CN113249471A - 一种用于检测肝癌的生物标志物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物标志物组合，其包括具体检测的基因组合，基因组合包含PTPN18、SEPT9、GALR3、TFR2、MAP6D1、TMEM240、ACTB、SDK1中的两种以上的基因组合。本发明的优点是：不需要穿刺，具有更好灵敏度的体外诊断方法。
Description
技术领域
本发明涉及癌症辅助诊断领域，涉及一种用于检测肝癌的生物标志物组合，具体的，涉及包含该组合物的试剂盒。
背景技术
癌症是一种恶性肿瘤，根据《2019中国癌症登记年报》发布的结果，共统计了368个癌症登记点。就发布的结果数据显示，中国2015年新增癌症病例392.9万例，占全球新发病例的1/4，癌症死亡病例233.8万例。全国每天有约1万人确诊癌症，每分钟有约7.5人被确诊为癌症。近10多年来，恶性肿瘤发病率每年保持3.9%的增幅，死亡率每年保持2.5%的增幅。
在我国，由于肝炎患者和长期饮用烈性酒的人群比例较高，导致肝癌成为我国高发的恶性肿瘤疾病。根据《2019中国癌症登记年报》发布的结果，肝癌在男性和女性的恶性肿瘤中的发生率分别为12.74%（排名第三）和5.4%（排名第七），而死亡率更是分别为16.36%（排名第二）和9.79%（排名第三）。而对于60岁以下人群来说，肝癌仍是最常见和致死率最高的肿瘤之一。
目前而言，肝癌最主要的筛查手段是通过甲胎蛋白（AFP）进行检测，对于高风险人群再通过超声、核磁等影像学手段进一步检查。对于可以病灶时，用于确诊的金标准手段是肝穿刺活检。然而上述三种检测手段都各有其局限性，根据文献报道，在检测特异性为95%时，甲胎蛋白（AFP）检测的灵敏度为45%。超声检测灵敏度有限，同时也不能用于确诊。作为诊断金标准的肝穿刺活检则不仅有很大的侵入性，且有引起肿瘤扩散的风险。不仅如此，由于肿瘤有普遍的肿瘤内异质性存在，导致很多时候肝穿刺活检并不能显示肿瘤的全貌。
大量临床及科学研究证明，表观遗传学的变化在癌症的发生、发展中起着极其重要的作用。而基因组水平的甲基化作为表观遗传学的一种重要机制，也受到了广泛的关注，例如抑癌基因的甲基化是导致肿瘤发生的重要分子机制之一。相比于基因突变等其他基因组水平的变化，DNA甲基化的改变会在更早期的癌症中被发现。
因此，基于上述背景，一个无创的、全局的、具有更好灵敏度的体外诊断方法在肝癌的辅助诊断的临床应用场景中，有较为迫切的需求。
发明内容
针对现有技术存在的对于AFP阴性的肝癌患者、影像学上难以判断的患者以及不愿意接受穿刺活检的患者，本发明提供了一种用于检测肝癌的生物标志物组合。本发明提供的体外诊断体系能够敏感和特异的检测肝癌，包括早期和AFP阴性的肝癌患者。本发明还包括了所述一种用于包装生物标志物组合的试剂盒以及其在检测肝癌中的方法。
本发明提供了一种用于检测肝癌的生物标志物组合。
生物标志物组合，其包括具体检测的基因组合，基因组合包含PTPN18、SEPT9、GALR3、TFR2、MAP6D1、TMEM240、ACTB、SDK1中的两种以上的基因组合。
其中PTPN18基因编码了一个蛋白酪氨酸残基磷酸化酶（PTP）家族的蛋白。PTP家族蛋白作为信号分子参与多种多样的细胞过程，包括细胞生长、分化、有丝分裂和癌变过程。该PTP包含一个PEST结构域，常服务于蛋白-蛋白相互作用，可能与蛋白在细胞内的半衰期有关。该蛋白能够差异化的去磷酸化自动磷酸化在肿瘤组织中过表达的酪氨酸激酶，例如该蛋白被发现参与HER2的调节。
SEPT9基因属于Septin基因家族，参与细胞分裂、细胞周期的控制。该基因是卵巢肿瘤的一个潜在的抑癌基因。
TSPYL5参与调节细胞生长和对伽马辐射的细胞响应，此调节作用可能通过Akt信号通路。参与p53/TP53的调节，抑制p53/TP53蛋白水平，同时促进期泛素化；该功能依赖于USP7，但独立于MDM2。
TFR2基因编码一个单程II型膜蛋白，是类转铁受体蛋白家族的一员。该蛋白调节细胞吸收转铁蛋白结合的铁元素，可能参与铁元素的代谢、肝细胞功能和红细胞分化等过程。
ACTB基因编码的是细胞骨架肌动蛋白，是常用的管家基因之一。
所述PTPN18基因的靶序列如SEQ ID NO:1所示：
SEQ ID NO:1：
TTTTTTTTTTTATTTAGCGTATCGTTTCGGCGGGAAGGAAGTTCGTGGTTTGCGCGTTGAGTAGTTTTTTTATTTTCGTTTTGTTTAGCGTCGTCGTTTTATTTTTTTTCGGTTTTTTTTGTTTGTAGGAGTATTTTTGTGTTCGGGTTTTCGGGTTACGTTATGGTTGATATTTACGCGGTGGTGTAGAAGCGCGGGGTTTTAGCGGGCGTCGGGAGTGGGACGTAGACGGGGACGGGGACGGGGACGGGGGCGCGTAGCGCGGAGGAGGCGTCGTTTTATAGTAAGGTGACGTCGCGCGTTTAGCGATTCGGGGCGTACGCGGAGGACGCGAGGGGGACGTTGTTTGGTCGCGGTGAGTCGAGGTTTGTTTTTTTTTAGGGTATTATTTTGTTGTGATTCGTAGGGCGGAATTATTTTGTAGTGGTTCGTTAGGTTTTGGCGGTCGCGGGGATTTTAGTCGTTAGTTTGGTTACGTTTCGACGTTGATGTTTAGGCG；
其中，所述SEPT9基因属于Septin基因家族，参与细胞分裂、细胞周期的控制。该基因是卵巢肿瘤的一个潜在的抑癌基因。
所述SEPT9基因的靶序列如SEQ ID NO:2所示：
SEQ ID NO:2：
TAGGCGGGGAGGAGGGGGGCGTTTCGGTCGTGTGTTTAGGATTGTTTTTTAGCGGTTATTCGGGTTTTAGTTTTTTAGGTTTGGTTTTGATAGGCGGGCGGAGTAGTTAGTGCGAGATAGGGAGGTCGGTGCGGGTGCGGGAATTTGATTCGTTCGGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGTAGCGCGCGGGGAGGGGTCGGCGTTCGTTTTTTTTTTTTATTTATTTAGTTGAGTTAGGGGGTTTAGGGGTTTTTTCGGCGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAGCGCGGGCGCGGCGTTTTAGTTAGCGCGTAGGGTTCGGGTTTCGTCGGGGGCGTTTTTTCGTCGTTGTTTTTCGCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAAT；
