマー及び／又は標的ｍｉＲＮＡを増幅するための増幅用プライマーセットが遊離可能に固定されていてもよい。
　また、検出工程（Ｓ１－５）には、核酸プローブを用いてもよい。核酸プローブは増幅産物とハイブリダイズする配列を有し、核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションを検出することにより、増幅産物を検出することができる。例えば、上記検出用デバイスの検出領域付近に核酸プローブが固定されていてもよい。
　次に、検出工程（Ｓ１－５）で得られた信号の立ち上がり時間から試料中の標的ｍｉＲＮＡを定量する。例えば、立ち上がり時間が早いほど標的ｍｉＲＮＡの存在量が多いと決定することができる。例えば、立ち上がり時間と標的ｍｉＲＮＡの存在量との関係を表す検量線を用いて、試料中の標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことが好ましい。
　以上に説明した第３実施形態の定量工程によれば、標的ｍｉＲＮＡをより特異的かつ効率的に逆転写し、伸長し、増幅し、検出することができる。したがって、第１実施形態の定量工程（Ｓ１）及び第２実施形態の定量工程（Ｓ１１）を第３実施形態の定量工程で行うことにより、より精度よくがん、特に、標的がんの少なくとも１つの罹患の有無を判定することが可能である。
　更なる実施形態において、ＲＮＡの抽出効率は細胞の種類によって異なる場合がある。そのため、定量工程で得られた定量値は判定工程に用いる前にＲＮＡ抽出効率に基づいて補正することが好ましい。補正は例えば次のように行うことができる。予め試料に既知の量の標準ｍｉＲＮＡを添加する。例えば試料からＲＮＡを抽出するための試薬に標準ｍｉＲＮＡを添加（ｓｐｉｋｅ－ｉｎ）する。その後、標的ｍｉＲＮＡとともに標準ｍｉＲＮＡを抽出し、標的ｍｉＲＮＡの定量とともに標準ｍｉＲＮＡの定量も行う。その後、標準ｍｉＲＮＡの定量値から抽出効率を評価し、標的ｍｉＲＮＡの定量値を補正することができる。
　標準ｍｉＲＮＡの定量は専用のプライマーセットを用いて例えば図４に示す方法で標的ｍｉＲＮＡの定量と同じように行うことが好ましい。
　標準ｍｉＲＮＡは、対象に存在しないｍｉＲＮＡを用いることが好ましい。標準ｍｉＲＮＡとして例えば線虫に存在するｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐを用いることができる。ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐは次の配列：
ＵＣＡＣＣＧＧＧＵＧＵＡＡＡＵＣＡＧＣＵＵＧ（配列番号４９）
を有するｍｉＲＮＡである。
　ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐは下記表２に記載のプライマーセットＫを用いて定量することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　各プライマーの配列は上記表に示すものに限定されるものではなく、上記配列のうち１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも使用することができる。
　例えば標的ｍｉＲＮＡの定量値を標準ｍｉＲＮＡの定量値で除することによって補正値が得られる。補正値を次の判定工程に使用することによって、より正確な判定を行うことが可能である。
　第３実施形態の方法においてもがん、又は標的がんの罹患の有無を判定するためのキットが提供される。このキットは、例えば、上記の何れかのＲＴプライマー３、ＥＬプライマー７、増幅用プライマーセット、及び／又は核酸プローブを含むことが好ましい。例えば、キットは、上記表１に示すプライマーセットＡ～Ｄ及びＪから選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。
　また、第３実施形態の方法においても、第２実施形態において説明した他のマーカーを併用することができる。その場合、他のマーカーも第３実施形態の方法で定量することが好ましい。また、その場合、キットは、他のマーカーのためのＲＴプライマー、ＥＬプライマー、増幅用プライマーセットを更に含んでもよい。
　例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐを併用する場合、キットは、以下の表３に記載のプライマーセットＥ～Ｇの何れかを更に含むことが好ましい。ＬＢプライマーについては、何れのプライマーセットにおいても配列番号２５又は２６のどちらかを用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　各プライマーの配列は上記表に示すものに限定されるものではなく、上記配列のうち１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも使用することができる。
　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを併用する場合、以下の表４に記載のプライマーセットＨ又はＩを用いることが好ましい。ＬＢプライマーについては、何れのプライマーセットにおいても配列番号３９又は４０のどちらかを用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　各プライマーの配列は上記表に示すものに限定されるものではなく、上記配列のうち１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも使用することができる。
　表３及び４に示すプライマーセットを用いれば、より特異的にｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量することができる。それにより、前立腺がん及び膵臓がんの検出精度がより向上する。キットに含ませる他のマーカーのためのプライマーセットは上記のものに限定されるものではなく、他の何れのプライマーセットもキットに含ませることが可能である。
　或いは、第３実施形態の定量工程及びキットは、標的ｍｉＲＮＡをより特異的に検出及び定量することが可能であるため、標的ｍｉＲＮＡをマーカーとして用いる他の疾患の検出に用いた場合もその検出をより精度よく行うことができる。例えば、他の疾患とは、神経障害、認知症、肝炎、心疾患、リウマチなどの自己免疫疾患等である。
　また、第３実施形態に係るキットは、補正用のｍｉＲＮＡを定量するためのプライマーセット又は核酸プローブを含んでもよい。例えばキットは表２に示すプライマーセットＫを更に含んでもよい。
　［例］
　以下に、実施形態の分析方法又はキットを用いて行った実験について記載する。
　例１．ｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いた健常者及びがん患者におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量
