CN116716400A - 一种双重催化发夹自组装的序列组、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种双重催化发夹自组装的序列组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高保真检测mRNA技术领域，特别是涉及一种双重催化发夹自组装的序列组、试剂盒及其应用。本发明利用无酶核酸放大方法，使序列组具有高特异性和高灵敏度的基因检测效率。本发明可作为一种新颖的基因检测平台，具有可以高保真检测TK1mRNA的特点，同时利用2个CHA反应加Linker可以为检测长片段提供一种新型的策略。使用目标的两个片段作为靶标序列，只有当目标相继引发两个CHA反应，与Linker互补的锁链才能被CHA反应产物置换下来进行细胞成像。该系统可以提高核酸纳米材料识别不同细胞类型的特异性以及检测的可靠性，在生物医学诊断中具有广阔的应用前景。

Description

一种双重催化发夹自组装的序列组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及高保真检测mRNA技术领域，特别是涉及一种双重催化发夹自组装的序列组、试剂盒及其应用。
背景技术
癌症是一种细胞异常增殖的疾病，与细胞生长调节相关的某些基因(如TK1)的突变有关，该突变会导致细胞不受控制的增殖，从而导致恶性肿瘤。胸苷激酶1(TK1蛋白)是一种特殊激酶，可催化胸苷(TdR)磷酸化为脱氧胸苷一磷酸(TMP)。胸苷激酶1可以通过参与DNA合成补救途径再生胸苷以进行DNA合成和DNA损伤修复；它将胸苷磷酸化为脱氧胸苷一磷酸后，再通过胸腺核苷酸激酶(TMPK)、核苷二磷酸激酶(NDPK)转化为脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，从而参与DNA合成。TK1水平的升高和DNA的合成呈正相关，在细胞周期中，TK1在G1期晚期开始升高，S期达到最高，至G2期开始下降。由于TK1与细胞周期S期的特殊相关性，又被称为“S期关键酶”，TK1已被用作诊断和分类多种癌症的生物标志物。TK1作为一种新兴的潜在肿瘤增殖生物标志物，可用于肿瘤治疗、复发和生存的预后和监测。
由于信使RNA(mRNA)在细胞命运、功能和表型中的重要作用，迫切需要超敏成像和定量技术。目前，已经发展了多种检测mRNA的方法，如荧光原位杂交(FISH)和聚合酶链反应(PCR)。荧光原位杂交技术(fluorescence in-situ hybridization,FISH)是利用荧光素直接或间接标记探针，与变性处理后的样品进行原位杂交的技术，应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交可用于检测组织细胞中特定基因表达水平。然而，这通常需要细胞提取物或固定死亡细胞，无法获得mRNA的实时表达，且特异性和灵敏度较低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种双重催化发夹自组装的序列组、试剂盒及其应用。本发明提供的序列组不仅具有更高的特异性及灵敏度，而且可用于活细胞检测，获得mRNA的实时表达，对于早期诊断和个性化治疗具有重要的意义。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种双重催化发夹自组装的序列组，所述序列组包括：连接序列Linker、锁链Lock1、锁链Lock2、发卡H1、发卡H2、发卡H3和发卡H4；
所述连接序列Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述锁链Lock1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述锁链Lock2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述发卡H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述发卡H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述发卡H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述发卡H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述连接序列Linker的5’端修饰淬灭基团；所述锁链Lock1的3’端修饰荧光基团。
优选的，所述淬灭基团包括BHQ1；所述荧光基团包括FAM。
优选的，所述连接序列Linker、锁链Lock1、锁链Lock2、发卡H1、发卡H2、发卡H3和发卡H4的摩尔比为1：1：1：1：1：1：1。
本发明还提供了一种检测胸苷激酶1mRNA的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的序列组。
优选的，所述试剂盒还包括Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液和ddH2O。