其中所述的GALR3编码的人甘丙肽受体蛋白的一个基因，人神经元肽甘丙肽调节多种生理过程包括认知/记忆、感觉/痛觉处理、激素分泌和觅食行为。
所述GALR3基因的靶序列如SEQ ID NO:5所示：
SEQ ID NO:5：
GATTTTATTTGACGTATTTATAAAATAATTTTAGAAATAATAAGTTATCGGGATCGGGTTTTTGTTAGGTGTAAGGGTTTAAGTATTTTGCGCGTTTATATTTTTAATTTTCGTTACGTTTTTTACGGTTTATAGGAGGCGTATTGGGTCGTAGGGTTCGGGCGCGGGACGTGGCGCGGGTTTTTGCGGGAGGGTATTTGTTCGTTTCGTTGATTAGGCGTTTTTCGTAGGTATTTGGTCGTGCGGTATTCGTTGCGTTCGCGCGTTTTGCGTACGTCGCGTAACGTTCGCGTCGTAGTGGGGTTGGTGTGGTTGTTGGCGGCGTTTTTTTCGGCGTTTTATTTTAGTTATTACGGTATCGTGCGTTACGGCGCGTTGGAGTTTTGCGTGTTCGTTTGGGA；
其中所述的TFR2基因编码一个单程II型膜蛋白，是类转铁受体蛋白家族的一员。该蛋白调节细胞吸收转铁蛋白结合的铁元素，可能参与铁元素的代谢、肝细胞功能和红细胞分化等过程。
所述TFR2基因的靶序列如SEQ ID NO:6所示：
SEQ ID NO:6：
TTTTTTTTGTTTATTTTATTATTTTGATCGTTCGGGTTTTTTAGTTTGATCGATTTATGAGTATTGCGTGTTTAGGATTGGGAAGAGAGTATTTAGAGGATCGGGATTGTGTAGGCGGGGAGAGAGAGGAGCGCGTAGACGGGGTTAGGTTTAGGAGGTGGAGTTTTAGGGGAGGGGCGGGATATTGGGGGCGGGGCGAGGAGGGCGGGGTTTTATTCGTATTATGCGTACGTTGTATATGCGTGTTAGTCGTTCGTTTTTTTTTTTCGAGTTGTAGATTTTTTGTCGTAGTTTTTTCGTCGTTCGGATGTAGTTTTTTCGCGTCGAGTATATTTATTGTAGGGTTAGTTCGCGGGTTTGGGGTGGGGAGGCGCGGGTTGGGGTTGGCGGTAGGGGTTAGGATTTTCGTTTAGTATGGGGATAAGGATTTTCGTTTAGTATGGGGAAGGGGGTTGGGATTTTTGGTCGTAGGAGGGAGGAGGTAGACGA；
其中所述的MAP6D1基因是蛋白编码基因，该基因功能在基因富集分析注释中显示为于微管结合和钙调素结合有关。
所述MAP6D1基因的靶序列如SEQ ID NO:7所示：
SEQ ID NO:7：
TTTGCGTTCGGTTTTTATTATTAACGTTCGTATATTAGGTAGTGATCGGAGAGAGTTGGGGGATATGGTTTGCGCGTATTTTTCGTACGGTTAGGTTCGGCGGTGGGAGTTAAAGGGAGGTCGGTTTTAATTCGGTTGAAGGTAGGTTATTTTGACGGTTGTTTTTAGGAGGGCGGTTGCGAGGGTAGCGGTGCGTTTTCGGTACGGGGGTGTTCGAGTATTGAGTTCGGGTATGGAGTAGCGAAGGCGTCGTTTGTAGTGTTTACGGATTAAACGGGGGTGATTTTTGAGGTCGTCGGTAGTTTCGAGGTCGCGTGGGATTCGGGTTTTAGGCGTTTTCGTTTTGTCGTTTATTTTATTTTTTTGGTTTCGGGTTTTCGCGTTTTTTTATTATAGGGTGGGGATTCGTTGCGGTTTTTATTTAGTTTATATTTGTACGACGTGGTTATTGTTGTAGTCGCGTTCGCGTCGTCGATGGGTAGTACGTAGATTTCGCGGGCGTCGGGCGTAGGTGGCGCGGAGGATTGCGCGGAGGATTTGTTTTTGCGGTCGTTCGTTTTCGGTTCGCGTTTCGGCGGCGGATTTTTGGGTTCGGCGGG；
其中所述的TMEM240基因编码的是一个含有穿膜结构域的蛋白，并被发现存在于大脑和小脑中。
所述TMEM240基因的靶序列如SEQ ID NO:8所示：
SEQ ID NO:8：
TTGGGGAGGGGAGCGTAGGTCGGGGTGGGGGGAGCGTAGGTTCGGGAGGGGATCGCGGGTCGGGGAGGGGGAAGCGTAGGTCGGGGTGGGGGGAGCGTAGGTCGGAGAGAGGAGCGTAGGGAGTGTGGGGATCGTAGGTTGGGGAGGGGAGCGGAGGTCGGGGTGGGGGAGCGTAGGTCGGGGAGGGGAGCGTAGGTCGGGGAGGGGAGCGTAGGTCGGGGAGGGGAGCGTAGGTCGTACGGGCGGTAAATAAGGCGCGGGAGGTGGGTTAGGCGGCGCGCGCGGGCGGGGAGTAGGGGGCGCGCGCGGGAAGTTTTTTCGTTTATTATTACGATCGACGTTTTTAGAATTATGAAGATTATGGTGTTCGCGTTTATGGATATCGGGCGGGGTCGGGTCGGGTCGGAGCGTCGTTTTTCGGTTTCGGCGTTTTTTCGGTTTCGGTTCGATGTTGAGTTTTCGTCGTTTTCGTAGAGGTTAGCGTTTTTTTGGATCGTTCGTCGTCGTTCGTTGTAATTTCGGTATCGGTCGGGGGGAGGAGGCGCGGGGGGGGG；
其中所述的ACTB基因编码的是细胞骨架肌动蛋白，是常用的管家基因之一。
所述ACTB基因的靶序列如SEQ ID NO:9所示：
SEQ ID NO:9：