　健常者２９検体、乳がん患者１５検体、大腸がん患者６検体、胃がん患者５検体、肺がん患者３検体、卵巣がん患者５検体、膵臓がん患者８検体、胆管がん患者５検体、食道がん患者５検体、肝臓がん患者５検体、脳腫瘍患者５検体、膀胱がん患者４検体、前立腺がん患者５検体、肉腫患者５検体、子宮体がん患者４検体、子宮肉腫患者５検体から得られた合計１１４検体の血清を用意した。
　（ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量）
　全ての血清からＲＮＡを抽出した。抽出は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ　Ｐｌａｓｍａ（商品名、タカラバイオ製）を用いて行った。ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐの合成ＲＮＡをｓｐｉｋｅ－ｉｎし抽出を行った。
　次に、抽出サンプル中に存在する短鎖ＲＮＡを逆転写しｃＤＮＡを合成及び増幅した。合成は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍｉＲＮＡ　Ａｓｓａｙ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）の取扱説明書にしたがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍｉＲＮＡ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）を用いて行った。
　続いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍｉＲＮＡ　Ａｓｓａｙ　ＩＤ：４７７８９７＿ｍｉｒを用いてＴａｑＭａｎ　ＰＣＲを行い、Ｃｔ値を測定した。サンプルとともに、異なる濃度の配列番号１の合成ＲＮＡ（１０３、１０４、１０５、１０６コピー／μＬ）を用いて同様に反応させて検量線とした。
　（ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐの定量）
　上記血清サンプルの、ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐ（配列番号４９）を、定量した。ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐの長鎖化及び増幅はｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐと同様の方法で行った。また、ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐを１０３，１０４，１０５，１０６コピー／μＬで反応させて検量線を作成した。検量線と比較することによりｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐの定量値を得た。
　（補正値の算出）
　次にｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量値をｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐの定量値で除して補正値を得た。
　図５は健常者及び各がん患者におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量値の補正値の箱ひげ図を示す。補正値は、健常者では０～約０．４の範囲に分布し、がん患者では約０．５５～約１を超える範囲に分布していた。この結果から、がん患者では血清中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの存在量が多いことが示された。
　図６は、補正値を健常者群とがん患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。がん患者群は健常者以外の全てのがん患者の結果を併せたものであり、健常者より高い値に分布した。健常者群及びがん患者群を切り分けるＡＵＣ（Ａｒｅａ　Ｕｎｄｅｒ　Ｃｕｒｖｅ）は、０．９８であった。
　したがって、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐは、健常者とがん患者とを識別して検出するためのマーカーとして高性能であることが示された。
　例２．ＬＡＭＰ法を用いた健常者及びがん患者におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量
　（ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量）
　例１と同様の検体から得られた血清を用意した。例１と同じ方法で検体からＲＮＡの抽出を行った。抽出サンプル２μＬを、反応体積２０μＬ、１６℃１０分、４２℃５分、８５℃５分の条件で逆転写した。逆転写反応液の組成は、６７ｕｎｉｔ　ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（＊）、１×ＲＴ　Ｂｕｆｆｅｒ（＊）、０．１ｍＭのｄＮＴＰｓ（＊）、４ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）、１０ｎＭのＲＴプライマーとした。「＊」を付したものは全てＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）に含まれているものを用いた。
　逆転写後の反応液に、伸長溶液５μＬを添加して、９５℃２分後、９５℃２０秒－５９℃３０秒－７２℃１０秒のサイクルを２０回かけて伸長を行った。伸長溶液は、２５μＬ中に、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ－）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．５Ｕ、ニューイングランドバイオ）を含み、終濃度が、０．２×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ－）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ付属）、０．２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０ｎＭのＥＬプライマーとなるよう調整した。