本发明还提供了上述技术方案所述序列组或上述技术方案所述的试剂盒在检测胸苷激酶1mRNA中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述序列组或上述技术方案所述的试剂盒在制备疾病诊断产品中的应用，所述疾病包括以胸苷激酶1为生物标志物的疾病。
优选的，所述疾病包括癌症。
本发明还提供了一种检测胸苷激酶1mRNA的方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述序列组与待测样品混合，进行双重催化发夹自组装反应，检测反应后的混合物的荧光强度。
优选的，所述双重催化发夹自组装反应的温度为37℃；所述双重催化发夹自组装反应的反应时间为1h。
有益效果：
本发明提供了一种双重催化发夹自组装的序列组，所述序列组包括：连接序列Linker、锁链Lock1、锁链Lock2、发卡H1、发卡H2、发卡H3和发卡H4；所述连接序列Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述锁链Lock1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述锁链Lock2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述发卡H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述发卡H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述发卡H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述发卡H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述连接序列Linker的5’端修饰淬灭基团；所述锁链Lock1的3’端修饰荧光基团。本发明将连接序列Linker设计成含有胸苷激酶1(TK1)mRNA模拟物保守区域(FMR1和FMR2)的长序列，锁链Lock1和锁链Lock2与连接序列Linker依次互补配对，在连接序列Linker的5’端修饰淬灭基团，锁链Lock1的3’端修饰荧光基团用于信号传导反应(示意图见图1中的B)；同时还设计了4个用于CHA反应的发卡，发卡H1和发卡H3分别包含立足点1(FMR1的互补序列)和立足点2(FMR2的互补序列)，发卡H2会进一步与发卡H1和发卡H3杂交形成双链结构，发卡H4会进一步与发卡H3杂交形成双链结构，双链结构的延伸端将进一步引发成像反应。只有当TK1 mRNA的两部分均作为靶标打开发卡，相继引发两个CHA反应，两个CHA反应产物的延伸端才会进行置换反应释放出荧光用于定量检测和/或成像检测(示意图见图1中的A)；而在缺少任何一个CHA反应时释放的荧光将会减弱甚至不释放荧光信号，从而可以保证检测的准确性。这种双重反应系统不仅比普通检测系统具有更强的特异性及灵敏度，而且可用于活细胞检测，获得mRNA的实时表达，对于早期诊断和个性化治疗具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为双重反应系统检测TK1 mRNA示意图；
图2为双重反应系统通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征；
图3为双重反应系统通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示2个CHA反应；
图4为双重反应系统对不同靶标浓度的荧光谱图以及线性拟合方程；
图5为双重反应系统对核苷酸检测的高特异性及良好的稳定性检测结果；
图6为使用10％FBS(胎牛血清)评估双重反应系统在生理状态下检测TK1mRNA及突变序列的性能；
图7为系统对不同癌细胞检测TK1 mRNA的可行性。
具体实施方式
本发明提供了一种双重催化发夹自组装的序列组，所述序列组包括：连接序列Linker、锁链Lock1、锁链Lock2、发卡H1、发卡H2、发卡H3和发卡H4；
所述连接序列Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-TTTTTAGTTAGATGACCAGCAGCAGTTTGAGCATCAATGAGTATGCCTTT TT-3’；
所述锁链Lock1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为5’-CTGGTCATCTAACTAAAAA-3’；
所述锁链Lock2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为5’-CATTGATGCTCAAACT-3’；
所述发卡H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为5’-AAAAAGGCATACTTGATCACCAGGCACCATTGATGCTCGTGCCTGGTGA TCA-3’；