CCAGAGTGCAGGTGTGTGGAGATCCCTCCTGCCTTGACATTGAGCAGCCTTAGAGGGTGGGGGAGGCTCAGGGGTCAGGTCTCTGTTCCTGCTTATTGGGGAGTTCCTGGCCTGGCCCTTCTATGTCTCCCCAGGTACCCCAGTTTTTCTGGGTTCACCCAGAGTGCAGATGCTTGAGGAGGTGGGAAGGGACTATTTGGGGGTGTCTGGCTCAGGTGCCATGCCTCACTGGGGCTGGTTGGCACCTGCATTTCCTGGGAGTGGGGCTGTCTCAGGGTAGCTGGGCACGGTGTTCCCTTGAGTGGGGGTGTAGTGGGTGTTCCTAGCTGCCACGCCTTTGCCTTCACCTATGGGATCGTGGCTGTCAGCCTTGAGGGTCAGCCTGGCCCAGGCTCCCATAGGCTTAGGAGAGGCCGCAATTCCTACCTGTTCATCCAGACAGAGGGGGACCTGGAATCAAAGTCAAGTTGGGGTAGGGGGTCCATGGGGCCATATCTGGCCTGCAGACAGCTCTGGTTAGCTATGGGCTGAGGTCTGGATTCTGCCTTGTGACTGGAGACTGGGCGCCATCCCGTGGCCTCTGAGGGCCCAGTTTGTTCGTGACCCATGCTGCAGAGGGAGATACCCAGGCTCCTGGACCTCAGGGCCTGCCTGGCACTGCAGGCCAGGTTCTCTTTTTATTTCTGAGACGGGGTCTTGTGTTGCCCAGGCTGGAGTGTAATGGCACAACCATGGCTCACTGCAGCCTCAACTTTGGGCTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGAAACTACACAGGCATGCCCCAGCACGCCCAGCTAGTTGCAGGTCAGATTCTCATTGTTCTACAGGGCCCTGAGTTAAATACTCTCGCAAGAAGA；
SDK1编码的是一个免疫球蛋白超级家族的蛋白。
序列：
chr7:4184400-4184600
CCACTCCACGAAGAGGCAGCACTGATGAGACCGGAGCGCGGCTCTGTTCCCCCCGTGCGT
CCTCCCTTGTTTAACTCCAGCAGTTGATTTTTTTTGGAAGCCACAGCGCCCCGTCATTTC
TGGTTTTAATCAGCGCAGGAGCTCAGCCGCTGGACCACACGTTGTCTGTGAGCCAGGCAG
GGTGCGGACTGGAGCTGCAGA。
优选的，所述核酸检测的序列分别等同于或互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:1和2的连续序列中的至少10个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
优选的，所述组合物包括如下的引物、探针中的一种或多种组合；
PTPN18引物F
SEQ ID NO:10 TGATATTTAYGYGGTGGTGTAG
PTPN18引物R
SEQ ID NO:11 CATCTACATCCCACTCCC
PTPN18探针；
SEQ ID NO:12 AGCGCGGGGTTTTAGCGG；
SEPT9引物F
SEQ ID NO:13 GTGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAG
SEPT9引物R
SEQ ID NO:14 ACAAAACCCAAACCCTAC
SEPT9探针
SEQ ID NO:15 CGGGCGCGGCGTTTTAGT；
GALR3引物F
SEQ ID NO:22 GTATTTGGTCGTGCGGTATT
GALR3引物R
SEQ ID NO:23 ACACCAACCCCACTACGA
GALR3探针
SEQ ID NO:24 TTTGCGTACGTCGCGTAACGT；
TFR2引物F
SEQ ID NO:25 GGGGTTTTATTCGTATTATGCGT
TFR2引物R
SEQ ID NO:26 ACGACAAAAAATCTACAACTCGA
TFR2探针
SEQ ID NO:27 CGTTGTATATGCGTGTTAGTCGTTCG；
MAP6D1引物F
SEQ ID NO:28 TTTTTGAGGTCGTCGGTAGT
MAP6D1引物R
SEQ ID NO:29 AACGAAAACGCCTAAAACCC
MAP6D1探针
SEQ ID NO:30 TCGAGGTCGCGTGGGATTC；
TMEM240引物F
SEQ ID NO:31 TAAATAAGGCGCGGGAGGT
TMEM240引物R
SEQ ID NO:32 CGAAAAAACTTCCCGCGC
TMEM240探针
SEQ ID NO:33 CGCGCGGGCGGGGAGTA；
ACTB引物F
SEQ ID NO:34 TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT
ACTB引物R
SEQ ID NO:35 AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
ACTB探针
SEQ ID NO:36 ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA；
SDK1 引物F
AGGCAGTATTGATGAGA
SDK1 引物R
ACTACTAAAATTAAACAA
SDK1 探针P
GATCGGAGCGCGGTTTTT。
本发明提供了包括所述组合物的试剂盒。
所述的试剂盒还包括用于容纳患者生物样本的容器，所述的试剂盒也包括使用和解释检测结果的说明。
本发明通过分析肝癌组织、配对的癌旁组织、肝炎患者血浆游离DNA和正常人血浆游离DNA的全基因组甲基化数据，发现并确定了8个在肝癌中发生甲基化异常的靶序列；同时，通过这8个基因或其中一种组合的靶序列结合，能够灵敏、特异的从血浆游离DNA中检测并区分肝癌患者和正常对照个体。通过检测临床肝癌及肝炎样本的数据显示，本发明提供的组合可以有效区分肝癌和其余肝病患者。
一种体外检测肝癌的方法，所述方法包括以下步骤：
1）分离待测生物样本中的基因组DNA或血浆游离DNA；
2）确定所述目标基因或者基因组合靶序列的甲基化状态；
3）通过所述目标基因或者基因组合靶序列的甲基化状态的结果，进行生物样品状态的判断，并实现对肝癌的体外检测。
根据某些优选的实施方式，所述方法还包括以下步骤：
1）提取待测生物样本的血浆游离DNA；
2）使用试剂处理步骤1）得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化为尿嘧啶或其他碱基以后的碱基在杂交能力上不同于5位未甲基化的胞嘧啶，并且使可以检测的；
3）将步骤2）处理过的DNA样品与聚合酶链式反应体系组合，聚合酶链式反应体系包含以下一种等几种组分：DNA聚合酶、所述目标靶序列的引物或者引物组合、聚合酶链式反应缓冲液，发生聚合酶链式反应后，产生扩增产物；
4）用被荧光标记的一种探针或几种探针的组合检测扩增产物，如果探针和扩增产物结合，则可以产生荧光信号；如果探针无法和扩增产物结合，则不能产生荧光信号；
5）基于是否产生荧光信号，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG的甲基化状态。
优选的，引物包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:1和2的连续序列中的至少10个核苷酸的片段或其互补序列。