　次に、伸長した産物１μＬを、反応体積２５μＬ、６５℃６０分の条件でＬＡＭＰ増幅を行い、同時に蛍光強度の立ち上り時間を測定した。ＬＡＭＰ増幅溶液は、８ＵのＴｉｎ（ｅｘｏ－）ＬＦ　ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）、０．５μＬのＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を含み、終濃度がそれぞれ、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭの（ＮＨ４）ＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、０．８Ｍのベタイン、各１．４ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．６μＭのＦＩＰプライマー、１．６μＭのＢＩＰプライマー、及び０．８μＭのＬＢプライマーとなるよう調整した。リアルタイムＰＣＲ装置にて、経時的に蛍光強度を測定し、閾値を超える時間を測定した。
　上記ＲＴプライマー、ＥＬプライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー及びＬＢプライマーは、表１のプライマーセットＡ又はプライマーセットＪを用いた。
　サンプルとともに、既知の濃度の配列番号１の合成ＲＮＡを上記のプライマーを用いて逆転写、伸長及びＬＡＭＰ増幅し、同様に蛍光強度の立ち上り時間を測定した。合成ＲＮＡの濃度は、プライマーセットＡについては０、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー／μＬ、プライマーセットＪについては０、５×１０２、５×１０３、５×１０４、５×１０５コピー／μＬとした。この結果を用いて配列番号１のＲＮＡのコピー数と立ち上がり時間の検量線を作成し、この検量線を用いて、各検体における立ち上がり時間からＲＮＡのコピー数を算出した。
　（ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐの定量）
　上記血清サンプルの、ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐ（配列番号４９）を定量した。ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐ抽出、長鎖化及び増幅はｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐと同様の方法で行った。ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐの逆転写は、２０ｎＭ　ＲＴ　プライマー、長鎖化は４０ｎＭ　ＥＬ　プライマーを用いた。増幅は、１．６μＭのＦＩＰプライマー、１．６μＭのＢＩＰプライマー、及び０．８μＭのＬＢプライマーを用いた。
　上記ＲＴプライマー、ＥＬプライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー及びＬＢプライマーは、表２のプライマーセットＫを用いた。
　また、ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐを１０３，１０４，１０５，１０６コピー／μＬで反応させて検量線を作成した。検量線と比較することによりｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐの定量値を得た。
　（補正値の算出）
　次にｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量値をｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐの定量値で除して補正値を得た。
　図７は、プライマーセットＡを用いた場合の健常者及び各がん患者におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの補正値の箱ひげ図を示す。ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐは、健常者では約０．１５～約０．５５の範囲に分布しているのに対し、がん患者では約０．３５～約０．９５の高い値の範囲に分布した。また、子宮肉腫を除く標的がんの患者では約０．５～約０．９５のより高い値の範囲に分布した。この結果から、がん患者、特に標的がんの患者では血清中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの存在量が多いことが示された。
　図８は、図７の補正値を健常者群とがん患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。がん患者群は上記健常者以外の全てのがん患者の結果を併せたものであり、健常者より高い値に分布した。健常者群及びがん患者群を切り分けるＡＵＣは、０．９３であった。
　図９は、図１０の補正値を標的がんの患者群と、子宮肉腫の患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。他がん患者群は健常者群より高い値に分布し、標的がん患者群は、子宮肉腫の患者群よりも更に高い値に分布した。他がん患者群と４種のがん患者群とを切り分けるＡＵＣは０．９５であった。
　図１０は、プライマーセットＪを用いた場合の健常者及び各がん患者におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの補正値を示す。ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐは、健常者では約０．２５～約０．５０の範囲に分布しているのに対し、がん患者では約０．４２～約０．８０の高い値の範囲に分布した。また、標的がんの患者では子宮肉腫よりも高い値の範囲に分布した。この結果から、がん患者、特に標的がんの患者では血清中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの存在量が多いことが示された。
　図１１は、図１０の補正値を健常者群とがん患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。がん患者群は上記健常者以外の全てのがん患者の結果を併せたものであり、健常者より高い値に分布した。健常者群及びがん患者群を切り分けるＡＵＣは、０．９０であった。
　図１２は、図１０の補正値を標的がんの患者群と、子宮肉腫の患者群とで区分した結果を示す箱ひげ図である。他がん患者群は健常者群より高い値に分布し、標的がん患者群は、子宮肉腫の患者群よりも更に高い値に分布した。子宮肉腫群と４種のがん患者群とを切り分けるＡＵＣは０．９２であった。
　したがって、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐは、健常者とがん患者とを識別して検出するためのマーカー、又は標的がんを健常者又は子宮肉腫患者とを識別して検出するためのマーカーとして高性能であることが示された。
