JP2023513039A - 特定の遺伝子のCpGメチル化の変化を利用した膀胱癌診断用組成物およびその使用 - Google Patents
特定の遺伝子のCpGメチル化の変化を利用した膀胱癌診断用組成物およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを検出することによって、膀胱癌を診断することができる組成物、キット、核酸チップおよび方法に関することである。本発明の遺伝子のCpG部位の過メチル化は、膀胱癌において特異的に現れるため、本発明による組成物、キット、チップまたは方法を利用して膀胱癌を正確かつ迅速に診断することができるだけでなく、早期診断および再発モニタリングにも利用することができる。【選択図】図5
Description
本出願は、2020年1月28日に出願された大韓民国特許出願第10-2020-0010053号を優先権主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを検出することによって、膀胱癌を診断することができる組成物、キット、核酸チップおよび方法に関することである。
膀胱癌とは、膀胱粘膜に発生する癌であり、泌尿器科の癌の中で最も一般的な癌である。膀胱癌の最も一般的な症状は、血尿で65歳以上の高齢層で血尿の原因が膀胱癌である場合が約25%程度である。一般的に、血尿または膀胱の刺激症状が持続する場合、膀胱癌の可能性を疑って膀胱癌の診断のための検査を施行する。
膀胱癌の最も基本的な検査には、尿検査と尿細胞検査がある。尿検査は、尿内の赤血球と炎症細胞があるかどうかを検査することであり、尿細胞検査は、尿から癌細胞が離れているかどうかを検査することである。当該検査より陽性に出た場合、膀胱癌を含む泌尿器系の癌がある確率が高い。また、非侵襲的検査であり、価格も安価な長所があるが、精度が低下するという欠点がある。
膀胱鏡検査は、尿検査または尿細胞検査を通じて膀胱癌が疑われ、肉眼的に血尿が見られる場合に行われる。この検査は、局所麻酔下で内視鏡を尿道に挿入し、直接膀胱内を癌の有無の観察を通じて膀胱内の腫瘍の有無と位置、形状、個数及び大きさを確認する。しかし、当該方法は検査費用が高く、侵襲的であり、初期膀胱癌の場合、発見が難しいという欠点がある。
膀胱癌の早期発見は、癌の良い予後に係わっており、生活の質と直結する。また、膀胱癌は、再発がよくあり、周期的な追跡検査が必須であるため、従来の様々な膀胱癌診断方法の欠点を克服し、効率的な早期診断および再発モニタリングが可能な非侵襲的検査法の開発が必要な状況である。
一方、エピジェネティックス(epigenetics)は、DNAの塩基配列が変化しない状態で行われる遺伝子の発現調節を研究する分野である。エピジェネティクスは、DNAメチル化、miRNAまたはヒストンのアセチル化、メチル化、リン酸化およびユビキチン化などのエピジェネティックな変異による遺伝子発現の調節を研究する。
二重DNAメチル化が最も多く研究されているエピジェネティック的変異である。エピジェネティック的変異は、遺伝子機能の変異および腫瘍細胞への変化をもたらし得る。よって、DNAメチル化は細胞内疾患調節遺伝子の発現(または抑制および誘導に)に関連しており、最近、DNAメチル化測定による癌診断方法らが提示されている。特に、前癌段階の組織でも癌特異的メチル化現象があらかじめ発生することもあるため、癌特異的メチル化の検出は癌の診断に利用される可能性が高い。
よって、膀胱癌のリスク予測が可能な効果的な膀胱癌特異的メチル化マーカーの開発が必要である。
ここで、本発明者らは膀胱癌における特定の遺伝子CpG部位が過メチル化された状態であることを発見し、前記メチル化レベルを検出することにより膀胱癌を診断することができる組成物、キット、核酸チップ及び方法を開発して本発明を完成した。
よって、本発明の目的は、特定の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤を含む膀胱癌診断用組成物を提供することである。
また、本発明の目的は、特定の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤からなる膀胱癌診断用組成物を提供することである。
また、本発明の目的は、特定の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤から必修的になる膀胱癌診断用組成物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、特定の遺伝子のCpG部位を含む断片を増幅するためのPCRプライマー対と、前記プライマー対によって増幅されたPCR産物をパイロシーケンシングするためのシーケンシングプライマーとを含有する膀胱癌診断用キットを提供することである。
また、本発明のさらに他の目的は、特定の遺伝子のCpG部位を含む断片と、厳密な条件下でハイブリダイゼーションができるプローブとが固定されている膀胱癌診断用核酸チップを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、それぞれ異なる試料から特定の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定し比較することを含む膀胱癌診断のための情報を提供する方法を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的は、膀胱癌の再発または進行の診断に必要な情報を提供するために、個体から分離した生物学的試料における特定の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する方法を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的は、膀胱癌診断用製剤を製造するためのIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤の使用を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的は、
a)個体から試料を収得する段階;
b)前記試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;及び、
c)前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む膀胱癌診断方法を提供することである。
a)個体から試料を収得する段階;
b)前記試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;及び、
c)前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む膀胱癌診断方法を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤を含む膀胱癌診断用組成物を提供する。
また、本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤からなる膀胱癌診断用組成物を提供する。
また、本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤から必修的になる膀胱癌診断用組成物を提供する。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3、およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位を含む断片を増幅するためのプライマー対を含む膀胱癌診断用キットを提供する。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位を含む断片とハイブリダイゼーションをすることができるプローブが固定されていた膀胱癌診断用核酸チップを提供する。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、膀胱癌の発生が疑われる患者の試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3、およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;