所述的聚合酶链式反应体系中，DNA聚合酶，包括使用耐热DNA聚合酶、热启动的DNA聚合酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶，所述的引物和探针组合包含上述的一个或几个基因的靶序列组合。
所述目标基因靶序列中至少一个CpG的甲基化状态是由PCR反应的循环阈值Ct值或靶基因与参考基因的Ct值之间的差值进行确定。通过利用PCR反应分析生物样本中DNA的甲基化状态，能够方便的实现一个或多个目标基因靶序列的甲基化状态的检测，并且能够通过一个或多个目标基因靶序列的甲基化状态来判断所检测生物样本是否呈阳性。
所述的生物样本包括：细胞系、福尔马林固定石蜡包埋组织、新鲜组织、体液、粪便、尿液、全血、白细胞、血浆或其组合。
优选的生物样本为血浆。
本发明的优点是：不需要穿刺，具有更好灵敏度的体外诊断方法。
附图说明
本发明的上述的特点和优势会通过下面结合附图详细描述作进一步的说明和展现。但这些附图仅表示根据本发明的若干示例的实施方式，不应被理解为对本发明保护范围的限制。除非特别说明，附图不必是成比例的，并且其中类似的标号表示类似的部件。
图1为使用本发明提供的组合物和检测方法对肝癌血浆游离DNA（目标基因靶序列甲基化状态为阳性标准品）的检测。结果显示：本发明所述的组合物及一种基因组合的靶序列检测结果为阳性。
图2为使用本发明提供的组合物和检测方法对肝炎血浆游离DNA（目标基因靶序列甲基化状态为阳性标准品）的检测。结果显示：本发明所述的组合物及一种基因组合的靶序列检测结果为阴性。
图3为利用所述组合物和检测方法，通过检测组合基因靶序列的甲基化状态，实现对肝癌的体外无创检测，并通过10乘交叉验证获得的ROC曲线。
具体实施方式
除非另外定义，本说明书中有关技术和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与本发明所述相似或相同的材料和方法，本发明在下文中对材料和方法做了描述。在发生冲突的情况下，以本发明说明书中包括其中定义为准，另外，下述的材料、方法和例子仅供说明，不具有限制性。
本发明提供了一组在肝癌中发生异常甲基化编号的目标基因靶序列，包括PTPN18、SEPT9、GALR3、TFR2、MAP6D1、TMEM240、ACTB、SDK1中的两种以上的基因组合。
分别如：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；一种能灵敏和特异的检测目标基因或基因组合的靶序列甲基化状态的组合物；和一种可用于体外无创检测肝癌的方法和试剂盒。
下述描述为本发明的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的实施例。
第一组实施方案公开了用于检测目标基因靶序列甲基化状态的组合物，包括用于检测目标基因靶序列甲基化状态的引物、探针组合；第二组实施方案公开了一种通过检测一种基因组合的目标基因靶序列甲基化状态进行体外无创检测肝癌的方法。
所述核酸检测的序列包括所述目标靶序列中的至少10个核苷酸片段，其中所述核苷酸片段包含或不包含CpG二核苷酸序列。
所述核酸检测的序列分别等同于或互补于或在中等精确或精确条件下杂交于选自SEQ ID 1~9的连续序列中的至少10个核苷酸的片段，其中包括至少一个CpG二核苷酸序列。
其中，所述PTPN18基因编码了一个蛋白酪氨酸残基磷酸化酶（PTP）家族的蛋白。PTP家族蛋白作为信号分子参与多种多样的细胞过程，包括细胞生长、分化、有丝分裂和癌变过程。该PTP包含一个PEST结构域，常服务于蛋白-蛋白相互作用，可能与蛋白在细胞内的半衰期有关。该蛋白能够差异化的去磷酸化自动磷酸化在肿瘤组织中过表达的酪氨酸激酶，例如该蛋白被发现参与HER2的调节。
在上述实施方式中，所述组合物还包括将DNA的5位未甲基化的胞嘧啶转化位尿嘧啶的试剂。其试剂为亚硫酸氢盐。DNA的亚硫酸氢盐转化为已知的用于评估CpG甲基化状态的检测方法。胞嘧啶5号位的甲基化修饰，是广泛存在于真核细胞生物中的一种DNA修饰方式，DNA上的甲基化修饰不仅在生物的生长发育中起到重要作用，在细胞的原癌化过程中也起着非常重要的作用。由于和胞嘧啶具有一样的碱基互补配对性质，5-甲基胞嘧啶无法通过一代测序或高通量测序的方式来直接测定。目前最常用的检测5-甲基胞嘧啶的方法是将待测DNA通过亚硫酸氢盐转化，在碱性水解后，没有甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶则不会发生转化。尿嘧啶在碱基互补配对的时候会与腺嘌呤互补配对，区别于胞嘧啶与鸟嘌呤的互补配对，因此通过对经过亚硫酸氢盐处理的DNA进行检测时，借助测序技术，或者聚合酶链式反应技术，或者DNA分子杂交相关的技术，可以确定剩余的未发生转化的胞嘧啶，从而确定在原始DNA分子中，哪些胞嘧啶发生了甲基化。
本发明提供了一种通过甲基化转化试剂，试剂为亚硫酸氢盐，对待检的DNA样本进行处理后，通过测序、聚合酶链式反应或DNA分子杂交等相关技术，确定目标基因靶序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化状态。此外，本发明的方法适用于分析混合状态的样本，例如血液、粪便或组织中存在的低浓度肿瘤细胞。因此，当分析这类样本中的CpG二核苷酸序列的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定的方法来确定CpG二核苷酸序列的甲基化水平，如百分比、比率、分数或程度等，而不是单核苷酸分子的甲基化修饰状态。相应的，本发明中所述的甲基化状态应被认为时包括单核苷酸分子的甲基化修饰状态在内的，包含定量甲基化水平来反应的甲基化状态。1）在某些实施方式中，本发明的方法具体包括：提取待测生物样本的血浆游离DNA；2）使用试剂处理步骤1）得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化为尿嘧啶或其他碱基以后的碱基在杂交能力上不同于5位未甲基化的胞嘧啶，并且使可以检测的；3）将步骤2）处理过的DNA样品与聚合酶链式反应体系组合，聚合酶链式反应体系包含以下一种等几种组分：DNA聚合酶、所述目标靶序列的引物或者引物组合、聚合酶链式反应缓冲液，发生聚合酶链式反应后，产生扩增产物；4）用被荧光标记的一种探针或几种探针的组合检测扩增产物，如果探针和扩增产物结合，则可以产生荧光信号；如果探针无法和扩增产物结合，则不能产生荧光信号；5）基于是否产生荧光信号，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG的甲基化状态。