　また、プライマーセットの安定性を評価した。複数種類のプライマーセットを用いて既知のコピー数のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを定量して検量線を作成した。増幅はリアルタイムＰＣＲ装置にて、経時的に蛍光強度を測定し、閾値を超える時間を測定した。測定は２連で行い、閾値を超えた時間の平均値とＣＶを算出した。定量を複数回繰り返し、検量線の式の再現性を評価した。結果の優れていたプライマーセットＡにおける結果を表５に、より結果の優れていたプライマーセットＪにおける結果を表６に示す。プライマーセットＡについて６回（ｒｕｎ１～６）、プライマーセットＪについては５回（ｒｕｎ１～５）検量線を作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　表５に示す通り、プライマーセットＡにおける検量線の傾きは２．１５～２．７２の範囲でありばらつきが少なかった。したがって、プライマーセットＡはより安定してｍｉＲＮＡを定量できる優れたプライマーセットであることが明らかとなった。
　表６に示す通り、プライマーセットＪにおける検量線の傾きは２．７５～２．９０であり、プライマーセットＡと比べて更にばらつきが少なかった。またｒｕｎ１～５の何れにおいてもｍｉＲＮＡの濃度が０コピーであるとき蛍光の立ち上がりが観察されず、非特異的増幅が起きにくいことが明らかとなった。また、プライマーセットＪではプライマーセットＡと同じ濃度で比較したときもばらつきが少ない。例えば、プライマーセットＡでは１０６コピーの時の立ち上がり時間はｒｕｎごとにばらつきがあるが、プライマーセットＪについては５×１０５の立ち上がり時間はｒｕｎごとにばらつきが少ない。
　以上のことから、プライマーセットＪはより安定してｍｉＲＮＡを定量できるより優れたプライマーセットであることが明らかとなった。
　例３．電気化学的検出
　例２で使用したＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー（各４８μＭ）、ＬＢプライマー（２４μＭ）を含むプライマー溶液を調製した。シリコーン製流路パッキン（流路幅×高さ：１ｍｍ×１ｍｍ）にプライマー溶液１００ｎＬを、微量分注機を用いてスポットした。電極をパターニングしたＤＮＡチップ基板（ガラス（０．８ｍｍ）／チタン（５００ｎｍ）／金（２０００ｎｍ））と該流路パッキンとをカセットに組み込み、チップを作製した。
　次に、表７に示す組成のＬＡＭＰ増幅反応液を調整した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　上記ＬＡＭＰ増幅反応液に、例２で用いた伸長後の鋳型を１μＬ添加し、表８に示す条件で電気化学測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　ＬＡＭＰ増幅反応が開始されると、ルテニウムヘキサアミン（ＲｕＨｅｘ）の還元電流値が増加し始めた。電流が増加する時間は、伸長産物の存在量が多いほど早く、本チップを用いて定量検出が可能であることが明らかとなった。
　本発明の幾つかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これらの実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。

Claims (30)

  1. 　対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを定量することを含む、前記対象におけるがんの罹患の有無を判定する分析方法。
  2. 　対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを定量することを含む、前記対象におけるがんの罹患の有無の判定を補助する分析方法。
  3. 　前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの存在量が、対照におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの存在量よりも多い場合、前記対象ががんに罹患していると判定する判定工程を更に含む請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記がんの罹患の有無の判定は、前記対象におけるがんの予後判定、又は前記対象におけるがんの再発の有無の判定を含む、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
  5. 　前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫から選択される少なくとも１つを含む、請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
  6. 　前記定量はＬＡＭＰ法を用いて行われ、
    　前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つである、請求項１～４の何れか1項に記載の方法。
  7. 　前記判定において、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫又は子宮体がんから選択される少なくとも１つの罹患の有無は、他のがんと識別されて判定される、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記他のがんは、子宮肉腫を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記がんは前立腺がんであり、
    　前記試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐを定量する工程を更に含み、
    　前記判定は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量結果とｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐの定量結果とを用いて行われる、請求項６～８の何れか１項に記載の方法。
  10. 　前記がんは膵臓がんであり、
    　前記試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量する工程を更に含み、
    　前記判定は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量結果とｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの定量結果とを用いて行われる、請求項６～８の何れか１項に記載の方法。