所述发卡H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为5’-CAGGCACGAGCATCAATGGTGCCTGGTGATCACATTGATGCTC-3’；
所述发卡H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为5’-AAACTGCTGCTGTAGCGAGTGTCTTGTCATCTAACTAAGACACTCGCTA-3’；
所述发卡H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为5’-GTGTCTTAGTTAGATGACAAGACACTCGCTAGTCATCTAACT-3’；
所述连接序列Linker的5’端修饰淬灭基团；所述锁链Lock1的3’端修饰荧光基团。
在本发明中，所述淬灭基团优选包括BHQ1；所述荧光基团优选包括FAM。
在本发明中，所述连接序列Linker、锁链Lock1、锁链Lock2、发卡H1、发卡H2、发卡H3和发卡H4的摩尔比优选为1：1：1：1：1：1：1。
由于TK1 mRNA的序列较长，不易设计用于普通的检测，本发明将TK1mRNA长片段的两段保守区域(FMR1和FMR2)作为靶标，设计合成连接序列Linker，同时设计与连接序列Linker依次互补配对的锁链Lock1和锁链Lock2，在连接序列Linker的5’端修饰淬灭基团，锁链Lock1的3’端修饰荧光基团用于信号传导反应(示意图见图1中的B)；另外，还设计了4个用于和TK1 mRNA进行CHA反应的发卡，只有当TK1 mRNA的两部分均作为靶标打开发卡，相继引发CHA反应，两个CHA反应产物的延伸端才会进行置换反应释放出荧光用于检测。而当反应系统在缺少任何一个CHA反应时释放的荧光将会减弱甚至不释放荧光信号，从而可以保证检测的准确性。此外，通过与CHA反应结合作为信号放大器，检测限可以低至100fM。比较分析表明，这种双重反应系统具有比普通检测系统更强的特异性及灵敏度，可降低假阳性，同时进一步提高生物传感的性能。双重反应系统在血清中具有稳定性以及可以用于癌细胞成像的优势，证明了双重系统在临床诊断方面的潜力。本发明提供了高保真检测TK1mRNA快速高效的新方法，同时为检测长片段提供了一种新策略，对于早期诊断和个性化治疗具有重要的意义。
本发明还提供了一种检测胸苷激酶1mRNA的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的序列组。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液和ddH2O。
本发明还提供了上述技术方案所述序列组或上述技术方案所述的试剂盒在以非诊断为目的检测胸苷激酶1mRNA中的应用。
本发明提供的序列组或试剂盒可以是以非诊断为目的检测胸苷激酶1mRNA，通过双重CHA反应得到的产物进行置换反应释放出荧光用于检测胸苷激酶1mRNA。
本发明还提供了一种可以是以非诊断为目的检测胸苷激酶1mRNA的方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述序列组与待测样品混合，进行双重催化发夹自组装反应，检测反应后的混合物的荧光强度。
在本发明中，所述序列组与待测样品混合前，优选进行如下处理，包括：
利用1×TE buffer分别溶解发夹H1、发夹H2、发夹H3和发夹H4的序列后，分别在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温形成稳定的发卡结构，即得到稳定的发卡H1、稳定的发夹H2、稳定的发夹H3和稳定的发夹H4；
将连接序列Linker、锁链Lock1、锁链Lock2、Tris-HCl缓冲液和ddH2O混合，在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温形成稳定的双链结构；
将得到稳定的发卡结构H1～H4与稳定的双链结构混合，得到反应体系；所述反应体系中连接序列Linker、锁链Lock1、锁链Lock2、发卡H1、发卡H2、发卡H3和发卡H4的摩尔比优选为1：1：1：1：1：1：1；
将所述反应体系与待测样品混合，进行双重催化发夹自组装反应。
在本发明中，所述双重催化发夹自组装反应的温度优选为37℃；所述双重催化发夹自组装反应的反应时间优选为1h。
本发明还提供了上述技术方案所述序列组或上述技术方案所述的试剂盒在制备疾病诊断产品中的应用，所述疾病包括以胸苷激酶1为生物标志物的疾病。