典型的，引物包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:1和2的连续序列中的至少10个核苷酸的片段或其互补序列。并且所述的聚合酶链式反应体系中，DNA聚合酶，包括使用耐热DNA聚合酶、热启动的DNA聚合酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶，所述的引物和探针组合包含上述的一个或几个基因的靶序列组合。优选的，用实时荧光定量PCR方式来测定甲基化状态，诸如：使用Taqman探针的实时荧光定量PCR，使用荧光染料的实时荧光定量PCR，使用甲基化特异性PCR（MSP）等方法，用于测定目标基因靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。其中，用实时荧光定量PCR方式在PCR步骤后不需要进一步的操作。实时荧光定量PCR方式以基因组DNA的混合样品开始，使用例如亚硫酸氢盐处理样本基因组DNA使得基因组DNA中的未甲基化的胞嘧啶转变成为尿嘧啶，随后在实时荧光定量PCR检测方式中，使用重叠已知CpG二核苷酸的荧光探针中进行实时荧光定量的PCR。由于不同甲基化状态的基因目标靶序列的碱基互补配对能力不同，因此可以通过实时荧光定量PCR进行基因组DNA样品中甲基化状态的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。在该定量方式中，PCR反应提供了甲基化特异的扩增及甲基化特异的荧光信号。作为对照，本发明中使用ACTB基因，通过设计引物探针均不覆盖任何CpG二核苷酸的位置，对于投入的经试剂处理后的基因组DNA进行检测。实时荧光定量PCR可以与任何适合的探针一起使用，如Taqman探针、MGB探针、蝎形探针等。所述的荧光探针常规包含一个发光基团、一段核酸序列、一个猝灭基团，及有必要时所进行的一些化学修饰或者特殊核苷酸，如硫代核苷酸、锁核酸等。一般实时荧光定量PCR检测过程中，探针会被设计的熔解温度超过正向和反向引物10℃，这使得探针在退火及延伸过程中会完全结合在PCR产物上。典型的，例如Taqman探针，会在具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶的作用下，在延伸过程中发生探针的水解，使得探针中的荧光基团和猝灭基团远离，从而破坏荧光基团和猝灭基团间的共振能量传递，使得荧光基团发出的荧光可以被仪器检测到，同时随着PCR产物的逐渐增多，荧光信号会在一定时间内呈现指数级别的上升，最后在荧光定量QPCR仪上呈现“S”型的扩增曲线。用于实时荧光定量PCR的反应试剂可以包括，但不限于：目标基因靶序列的正反向PCR引物、Taqman荧光探针、优化的PCR缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶等。
实施例1
第一步，使用磁珠法提取试剂，提取待测生物样本的血浆游离DNA，其中选择一例为肝癌患者，一例为肝炎患者。
第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入5ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
第三步，将转化后的血浆游离DNA投入到含有如下4个基因靶序列的实时荧光定量PCR的反应体系中，分别为：PTPN18、SEPT9、TSPYL5、ACTB。其中用于检测PTPN18的荧光探针使用FAM荧光染料标记、用于检测SEPT9的荧光探针使用ROX荧光染料标记、用于检测TSPYL5的荧光探针使用Cy5荧光染料标记、用于检测ACTB的荧光探针使用HEX荧光染料标记。反应体系中，靶基因序列的正反向引物投入浓度为0.1 μM，探针投入浓度为0.07 μM，实时荧光定量PCR反应体系为20 μL。
其中检测用的引物探针序列如下所示：
PTPN18引物F
SEQ ID NO:10 TGATATTTAYGYGGTGGTGTAG
PTPN18引物R
SEQ ID NO:11 CATCTACATCCCACTCCC
PTPN18探针
SEQ ID NO:12 AGCGCGGGGTTTTAGCGG
SEPT9引物F
SEQ ID NO:13 GTGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAG
SEPT9引物R
SEQ ID NO:14 ACAAAACCCAAACCCTAC
SEPT9探针
SEQ ID NO:15 CGGGCGCGGCGTTTTAGT
ACTB引物F
SEQ ID NO:34 TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT
ACTB引物R
SEQ ID NO:35 AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
ACTB探针
SEQ ID NO:36 ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA
第四步，设置荧光定量PCR反应检测程序：
95℃保持5分钟，在扩增循环中95℃保持15秒，60℃保持1分钟同时进行荧光采集，并循环40次。
第五步，获得荧光定量PCR反应检测结果，检测结果如图1、2所示，图1为肝癌患者样本结果，所有待检测基因的荧光信号都有检出，为阳性；图2为肝炎患者样本，仅有对照基因ACTB的荧光信号被检出，其余待检测基因荧光信号未检出，为阴性。
实施例2
第一步，得到331名肝炎及肝癌患者，其中肝炎样本为162例，肝癌样本为169例，同时还有20名正常人的血浆样本。提取样本的游离血浆DNA。
第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入10ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
第三步，将转化后的血浆游离DNA，取出一半投入到含有如下4个基因靶序列的实时荧光定量PCR的反应体系中，分别为：PTPN18、SEPT9、TSPYL5、ACTB。其中用于检测PTPN18的荧光探针使用FAM荧光染料标记、用于检测SEPT9的荧光探针使用ROX荧光染料标记、用于检测TSPYL5的荧光探针使用Cy5荧光染料标记、用于检测ACTB的荧光探针使用HEX荧光染料标记。反应体系中，靶基因序列的正反向引物投入浓度为0.1 μM，探针投入浓度为0.07 μM，实时荧光定量PCR反应体系为20 μL。取出另一半投入到含有如下4个基因靶序列的实时荧光定量PCR的反应体系中，分别为：OTX1、GALR3、TFR2、ACTB。其中用于检测OTX1的荧光探针使用FAM荧光染料标记、用于检测GALR3的荧光探针使用ROX荧光染料标记、用于检测TFR2的荧光探针使用Cy5荧光染料标记、用于检测ACTB的荧光探针使用HEX荧光染料标记。反应体系中，靶基因序列的正反向引物投入浓度为0.1 μM，探针投入浓度为0.07 μM，实时荧光定量PCR反应体系为20 μL。
