JP7392048B2 - 分析方法及びキット - Google Patents
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Description
(分析方法)
実施形態の分析方法は、対象における膵臓がんの罹患の有無を判定するための方法である。
UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(配列番号1)
を有するmiRNAである。以下、hsa-miR-122-5pを「標的miRNA」とも称する。また、配列番号1の配列を「第1の配列」とも称する。
(S1-2)逆転写産物6と標的miRNA1とを解離させる解離工程、
(S1-3)第1aの配列5とハイブリダイズする第2プライマー部8及び第2LAMP認識配列を含む伸長用プライマー7(以下、「ELプライマー」とも称する)の第2プライマー部8を逆転写産物6の第1aの配列5とハイブリダイズさせ、ELプライマー7及び逆転写産物6を、互いを鋳型として伸長させて、第1aの配列5の相補配列9(即ち、第1の配列に対応するDNA配列)を含む伸長産物10を得る伸長工程、
(S1-4)伸長産物10をLAMP反応により増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
(S1-5)得られた増幅産物を検出する検出工程。
第2LAMP認識配列はB1c配列、F1配列及びF2配列を含む。
(この場合、第1aの配列の相補配列9の少なくとも1部をLB配列とする。)
(2)第1LAMP認識配列はLBc配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はB1c配列、F1配列及びF2配列を含む。
(3)第1LAMP認識配列はダミー配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はB1c配列、F1配列及びF2配列を含む。
(4)第1LAMP認識配列はB1配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はF1配列、LFc配列及びF2配列を含む。
(5)第1LAMP認識配列はB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はF1配列、LFc配列及びF2配列を含む。
(6)第1LAMP認識配列はLBc配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はF1配列及びF2配列を含む。
(7)第1LAMP認識配列はB1配列及びB2配列を含み、
第2LAMP認識配列はLFc配列及びF2配列を含む。
実施形態によれば、hsa-miR-122-5pを含む、膵臓がん検出用マーカーが提供される。
実施形態によれば、膵臓がん検出用キットが提供される。
第2の実施形態において、図5の(a)に示すように、対象由来の試料中のhsa-miR-122-5pを定量すること(定量工程(S11))を含む、対象における膵臓がんの罹患の有無の判定を補助するための分析方法も提供される。
(S12)対象が膵臓がんに罹患している可能性に関する情報を得る情報取得工程。
以下に、実施形態の分析方法又はキットを用いて行った実験について記載する。
健常者16検体、乳がん患者22検体、大腸がん患者6検体、胃がん患者6検体、肺がん患者3検体、卵巣がん患者6検体、膵臓がん患者11検体、胆管がん患者5検体、食道がん患者5検体、肝臓がん患者5検体、脳腫瘍患者5検体、膀胱がん患者5検体、膵臓がん患者5検体、肉腫患者5検体、子宮体がん患者5検体、子宮肉腫患者5検体から得られた血清を用意した。
検体の内訳は例1と同じである。また、RNAの抽出は、例1と同じ方法で行った。抽出サンプル2μLを、反応体積20μL、16℃10分、42℃5分、85℃5分の条件で逆転写した。逆転写反応液の組成は、67unit MultiScribe(登録商標)Reverse Transcriptase(*)、1×RT Buffer(*)、0.1mMのdNTPs(*)、4UのRNaseOUT(商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製)、10nMのRTプライマー(表5、配列番号2)であった。「*」を付したものは全てHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製)に含まれているものを用いた。
例2において作製した合成RNAによる検量線用伸長産物を、配列番号8のLB配列に代えて、表6に示す配列番号9のLB配列を用いて例2と同様の方法で増幅した。
また、表7に示すプライマーセットBを用いて、例2と同じ条件で、配列番号1の合成RNAの0、103、104、105及び106コピー/μLの逆転写、伸長及びLAMP増幅を行い、濁度の立ち上がり時間を計測した。
例2で使用したFIPプライマー及びBIPプライマー(各48μM)、LBプライマー(24μM)を含むプライマー溶液を調製した。シリコーン製流路パッキン(流路幅×高さ:1mm×1mm)にプライマー溶液100nLを、微量分注機を用いてスポットした。電極をパターニングしたDNAチップ基板(ガラス(0.8mm)/チタン(500nm)/金(2000nm))と該流路パッキンとをカセットに組み込み、チップを作製した。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]
対象由来の試料中のhsa-miR-122-5pを定量することを含む、前記対象における膵臓がんの罹患の有無を判定する分析方法であって、