在本发明中，所述疾病优选包括癌症。利用本发明所提供的序列组或试剂盒制备的疾病诊断产品，可以通过双重CHA反应得到的产物进行置换反应释放出荧光用于检测胸苷激酶1mRNA或细胞成像，对于以胸苷激酶1为生物标志物的疾病的早期诊断和个性化治疗具有重要的意义。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种双重催化发夹自组装的序列组、试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种双重催化发夹自组装的序列组，所述序列组由Linker、Lock1、Lock2、H1、H2、H3和H4组成；所述Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Lock1的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述Lock2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述H1的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述Linker的5’端修饰淬灭基团BHQ1；所述Lock1的3’端修饰荧光基团FAM；
利用1×TE buffer分别溶解Linker、Lock1、Lock2、H1、H2、H3和H4序列，分别得到浓度为10μM的Linker、浓度为10μM的Lock1、浓度为10μM的Lock2、浓度为10μM的H1、浓度为10μM的H2、浓度为10μM的H3和浓度为10μM的H4。
实施例2
将实施例1所述溶解后的序列进行如下实验，其中，H1～H4序列溶解后分别在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温，形成发卡结构用于后续实验：设置9个处理组使用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征，具体如下：
处理组1：1μL 10μM的Linker、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和17μL ddH2O；
处理组2：1μL 10μM的Linker、1μL 10μM的Lock1、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和16μLddH2O，在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温；
处理组3：1μL 10μM的Linker、1μL 10μM的Lock1、1μL 10μM的Lock2、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和16μL ddH2O，在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温；
处理组4：1μL 10μM的H1、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和17μL ddH2O；
处理组5：1μL 10μM的H2、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和17μL ddH2O；
处理组6：1μL 10μM的H1、1μL 10μM的H2、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和16μL ddH2O；
处理组7：1μL 10μM的H3、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和17μL ddH2O；
处理组8：1μL 10μM的H4、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和17μL ddH2O；
处理组9：1μL 10μM的H3、1μL 10μM的H4、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和16μL ddH2O；
将处理组1～9分别在37℃反应1小时后，使用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征，结果见图2，泳道1～9依次对应处理组1～9。由图2可知，泳道1～3的电泳迁移率逐渐下降表明了Linker与Lock1、Lock2的成功组装；泳道4、5、7、8分别为单独的4个发卡，泳道6、9为成对的2组发卡，可见本发明提供的序列组不会产生假阳性背景。
实施例3：双重CHA反应
将实施例1所述溶解后的序列进行如下实验，其中，H1～H4序列溶解后分别在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温，形成发卡结构用于后续实验：设置9个处理组使用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征，具体如下：
处理组1：1μL 10μM的H1、2μL 10×Tris-HCl缓冲液、0.5μL TK1 mRNA模拟物和16.5μL ddH2O；
处理组2：1μL 10μM的H2、2μL 10×Tris-HCl缓冲液、0.5μL TK1 mRNA模拟物和16.5μL ddH2O；
处理组3：1μL 10μM的H1、1μL 10μM的H2、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和16μL ddH2O；