其中第一组反应体系所用的引物探针序列如下所示：
PTPN18引物F
SEQ ID NO:10 TGATATTTAYGYGGTGGTGTAG
PTPN18引物R
SEQ ID NO:11 CATCTACATCCCACTCCC
PTPN18探针
SEQ ID NO:12 AGCGCGGGGTTTTAGCGG
SEPT9引物F
SEQ ID NO:13 GTGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAG
SEPT9引物R
SEQ ID NO:14 ACAAAACCCAAACCCTAC
SEPT9探针
SEQ ID NO:15 CGGGCGCGGCGTTTTAGT
ACTB引物F
SEQ ID NO:34 TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT
ACTB引物R
SEQ ID NO:35 AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
ACTB探针
SEQ ID NO:36 ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA
其中第二组反应体系所用的引物探针序列如下所示：
GALR3引物F
SEQ ID NO:22 GTATTTGGTCGTGCGGTATT
GALR3引物R
SEQ ID NO:23 ACACCAACCCCACTACGA
GALR3探针
SEQ ID NO:24 TTTGCGTACGTCGCGTAACGT
TFR2引物F
SEQ ID NO:25 GGGGTTTTATTCGTATTATGCGT
TFR2引物R
SEQ ID NO:26 ACGACAAAAAATCTACAACTCGA
TFR2探针
SEQ ID NO:27 CGTTGTATATGCGTGTTAGTCGTTCG
ACTB引物F
SEQ ID NO:34 TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT
ACTB引物R
SEQ ID NO:35 AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
ACTB探针
SEQ ID NO:36 ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA
第四步，使用天隆TL988荧光定量PCR仪对反应体系进行检测，设置荧光定量PCR反应检测程序如下：
95℃保持5分钟，在扩增循环中95℃保持15秒，60℃保持1分钟同时进行荧光采集，并循环40次。
第五步，将两组反应体系中所检测到的结果中各基因的Ct值进行归一化，归一化公式为ΔCt(靶基因) = Ct(ACTB) - Ct(靶基因)。通过综合6个靶基因的ΔCt结果，对这351个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，如图3获得分类ROC曲线，其AUC=0.873。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (11)
1.一种生物标志物组合，其特征在于：包括具体检测的基因组合，基因组合包含PTPN18、SEPT9、GALR3、TFR2、MAP6D1、TMEM240、ACTB、SDK1中的两种以上的基因组合。
2.根据权利要求1所述的生物标志物组合，其特征在于：
所述PTPN18基因的靶序列如SEQ ID NO:1所示：
TTTTTTTTTTTATTTAGCGTATCGTTTCGGCGGGAAGGAAGTTCGTGGTTTGCGCGTTGAGTAGTTTTTTTATTTTCGTTTTGTTTAGCGTCGTCGTTTTATTTTTTTTCGGTTTTTTTTGTTTGTAGGAGTATTTTTGTGTTCGGGTTTTCGGGTTACGTTATGGTTGATATTTACGCGGTGGTGTAGAAGCGCGGGGTTTTAGCGGGCGTCGGGAGTGGGACGTAGACGGGGACGGGGACGGGGACGGGGGCGCGTAGCGCGGAGGAGGCGTCGTTTTATAGTAAGGTGACGTCGCGCGTTTAGCGATTCGGGGCGTACGCGGAGGACGCGAGGGGGACGTTGTTTGGTCGCGGTGAGTCGAGGTTTGTTTTTTTTTAGGGTATTATTTTGTTGTGATTCGTAGGGCGGAATTATTTTGTAGTGGTTCGTTAGGTTTTGGCGGTCGCGGGGATTTTAGTCGTTAGTTTGGTTACGTTTCGACGTTGATGTTTAGGCG；
所述SEPT9基因属于Septin基因家族，参与细胞分裂、细胞周期的控制；该基因是卵巢肿瘤的一个潜在的抑癌基因；
所述SEPT9基因的靶序列如SEQ ID NO:2所示：
TAGGCGGGGAGGAGGGGGGCGTTTCGGTCGTGTGTTTAGGATTGTTTTTTAGCGGTTATTCGGGTTTTAGTTTTTTAGGTTTGGTTTTGATAGGCGGGCGGAGTAGTTAGTGCGAGATAGGGAGGTCGGTGCGGGTGCGGGAATTTGATTCGTTCGGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGTAGCGCGCGGGGAGGGGTCGGCGTTCGTTTTTTTTTTTTATTTATTTAGTTGAGTTAGGGGGTTTAGGGGTTTTTTCGGCGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAGCGCGGGCGCGGCGTTTTAGTTAGCGCGTAGGGTTCGGGTTTCGTCGGGGGCGTTTTTTCGTCGTTGTTTTTCGCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGTCGGATTTCGCGGTTAAT；
所述的GALR3编码的人甘丙肽受体蛋白的一个基因，人神经元肽甘丙肽调节多种生理过程包括认知/记忆、感觉/痛觉处理、激素分泌和觅食行为；
所述GALR3基因的靶序列如SEQ ID NO:5所示：