前記判定においては、前記対象が他のがんではなく、膵臓がんに罹患していると判定する、分析方法。
[2]
対象由来の試料中のhsa-miR-122-5pを定量することを含む、前記対象における膵臓がんの罹患の有無の判定を補助する分析方法であって、
前記判定においては、前記対象が他のがんではなく、膵臓がんに罹患していると判定する、分析方法。
[3]
前記膵臓がんの罹患の有無の判定は、hsa-miR-122-5p以外のマーカーの検出又は定量結果を用いることなく行われる、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
前記対象におけるhsa-miR-122-5pの存在量が、対照におけるhsa-miR-122-5pの存在量よりも多い場合、前記対象が膵臓がんに罹患していると判定する判定工程を更に含む[1]~[3]の何れか1つに記載の方法。
[5]
前記膵臓がんの罹患の有無の判定は、前記対象における膵臓がんの予後判定、又は前記対象における膵臓がんの再発の有無の判定を含む、[1]~[4]の何れか1つに記載の方法。
[6]
前記他のがんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫を含む、[5]に記載の方法。
[7]
前記試料は、血清である、[1]~[6]の何れか1つに記載の方法。
[8]
前記定量は、hsa-miR-122-5pを増幅するためのプライマーセット(以下、「第1プライマーセット」と称する)、hsa-miR-122-5pを逆転写するための逆転写用プライマー、hsa-miR-122-5pを伸長するための伸長用プライマー、及びhsa-miR-122-5pを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも1種の核酸を用いて行われる、[1]~[7]の何れか1つに記載の方法。
[9]
前記定量は、
(S1-1)hsa-miR-122-5pの配列(以下、「第1の配列」と称する)とハイブリダイズする第1プライマー部及び第1LAMP認識配列を含む逆転写用プライマーの、前記第1プライマー部を前記第1の配列とハイブリダイズさせ、前記第1の配列を逆転写し、前記第1の配列の相補配列(以下、「第1aの配列」と称する)を含む逆転写産物を得る逆転写工程、
(S1-2)前記逆転写産物と前記hsa-miR-122-5pとを解離させる解離工程、
(S1-3)前記第1aの配列とハイブリダイズする第2プライマー部及び第2LAMP認識配列を含む伸長用プライマーの、前記第2プライマー部を前記逆転写産物の前記第1aの配列とハイブリダイズさせ、前記伸長用プライマー及び前記逆転写産物を、互いを鋳型として伸長させて、前記第1aの配列の相補配列を含む伸長産物を得る伸長工程、
(S1-4)第1プライマーセットを用いてLAMP反応により前記伸長産物を増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
(S1-5)得られた前記増幅産物を検出する検出工程
を含む、
[8]に記載の方法。
[10]
前記第1プライマーセットは、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号11のLBプライマーを含むか、
配列番号12のFIPプライマー、配列番号13のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、又は
配列番号14のFIPプライマー、配列番号15のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号2を含み、前記伸長用プライマーが配列番号3を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号4を含み、前記伸長用プライマーが配列番号5を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号6を含み、前記伸長用プライマーが配列番号7を含む、
[8]又は[9]に記載の方法。
[11]
hsa-miR-122-5pを増幅するためのプライマーセット(以下、「第1プライマーセット」と称する)、hsa-miR-122-5pを逆転写するための逆転写用プライマー、hsa-miR-122-5pを伸長するための伸長用プライマー、及びhsa-miR-122-5pを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも1種の核酸を含む、膵臓がんを検出するためのキットであって、
前記検出は、他のがんではなく、膵臓がんを検出することである、
キット。
[12]
前記第1プライマーセットは、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号11のLBプライマーを含むか、
配列番号12のFIPプライマー、配列番号13のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、又は
配列番号14のFIPプライマー、配列番号15のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号2を含み、前記伸長用プライマーが配列番号3を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号4を含み、前記伸長用プライマーが配列番号5を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号6を含み、前記伸長用プライマーが配列番号7を含む、[11]に記載のキット。
[13]