处理组4：1μL 10μM的H1、1μL 10μM的H2、2μL 10×Tris-HCl缓冲液、0.5μL TK1mRNA模拟物和15.5μL ddH2O；
处理组5：1μL 10μM的H3、2μL 10×Tris-HCl缓冲液、0.5μL TK1 mRNA模拟物和16.5μL ddH2O；
处理组6：1μL 10μM的H4、2μL 10×Tris-HCl缓冲液、0.5μL TK1 mRNA模拟物和16.5μL ddH2O；
处理组7：1μL 10μM的H3、1μL 10μM的H4、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和16μL ddH2O；
处理组8：1μL 10μM的H3、1μL 10μM的H4、2μL 10×Tris-HCl缓冲液、0.5μL TK1mRNA模拟物和15.5μL ddH2O；
处理组9：1μL 10μM的H1、1μL 10μM的H2、1μL 10μM的H3、1μL 10μM的H4、2μL 10×Tris-HCl缓冲液、0.5μL TK1 mRNA模拟物和13.5μL ddH2O；
所述TK1 mRNA模拟物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：5’-ACAAGT GCCTGGTGATCAAGTATGCCAAAGACACTCGCTACAGCAGCAGCTTCTGC A-3’；
所述TK1 mRNA模拟物的浓度为10μM；
将处理组1～9分别在37℃反应1小时后，使用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征结果见图3，泳道1～9依次对应处理组1～9。
首先探究了TK1 mRNA模拟物能否打开H1、H3，由泳道1、5所示，上升的条带表明了靶标成功打开了发卡，可见TK1 mRNA模拟物能打开H1、H3；泳道2、3、6、7进一步排除CHA反应的假阳性；泳道4、8表明了单个CHA反应的成功进行，而泳道9表明2对发卡可以在互不干扰的情况下进行双重反应。
实施例4：系统对不同浓度靶标的灵敏度检测
将实施例1所述溶解后的序列进行如下实验，其中，H1～H4序列溶解后分别在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温，形成发卡结构用于后续实验：将检测的靶标TK1 mRNA模拟物(同实施例3)浓度设为0fM、100fM、1pM、10pM、100pM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM根据步骤2中的方法进行荧光测量，具体实验方法如下：
步骤1：将1μL 10μM的Linker、1μL 10μM的Lock1、1μL 10μM的Lock2、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和10.5μL ddH2O，在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温后，加入形成发卡结构的H1～H4，得到双重反应系统；所述形成发卡结构的H1～H4的加入量均为1μL；
步骤2：在不同双重反应系统中分别加入0.5μL不同浓度的TK1 mRNA模拟物(同实施例3)，并在37℃下反应1小时；所述TK1 mRNA模拟物的浓度分别为0fM、100fM、1pM、10pM、100pM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM；
步骤3：将20μL反应1小时后的溶液用1×Tris-HCl缓冲液稀释至200μL，使得TK1mRNA模拟物的终浓度为所设置的浓度，并通过F-7000荧光计(日本日立)在设定激发波长为492nm，发射波长范围从500到600nm，光电倍增管检测器电压设置为600V，入射狭缝和发射狭缝都设置为5nm，并记录发射光谱。
结果见图4和表1，其中图4中的A是系统在0nM-30nM各目标浓度下的荧光波谱图，图4中的B为系统在0nM-30nM各目标浓度下的峰值荧光强度。
表1不同靶标浓度对应的荧光值及标准差
荧光检测结果显示本发明对于所检测靶标具有较宽的线性范围，以荧光信号F与靶标对数浓度Log C/靶标浓度C作线性拟合方程(低浓度结果如图4C所示，高浓度结果如图4D所示)，检测限为100fM，表明系统具有良好的灵敏度。
实施例5：系统对核苷酸检测的高特异性及良好的稳定性
将实施例1所述溶解后的序列进行如下实验，其中，H1～H4序列溶解后分别在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温，形成发卡结构用于后续实验。
实验一：利用TK1 mRNA发生替换(mA、mT、mC)或缺失(dG)的突变类型研究系统的辨别能力，具体实验方法如下：
步骤1：将1μL 10μM的Linker、1μL 10μM的Lock1、1μL 10μM的Lock2、2μL 10×Tris-HCl缓冲液和10.5μL ddH2O，在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温后，加入形成发卡结构的H1～H4，得到双重反应系统；所述形成发卡结构的H1～H4的加入量均为1μL；