GATTTTATTTGACGTATTTATAAAATAATTTTAGAAATAATAAGTTATCGGGATCGGGTTTTTGTTAGGTGTAAGGGTTTAAGTATTTTGCGCGTTTATATTTTTAATTTTCGTTACGTTTTTTACGGTTTATAGGAGGCGTATTGGGTCGTAGGGTTCGGGCGCGGGACGTGGCGCGGGTTTTTGCGGGAGGGTATTTGTTCGTTTCGTTGATTAGGCGTTTTTCGTAGGTATTTGGTCGTGCGGTATTCGTTGCGTTCGCGCGTTTTGCGTACGTCGCGTAACGTTCGCGTCGTAGTGGGGTTGGTGTGGTTGTTGGCGGCGTTTTTTTCGGCGTTTTATTTTAGTTATTACGGTATCGTGCGTTACGGCGCGTTGGAGTTTTGCGTGTTCGTTTGGGA；
所述的TFR2基因编码一个单程II型膜蛋白，是类转铁受体蛋白家族的一员；
该蛋白调节细胞吸收转铁蛋白结合的铁元素，可能参与铁元素的代谢、肝细胞功能和红细胞分化等过程；
所述TFR2基因的靶序列如SEQ ID NO:6所示：
TTTTTTTTGTTTATTTTATTATTTTGATCGTTCGGGTTTTTTAGTTTGATCGATTTATGAGTATTGCGTGTTTAGGATTGGGAAGAGAGTATTTAGAGGATCGGGATTGTGTAGGCGGGGAGAGAGAGGAGCGCGTAGACGGGGTTAGGTTTAGGAGGTGGAGTTTTAGGGGAGGGGCGGGATATTGGGGGCGGGGCGAGGAGGGCGGGGTTTTATTCGTATTATGCGTACGTTGTATATGCGTGTTAGTCGTTCGTTTTTTTTTTTCGAGTTGTAGATTTTTTGTCGTAGTTTTTTCGTCGTTCGGATGTAGTTTTTTCGCGTCGAGTATATTTATTGTAGGGTTAGTTCGCGGGTTTGGGGTGGGGAGGCGCGGGTTGGGGTTGGCGGTAGGGGTTAGGATTTTCGTTTAGTATGGGGATAAGGATTTTCGTTTAGTATGGGGAAGGGGGTTGGGATTTTTGGTCGTAGGAGGGAGGAGGTAGACGA；
所述的MAP6D1基因是蛋白编码基因，该基因功能在基因富集分析注释中显示为于微管结合和钙调素结合有关；
所述MAP6D1基因的靶序列如SEQ ID NO:7所示：
TTTGCGTTCGGTTTTTATTATTAACGTTCGTATATTAGGTAGTGATCGGAGAGAGTTGGGGGATATGGTTTGCGCGTATTTTTCGTACGGTTAGGTTCGGCGGTGGGAGTTAAAGGGAGGTCGGTTTTAATTCGGTTGAAGGTAGGTTATTTTGACGGTTGTTTTTAGGAGGGCGGTTGCGAGGGTAGCGGTGCGTTTTCGGTACGGGGGTGTTCGAGTATTGAGTTCGGGTATGGAGTAGCGAAGGCGTCGTTTGTAGTGTTTACGGATTAAACGGGGGTGATTTTTGAGGTCGTCGGTAGTTTCGAGGTCGCGTGGGATTCGGGTTTTAGGCGTTTTCGTTTTGTCGTTTATTTTATTTTTTTGGTTTCGGGTTTTCGCGTTTTTTTATTATAGGGTGGGGATTCGTTGCGGTTTTTATTTAGTTTATATTTGTACGACGTGGTTATTGTTGTAGTCGCGTTCGCGTCGTCGATGGGTAGTACGTAGATTTCGCGGGCGTCGGGCGTAGGTGGCGCGGAGGATTGCGCGGAGGATTTGTTTTTGCGGTCGTTCGTTTTCGGTTCGCGTTTCGGCGGCGGATTTTTGGGTTCGGCGGG；
所述的TMEM240基因编码的是一个含有穿膜结构域的蛋白，并被发现存在于大脑和小脑中；
所述TMEM240基因的靶序列如SEQ ID NO:8所示：
TTGGGGAGGGGAGCGTAGGTCGGGGTGGGGGGAGCGTAGGTTCGGGAGGGGATCGCGGGTCGGGGAGGGGGAAGCGTAGGTCGGGGTGGGGGGAGCGTAGGTCGGAGAGAGGAGCGTAGGGAGTGTGGGGATCGTAGGTTGGGGAGGGGAGCGGAGGTCGGGGTGGGGGAGCGTAGGTCGGGGAGGGGAGCGTAGGTCGGGGAGGGGAGCGTAGGTCGGGGAGGGGAGCGTAGGTCGTACGGGCGGTAAATAAGGCGCGGGAGGTGGGTTAGGCGGCGCGCGCGGGCGGGGAGTAGGGGGCGCGCGCGGGAAGTTTTTTCGTTTATTATTACGATCGACGTTTTTAGAATTATGAAGATTATGGTGTTCGCGTTTATGGATATCGGGCGGGGTCGGGTCGGGTCGGAGCGTCGTTTTTCGGTTTCGGCGTTTTTTCGGTTTCGGTTCGATGTTGAGTTTTCGTCGTTTTCGTAGAGGTTAGCGTTTTTTTGGATCGTTCGTCGTCGTTCGTTGTAATTTCGGTATCGGTCGGGGGGAGGAGGCGCGGGGGGGGG；
所述的ACTB基因编码的是细胞骨架肌动蛋白，是常用的管家基因之一；
所述ACTB基因的靶序列如SEQ ID NO:10所示：
CCAGAGTGCAGGTGTGTGGAGATCCCTCCTGCCTTGACATTGAGCAGCCTTAGAGGGTGGGGGAGGCTCAGGGGTCAGGTCTCTGTTCCTGCTTATTGGGGAGTTCCTGGCCTGGCCCTTCTATGTCTCCCCAGGTACCCCAGTTTTTCTGGGTTCACCCAGAGTGCAGATGCTTGAGGAGGTGGGAAGGGACTATTTGGGGGTGTCTGGCTCAGGTGCCATGCCTCACTGGGGCTGGTTGGCACCTGCATTTCCTGGGAGTGGGGCTGTCTCAGGGTAGCTGGGCACGGTGTTCCCTTGAGTGGGGGTGTAGTGGGTGTTCCTAGCTGCCACGCCTTTGCCTTCACCTATGGGATCGTGGCTGTCAGCCTTGAGGGTCAGCCTGGCCCAGGCTCCCATAGGCTTAGGAGAGGCCGCAATTCCTACCTGTTCATCCAGACAGAGGGGGACCTGGAATCAAAGTCAAGTTGGGGTAGGGGGTCCATGGGGCCATATCTGGCCTGCAGACAGCTCTGGTTAGCTATGGGCTGAGGTCTGGATTCTGCCTTGTGACTGGAGACTGGGCGCCATCCCGTGGCCTCTGAGGGCCCAGTTTGTTCGTGACCCATGCTGCAGAGGGAGATACCCAGGCTCCTGGACCTCAGGGCCTGCCTGGCACTGCAGGCCAGGTTCTCTTTTTATTTCTGAGACGGGGTCTTGTGTTGCCCAGGCTGGAGTGTAATGGCACAACCATGGCTCACTGCAGCCTCAACTTTGGGCTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGAAACTACACAGGCATGCCCCAGCACGCCCAGCTAGTTGCAGGTCAGATTCTCATTGTTCTACAGGGCCCTGAGTTAAATACTCTCGCAAGAAGA；