前記他のがんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫を含む、[11]に記載のキット。
4…第1プライマー部,5…第1aの配列,6…逆転写産物,
7…伸長用プライマー(ELプライマー),8…第2プライマー部,
9…第1aの配列の相補配列,10…伸長産物
Claims (5)
- (S1)hsa-miR-122-5pを増幅するためのプライマーセット(以下、「第1プライマーセット」と称する)、hsa-miR-122-5pを逆転写するための逆転写用プライマー、及びhsa-miR-122-5pを伸長するための伸長用プライマーからなる群から選択される少なくとも1種のプライマーを対象由来の試料に用いて核酸を得た後、当該核酸を核酸プローブで検出することで、前記試料中のhsa-miR-122-5pを定量すること;及び
(S2)前記(S1)で得られた定量値と、対照由来の試料中のhsa-miR-122-5pの定量値とを比較し、前記(S1)で得られた定量値の方が大きい場合に、前記対象が乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん、又は子宮肉腫に罹患している可能性よりも膵臓がんに罹患している可能性の方が高いと判定すること;
を含み、
前記対照は、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん、又は子宮肉腫に罹患した生体である、前記対象における膵臓がんの罹患の有無の判定を補助する方法。 - 前記(S1)は、
(S1-1)hsa-miR-122-5pの配列(以下、「第1の配列」と称する)とハイブリダイズする第1プライマー部及び第1LAMP認識配列を含む逆転写用プライマーの、前記第1プライマー部を前記第1の配列とハイブリダイズさせ、前記第1の配列を逆転写し、前記第1の配列の相補配列(以下、「第1aの配列」と称する)を含む逆転写産物を得る逆転写工程、
(S1-2)前記逆転写産物と前記hsa-miR-122-5pとを解離させる解離工程、
(S1-3)前記第1aの配列とハイブリダイズする第2プライマー部及び第2LAMP認識配列を含む伸長用プライマーの、前記第2プライマー部を前記逆転写産物の前記第1aの配列とハイブリダイズさせ、前記伸長用プライマー及び前記逆転写産物を、互いを鋳型として伸長させて、前記第1aの配列の相補配列を含む伸長産物を得る伸長工程、
(S1-4)第1プライマーセットを用いてLAMP反応により前記伸長産物を増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
(S1-5)前記増幅産物を核酸プローブで検出する検出工程
を含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記第1プライマーセットは、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号11のLBプライマーを含むか、
配列番号12のFIPプライマー、配列番号13のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、又は
配列番号14のFIPプライマー、配列番号15のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号2を含み、前記伸長用プライマーが配列番号3を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号4を含み、前記伸長用プライマーが配列番号5を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号6を含み、前記伸長用プライマーが配列番号7を含む、
請求項1又は2に記載の方法。 - hsa-miR-122-5pを増幅するためのプライマーセット(以下、「第1プライマーセット」と称する)、hsa-miR-122-5pを逆転写するための逆転写用プライマー、及びhsa-miR-122-5pを伸長するための伸長用プライマーからなる群から選択される少なくとも1種のプライマーと、
前記プライマーを用いて得られる核酸にハイブリダイズし、かつ、前記核酸を検出するための核酸プローブと
を含む、
乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫に罹患している可能性よりも、膵臓がんに罹患している可能性の方が高いと判定するために用いられるキット。 - 前記第1プライマーセットは、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、
配列番号8のFIPプライマー、配列番号9のBIPプライマー及び配列番号11のLBプライマーを含むか、
配列番号12のFIPプライマー、配列番号13のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含むか、又は
配列番号14のFIPプライマー、配列番号15のBIPプライマー及び配列番号10のLBプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号2を含み、前記伸長用プライマーが配列番号3を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号4を含み、前記伸長用プライマーが配列番号5を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号6を含み、前記伸長用プライマーが配列番号7を含む、
請求項4に記載のキット。
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