步骤2：对照反应系统的制备方法与步骤1相似，区别在于，不含有1μL 10μM的Lock2，ddH2O的体积为11.5μL；
步骤3：在不同双重反应系统和对照反应系统中分别加入0.5μL 10μM的不同靶标物，并在37℃下反应1小时；不同靶标物的具体序列见表2；反应完成后测量荧光信号，测定方法同实施例4中的步骤3，计算相对荧光强度，相对荧光强度＝(加入突变序列检测到的荧光信号值-不加入突变序列的荧光背景值)/(加入TK1检测到的荧光信号值-不加入TK1的荧光背景值)*100％，结果见图5，其中，图5中的A为双重反应系统辨别各种突变类型的能力测定，图5中B为对照反应系统的突变检测能力；Target组的靶标物为表2中TK1。
表2不同突变类型对应的序列
注：下划线的碱基为TK1 mRNA模拟物替换后的碱基。
由图5可知，本发明提供的双重反应系统包含了两个锁链结构，只有正常靶标的CHA反应产物才能相继置换下锁链1和2，才能产生较强的荧光强度，具有较高的特异性(图5A)；而突变序列由于只能置换下1或2，检测到的荧光强度低于正常靶标的荧光强度(相对荧光强度低于60％)。而对照系统中，只含有1个锁链Lock1，突变序列的CHA反应产物也可能能置换下锁链释放荧光，所以在对照系统中突变序列也能检测到较高的荧光强度(图5B)。可见，本发明提供的双重反应系统具有较高的特异性。
实验二：为了探究系统在生理状态下对TK1 mRNA检测的稳定性。本发明使用体积浓度为0％、2％、4％、6％、8％和10％的FBS(胎牛血清)模拟生理环境，实验方法如下：
按实验一中的步骤1制备好系统后，加入0.5μL 10μM的TK1 mRNA模拟物(SEQ IDNO.8)，同时在不同的系统中分别加入0μL、0.4μL、0.8μL、1.2μL、1.6μL、2.0μL的胎牛血清来模拟不同生理状态下的环境，反应完成后按实验一的方法测定荧光信号；同时不同的系统分别设置对照组(Blank)，对照组不添加TK1 mRNA模拟物，并测定不同对照组的荧光信号。结果见图6。由图6可知，随着血清浓度的增加，反应的背景荧光值与信号荧光值均没有较大的变化。
综合实验一和实验二的结果可知，反应体系在体外检测TK1 mRNA具有高特异性及良好的稳定性。
实施例6：活细胞成像检测
将实施例1所述溶解后的序列进行如下实验，其中，H1～H4序列溶解后分别在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温，形成发卡结构用于后续实验：为了评价系统在细胞环境中检测TK1 mRNA的可行性，对不同癌细胞进行了激光共聚焦显微成像。以L02为阴性细胞，HeLa、MCF-7、HepG2为阳性细胞利用本发明实施例1提供的序列组进行检测，具体实验方法如下：
步骤1：接种细胞至24孔板中，接种密度为1×105个/孔，置于37℃，5％二氧化碳恒温培养箱中培养24h，待其贴壁后备用；
步骤2：取一支1.5mL的去酶EP管，标记为A，加入125μL opti-MEM培养基和5μLlipofectamine 3000；取另一支1.5mL的去酶EP管，标记为B，加入125μL opti-MEM培养基、30μL双重反应系统和5μL P3000增强剂试(赛默飞公司，货号为L3000075)；
所述双重反应系统由以下方法制备得到：将3μL 10μM的Linker、3μL 10μM的Lock1、3μL 10μM的Lock2、3μL 10×Tris-HCl缓冲液和6μL ddH2O，在95℃下加热5分钟后，自然冷却至室温后，加入形成发卡结构的H1～H4，得到双重反应系统；所述形成发卡结构的H1～H4的加入量均为3μL；
将A管全部溶液加至B管，轻轻吹打混匀，室温静置10min；将混匀液以绕圈的形式轻柔加至细胞培养孔内，轻轻晃动培养板以混匀与细胞孵育4h；
步骤3：孵育完将24孔板内样品溶液弃去，加入1mL PBST放于摇床上清洗3分钟，重复清洗3次后制备细胞爬片；
步骤4：用500μL4％多聚甲醛对步骤3所述细胞爬片固定15分钟，弃去后加入1mLPBST放于摇床上清洗3分钟，重复清洗3次，得到滤去水分的爬片；
步骤5：取干净载玻片，做好标记，载玻片上加5μL抗荧光猝灭封片液(含DAPI)，将滤去水分的爬片倒扣于抗荧光猝灭封片液上，避免产生气泡，指甲油封片；
步骤6：避光，置于4℃，待指甲油干燥后可在激光共聚焦显微镜下拍摄记录，结果见图7中的A。
以L02为阴性细胞，HeLa、MCF-7、HepG2为阳性细胞利用qPCR的方法检测上述细胞中TK1 mRNA的表达量，具体方法如下：
(1)提取细胞及组织RNA过程所使用的材料试剂均需要去酶；
(2)以6cm细胞培养皿为例，取对数生长期的细胞，弃去旧培养基，侧壁加入1mL去酶PBS清洗2次；
(3)加入1mLTrizol溶液，轻轻摇晃使Trizol试剂均匀覆盖皿底，冰上静置5min；移液枪吹打皿底，将含有细胞的Trizol溶液收集至去酶1.5mL EP管中；
(4)向管中加入200μL氯仿溶液，剧烈震荡15s，4℃，12000g，离心15min；