所述的SDK1编码的是一个免疫球蛋白超级家族的蛋白，
SDK1编码序列如chr7:4184400-4184600所示：
CCACTCCACGAAGAGGCAGCACTGATGAGACCGGAGCGCGGCTCTGTTCCCCCCGTGCGTCCTCCCTTGTTTAACTCCAGCAGTTGATTTTTTTTGGAAGCCACAGCGCCCCGTCATTTCTGGTTTTAATCAGCGCAGGAGCTCAGCCGCTGGACCACACGTTGTCTGTGAGCCAGGCAGGGTGCGGACTGGAGCTGCAGA。
3.根据权利要求2所述的生物标志物组合，其特征在于：所述核酸检测的序列分别等同于或互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:1和2的连续序列中的至少10个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的生物标志物组合，其特征在于：组合物还包括如下的引物、探针中的一种或多种组合；
PTPN18引物F
SEQ ID NO:10 TGATATTTAYGYGGTGGTGTAG
PTPN18引物R
SEQ ID NO:11 CATCTACATCCCACTCCC
PTPN18探针
SEQ ID NO:12 AGCGCGGGGTTTTAGCGG；
SEPT9引物F
SEQ ID NO:13 GTGGTTAGTTTTGTATTGTAGGAG
SEPT9引物R
SEQ ID NO:14 ACAAAACCCAAACCCTAC
SEPT9探针
SEQ ID NO:15 CGGGCGCGGCGTTTTAGT；
GALR3引物F
SEQ ID NO:22 GTATTTGGTCGTGCGGTATT
GALR3引物R
SEQ ID NO:23 ACACCAACCCCACTACGA
GALR3探针
SEQ ID NO:24 TTTGCGTACGTCGCGTAACGT；
TFR2引物F
SEQ ID NO:25 GGGGTTTTATTCGTATTATGCGT
TFR2引物R
SEQ ID NO:26 ACGACAAAAAATCTACAACTCGA
TFR2探针
SEQ ID NO:27 CGTTGTATATGCGTGTTAGTCGTTCG；
MAP6D1引物F
SEQ ID NO:28 TTTTTGAGGTCGTCGGTAGT
MAP6D1引物R
SEQ ID NO:29 AACGAAAACGCCTAAAACCC
MAP6D1探针
SEQ ID NO:30 TCGAGGTCGCGTGGGATTC；
TMEM240引物F
SEQ ID NO:31 TAAATAAGGCGCGGGAGGT
TMEM240引物R
SEQ ID NO:32 CGAAAAAACTTCCCGCGC
TMEM240探针
SEQ ID NO:33 CGCGCGGGCGGGGAGTA；
ACTB引物F
SEQ ID NO:37 TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT
ACTB引物R
SEQ ID NO:38 AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
ACTB探针
SEQ ID NO:39 ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA；
SDK1 引物F
AGGCAGTATTGATGAGA
SDK1 引物R
ACTACTAAAATTAAACAA
SDK1 探针P
GATCGGAGCGCGGTTTTT。
5.一种试剂盒，其特征在于容纳生物标志物组合。
6.根据权利要求5所述的所述的试剂盒，试剂盒还包括用于患者生物样本的容器，所述的试剂盒也包括使用和解释检测结果的说明。
7.一种体外检测肝癌的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
分离待测生物样本中的基因组DNA或血浆游离DNA；
确定所述目标基因或者基因组合靶序列的甲基化状态；
通过所述目标基因或者基因组合靶序列的甲基化状态的结果，进行生物样品状态的判断，并实现对肝癌的体外检测。
8.根据权利要求7所述的体外检测肝癌的方法，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：
提取待测生物样本的血浆游离DNA；
使用试剂处理步骤1）得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化为尿嘧啶或其他碱基以后的碱基在杂交能力上不同于5位未甲基化的胞嘧啶，并且使可以检测的；
将步骤2）处理过的DNA样品与聚合酶链式反应体系组合，聚合酶链式反应体系包含以下一种等几种组分：DNA聚合酶、所述目标靶序列的引物或者引物组合、聚合酶链式反应缓冲液，发生聚合酶链式反应后，产生扩增产物；
用被荧光标记的一种探针或几种探针的组合检测扩增产物，如果探针和扩增产物结合，则可以产生荧光信号；如果探针无法和扩增产物结合，则不能产生荧光信号；
基于是否产生荧光信号，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG的甲基化状态。
9.根据权利要求8所述的体外检测肝癌的方法，其特征在于：引物包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:1和2的连续序列中的至少10个核苷酸的片段或其互补序列。
10.根据权利要求8所述的体外检测肝癌的方法，其特征在于：所述的聚合酶链式反应体系中，DNA聚合酶，包括使用耐热DNA聚合酶、热启动的DNA聚合酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶，所述的引物和探针组合包含上述的一个或几个基因的靶序列组合。
11.根据权利要求8所述的体外检测肝癌的方法，其特征在于：所述目标基因靶序列中至少一个CpG的甲基化状态是由PCR反应的循环阈值Ct值或靶基因与参考基因的Ct值之间的差值进行确定；通过利用PCR反应分析生物样本中DNA的甲基化状态，能够方便的实现一个或多个目标基因靶序列的甲基化状态的检测，并且能够通过一个或多个目标基因靶序列的甲基化状态来判断所检测生物样本是否呈阳性。
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