  11. 　前記対象内に存在しないｍｉＲＮＡを前記試料に添加して定量することを更に含み、前記ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量結果は、前記対象内に存在しないｍｉＲＮＡの定量結果と比較することにより補正される、請求項１～１０の何れか１項に記載の方法。
  12. 　前記試料は、血清である、請求項１～１１の何れか１項に記載の方法。
  13. 　前記定量は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを伸長するための伸長用プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを増幅するための増幅用プライマーセット、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を用いて行われる、請求項１～１２の何れか１項に記載の方法。
  14. 　前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号６のＦＩＰプライマー、配列番号７のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号９を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１０を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１１のＦＩＰプライマー、配列番号１２のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号１３を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１４を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１５のＦＩＰプライマー、配列番号１６のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号１７を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１８を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１９のＦＩＰプライマー、配列番号２０のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、又は
    　前記逆転写用プライマーが配列番号４５を含み、前記伸長用プライマーが配列番号４６を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号４７のＦＩＰプライマー、配列番号４８のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含み、
    　前記各プライマーの塩基配列は、対応する配列番号で表される塩基配列の１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも含む、
    請求項１３に記載の方法。
  15. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを伸長するための伸長用プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを増幅するための増幅用プライマーセット、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む、がんを検出するためのキット。
  16. 　前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号６のＦＩＰプライマー、配列番号７のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号９を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１０を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１１のＦＩＰプライマー、配列番号１２のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号１３を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１４を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１５のＦＩＰプライマー、配列番号１６のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号１７を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１８を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１９のＦＩＰプライマー、配列番号２０のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、又は
    　前記逆転写用プライマーが配列番号４５を含み、前記伸長用プライマーが配列番号４６を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号４７のＦＩＰプライマー、配列番号４８のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含み、
    　前記各プライマーの塩基配列は、対応する配列番号で表される塩基配列の１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも含む、
    請求項１５に記載のキット。
  17. 　前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫から選択される少なくとも１つを含む、請求項１５又は１６に記載のキット。
  18. 　前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つである、請求項１７に記載のキット。
  19. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ用の逆転写用プライマー、伸長用プライマー、増幅用プライマーセット及び核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を更に含む、請求項１８に記載のキット。
  20. 　ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ用の逆転写用プライマー、伸長用プライマー、増幅用プライマーセット及び核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を更に含む、請求項１８に記載のキット。