前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む、膀胱癌診断のための情報を提供する方法を提供する。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、膀胱癌の再発または進行の診断に必要な情報を提供するために、個体から分離した生物学的試料において、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する方法を提供する。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、膀胱癌診断用製剤を製造するためのIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3、およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤の使用を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、
a)個体から試料を収得する段階;
b)前記試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;及び、
c)前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む膀胱癌診断方法を提供することである。
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、
a)個体から試料を収得する段階;
b)前記試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;及び、
c)前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む膀胱癌診断方法を提供することである。
他の定義がない限り、本明細書で使われたすべての技術的および科学的用語は、当業者によって通常に理解できる同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明の明細書で使われた複数の用語らの一般的な定義を有する技術(skill)の1つを提供する:Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2th ed. 1994);THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered.、1988);及び、Hale&Mar
ham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY。
ham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3及びBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤を含む膀胱癌診断用組成物を提供する。
本発明において、用語「メチル化」とは、DNAを構成する塩基にメチル基が付着されることを示す。好ましくは、本発明におけるメチル化の有無は、特定の遺伝子の特定のCpG部位のサイトシンで起こるメチル化の有無を意味する。メチル化が起こった場合、それによって転写因子の結合が妨げられ、特定の遺伝子の発現が抑制され、逆に、非メチル化または低メチル化が起こった場合、特定の遺伝子の発現が増加するようになる。
哺乳動物細胞のゲノムDNAには、A、C、GおよびTに加えて、サイトシンリングの5番目の炭素にメチル基が付着された5-メチルサイトシン(5-methylcytosine, 5-mC)という5番目の塩基が存在する。5-メチルサイトシンのメチル化はCpGと呼ばれるCGジヌクレオチド(5'-mCG-3')のCでのみ起こり、CpGのメチル化はaluまたはトランスポゾンとゲノムの反復配列の発現を抑制する。また、前記CpGの5-mCが自然に脱アミノ化してチミン(T)になりやすいため、CpGは哺乳動物細胞においてほとんどの後生遺伝学的変化が頻繁に起こる部位である。
本発明における用語「メチル化レベルの測定」とは、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定することであり、バイサルファイト処理による検出法またはバイサルファイト非依存検出法によって測定することができる。メチル化レベルの測定は、メチル化特異的PCR、例えばメチル化特異的PCR(methylation-specific polymerase chain reaction、MSP)、リアルタイムメチル化特異的PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction)、メチル化DNA特異的結合タンパク質を用いたPCR、または定量PCRなどを介して測定することができる。または、パイロシーケンシングおよびバイサルファイトシーケンシングのような自動塩基分析によって測定することができるが、これに限定されない。また、バイサルファイト非依存的検出法としてTETタンパク質(ten-eleven translocation protein)を用いた検出法を用いて測定することができる(Nature Biotechnology, volume 37, pages 424-429 (2019)参照)。前記TETタンパク質はDNAに作用する酵素で塩基の化学的変化に関与し、バイサルファイトを処理する場合、メチル化されたCを除く全てのCがT塩基に変わることとは異なり、Tetタンパク質はメチル化されたCのみがTに変わるため、より効率的な検出が可能である。
好ましくは、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3及びBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位とは、前記遺伝子のDNA上に存在するCpG部位を示す。前記遺伝子のDNAは、前記遺伝子が発現するのに必要であり、お互いの作動が可能に連結されている一連の構成単位を全て含む概念であり、例えば、プロモーター領域、タンパク質コード領域(open reading frame、ORF)及びターミネーター領域を含む。よって、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位は、当該遺伝子のプロモーター領域、タンパク質コード領域(ORF)またはターミネーター領域などに存在してもよい。
好ましくは、本発明におけるIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3、およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定することは、以下の表1に記載の遺伝子のCpG部位のサイトシンのメチル化レベルを測定することも意味する。
本発明において、前記IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位は、遺伝子の転写開始部位(transcription start site、TSS)から+/-3000塩基(base))(3kb)の間に位置することを特徴とする。