(5)小心吸取500μL上清至新的去酶1.5mLEP管，注意不要吸到蛋白层及下层有机相，加入等体积异丙醇溶液，颠倒混匀，放置于-80℃冰箱中过夜以沉淀更多的RNA；
(6)4℃，12000g，离心10min后弃去上清，此时管底有少量白色沉淀，加入1mL现配预冷的去酶75％酒精溶液，用移液枪轻轻吹洗沉淀，4℃，12000g，离心5min；
(7)弃去上清，点离后用10μL移液枪吸去残留液体，将去酶管置于通风橱内干燥，当白色沉淀刚刚变至透明状态时，视沉淀量多少加入适量去酶水溶解RNA，通常为15～30μL，提取好的RNA置于-80℃保存；
(8)将溶解好的RNA吹打混匀后，Nanodrop 2000分光光度仪测定RNA浓度，A260/280数值在1.8～2.0之间时，表明RNA纯度较高，可进行逆转录；
(9)RNA逆转录
在RNase-free离心管中配制如下混合液(RNA逆转录试剂为南京诺唯赞公司生产的III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR，货号为R333)：
用移液器轻轻吹打10次至充分混匀，短暂离心收集至管底；
(10)逆转录反应程序：50℃，15min→85℃，5sec；
逆转录产物可立即用于qPCR反应；
(11)qPCR
在qPCR管中配制如下混合液(qPCR试剂为南京诺唯赞公司生产的Taq ProUniversal SYBR qPCRMasterMix，货号为Q712)：
(12)qPCR反应程序
所述qPCR所用的引物为TK1-F和TK1-R，具体序列信息如下：
TK1-F：5’-GCACAGAGTTGATGAGACGC-3’，SEQ ID NO.15；
TK1-R：5’-CTCCATGGTGTTCCGGTCAT-3’，SEQ ID NO.16。
qPCR的结果见图7中的B。
由图7中的A和B的结果可知，L02的荧光强度明显低于各阳性细胞。而阳性细胞中，HeLa、MCF-7、HepG2的荧光检测强度依次增强，证明了其在活细胞体内成像中的潜在应用。
综上所述，本发明提供了高保真检测TK1 mRNA快速高效的新方法，同时为检测长片段提供了一种新策略，对于早期诊断和个性化治疗具有重要的意义。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种双重催化发夹自组装的序列组，其特征在于，所述序列组包括：连接序列Linker、锁链Lock1、锁链Lock2、发卡H1、发卡H2、发卡H3和发卡H4；
所述连接序列Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述锁链Lock1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述锁链Lock2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述发卡H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述发卡H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述发卡H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述发卡H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述连接序列Linker的5’端修饰淬灭基团；所述锁链Lock1的3’端修饰荧光基团。
2.根据权利要求1所述的序列组，其特征在于，所述淬灭基团包括BHQ1；所述荧光基团包括FAM。
3.根据权利要求1所述的序列组，其特征在于，所述连接序列Linker、锁链Lock1、锁链Lock2、发卡H1、发卡H2、发卡H3和发卡H4的摩尔比为1：1：1：1：1：1：1。
4.一种检测胸苷激酶1mRNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的序列组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Tris-HCl缓冲液、TE缓冲液和ddH2O。
6.权利要求1～3任一项所述序列组或权利要求4或5所述的试剂盒在检测胸苷激酶1mRNA中的应用。
7.权利要求1～3任一项所述序列组或权利要求4或5所述的试剂盒在制备疾病诊断产品中的应用，所述疾病包括以胸苷激酶1为生物标志物的疾病。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述疾病包括癌症。
9.一种检测胸苷激酶1mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1～3任一项所述序列组与待测样品混合，进行双重催化发夹自组装反应，检测反应后的混合物的荧光强度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述双重催化发夹自组装反应的温度为37℃；所述双重催化发夹自组装反应的反应时间为1h。
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