  21. 　ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐ、及び
    　ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９－３ｐ用の逆転写用プライマー、伸長用プライマー、増幅用プライマーセット及び核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を更に含む、請求項１５～２０の何れか１項に記載のキット。
  22. 　がんを検出するためのプライマーセットであって、前記プライマーセットは、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号６のＦＩＰプライマー、配列番号７のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号９を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１０を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１１のＦＩＰプライマー、配列番号１２のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号１３を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１４を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１５のＦＩＰプライマー、配列番号１６のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号１７を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１８を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１９のＦＩＰプライマー、配列番号２０のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、又は
    　前記逆転写用プライマーが配列番号４５を含み、前記伸長用プライマーが配列番号４６を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号４７のＦＩＰプライマー、配列番号４８のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含み、
    　前記各プライマーの塩基配列は、対応する配列番号で表される塩基配列の１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも含む、
    プライマーセット。
  23. 　前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つを含む、請求項２２に記載のプライマーセット。
  24. 　がんを検出するための検出用デバイスであって、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを増幅し、増幅産物を検出する増幅検出部を備え、
    前記増幅検出部は、基板と、前記基板の１つの面上に備えられた１つ以上の検出領域とを備える、
    検出用デバイス。
  25. 　前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫から選択される少なくとも１つを含む、請求項２４に記載の検出用デバイス。
  26. 　前記検出領域の付近に固定された、前記増幅産物とハイブリダイズする核酸プローブを備える、請求項２４又は２５に記載の検出用デバイス。
  27. 　前記検出領域の付近に遊離可能に固定された、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを伸長するための伸長用プライマー及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐを増幅するための増幅用プライマーセットを更に備える、
    請求項２４～２６の何れか１項に記載の検出用デバイス。
  28. 　前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号６のＦＩＰプライマー、配列番号７のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号９を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１０を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１１のＦＩＰプライマー、配列番号１２のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号１３を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１４を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１５のＦＩＰプライマー、配列番号１６のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、
    　前記逆転写用プライマーが配列番号１７を含み、前記伸長用プライマーが配列番号１８を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号１９のＦＩＰプライマー、配列番号２０のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含むか、又は
    　前記逆転写用プライマーが配列番号４５を含み、前記伸長用プライマーが配列番号４６を含み、前記増幅用プライマーセットが配列番号４７のＦＩＰプライマー、配列番号４８のＢＩＰプライマー及び配列番号８のＬＢプライマーを含み、
    　前記各プライマーの塩基配列は、対応する配列番号で表される塩基配列の１又は２の塩基の欠失、置換、付加又は挿入があるものも含む、
    請求項２７に記載の検出用デバイス。
  29. 　前記がんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、前立腺がん、肉腫及び子宮体がんから選択される少なくとも１つである、請求項２８に記載の検出用デバイス。
  30. 　前記検出の結果からｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１－３ｐの定量値を算出する算出部をさらに備える請求項２４～２９のいずれか１項に記載のデバイス。
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