本発明において、ヒトゲノム染色体部位の塩基配列は、The February 2009 Human reference sequence(GRCh37)に従って表現したが、前記ヒトゲノム染色体部位の具体的配列は、ゲノム配列の研究結果が更新されるにつれてその表現が多少変更されてもよく、このような変更によって、本発明の前記ヒトゲノム染色体部位の表現が現在と異なってもよい。よって、本発明のThe February 2009 Human reference sequence(GRCh 37)に従って発現されたヒトゲノム染色体部位は、本発明の出願日以降、ヒト標準塩基配列(human reference sequence)が更新され、前記ヒトゲノム染色体部位の表現が現在と違うように変更されたとしても、本発明の範囲が前記変更されたヒトゲノム染色体部位に及ぶことは明らかであると判断する。このような変更内容は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者であれば誰でも容易に知ることができる事項である。
本発明において、前記CpG部位のメチル化レベルを測定する製剤は、サイトシン塩基を変形する化合物またはメチル化感受性制限酵素、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のメチル化された対立形質配列に特異的なプライマー、および非メチル化された対立形質配列に特異的なプライマーを含んでもよい。
前記サイトシン塩基を変形させる化合物は、非メチル化サイトシンまたはメチル化サイトシンを変形する化合物であり、非メチル化サイトシンを変形させるバイサルファイトまたはその塩、好ましくは亜硫酸ナトリウムであるか、またはメチル化サイトシンを変形させるTETタンパク質であってもよいが、これに限定されない。このようなシトシン塩基を変形させてCpG部位のメチルの有無を検出する方法は、当該業界に公知となっている(WO01/26536;US2003/0148326A1)。
また、前記メチル化感受性制限酵素は、CpG部位のメチル化を特異的に検出できる制限酵素として、制限酵素の認識部位としてCGを含有する制限酵素であってもよい。例えば、SmaI、SacII、EagI、HpaII、MspI、BssHII、BstUI、NotIなどがあり、これらに限定されない。前記制限酵素認識部位のCでのメチル化または非メチル化によって制限酵素による切断の有無が変わり、これをPCRまたはサザンブロット分析により検出することができるようになる。前記制限酵素以外の他のメチル化感受性制限酵素は当該業界に公知となっている。
前記プライマーは、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3、およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のメチル化された対立形質配列に特異的なプライマーおよび非メチル化された対立形質配列に特異的なプライマーを含んでもよい。
本発明において、用語「プライマー」とは、短い遊離3-末端水酸化基を有する核酸配列で相補的なテンプレートと塩基対を形成することができ、テンプレート鎖コピーのための開始点として機能をする短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液および温度での重合反応(すなわち、DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素)のための試薬および異なる4つのヌクレオシド・トリホスフェートの存在下でDNA合成を開始することができる。また、プライマーは、7~50個のヌクレオチド配列を有するセンスおよびアンチセンス核酸であり、DNA合成の開始点として作用するプライマーの基本性質を変化させないさらなる特徴を組み込んでもよい。
本発明のプライマーは、メチル化の有無を分析する対象となる特定のCpG部位の配列に応じて好ましく設計することができ、より好ましくは、メチル化され、バイサルファイトによって変形されなかったサイトシンを特異的に増幅することができるプライマー対、非メチル化によるバイサルファイトによって変形されたサイトシンを特異的に増幅することができるプライマー対、メチル化されてTet系列のタンパク質によって変形されたサイトシンを特異的に増幅することができるプライマー対および非メチル化によるTet系列のタンパク質によって変形されなかったサイトシンを特異的に増幅することができるプライマー対からなる群から選択されたいずれか1つ以上のことでもよい。
よって、本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3、およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位を含む断片を増幅するためのプライマー対を含む膀胱癌診断用キットを提供する。
前記組成物およびキットには、前記製剤の他にも、重合酵素アガロース、電気泳動に必要な緩衝溶液などをさらに含んでもよい。
また、本発明は、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3、およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位を含む断片とハイブリダイゼーションすることができるプローブが固定されている膀胱癌診断用核酸チップを提供する。
本発明において、用語「核酸」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドを意味するか、またはそれらの断片、一本鎖または二本鎖のゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNA、センスまたはアンチセンス鎖のゲノム起源または合成起源のDNAあるいは、RNA、PNA(peptide nucleic acid)、または天然起源または合成起源のDNA量またはRNA量の物質を指す。核酸がRNAである場合、デオキシヌクレオチドA、G、CおよびTの代わりに、それぞれリボヌクレオチドA、G、CおよびUに置き換えられることは、当該分野の通常の知識を有する者に明らかなことである。
メチル化は、遺伝子の調節部位の外郭から始めて内部に進行するため、調節部位の外郭でメチル化を検出することにより、細胞の形質転換に関与する遺伝子を早期診断および治療後の進行または再発モニタリングを行うことができる。
よって、前記メチル化遺伝子マーカーを用いて膀胱癌を形成する可能性がある細胞の早期診断が可能である。癌細胞でメチル化されると確認できた遺伝子が臨床的または形態学的に正常に見える細胞でメチル化されると、前記正常に見える細胞は癌化が進行しているものである。従って、正常に見える細胞における膀胱癌特異的遺伝子がメチル化を確認することにより、膀胱癌を早期診断および治療後に進行または再発モニタリングを行うことができる。
また、本発明は、膀胱癌の発生が疑われる患者の試料から、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;及び、
前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む、膀胱癌診断のための情報を提供する方法を提供する。
前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む、膀胱癌診断のための情報を提供する方法を提供する。
前記メチル化レベルを測定する方法は、PCR、メチル化特異PCR(methylation specific PCR)、リアルタイムメチル化特異PCR(real time methylation specific PCR)、メチル化DNA特異的結合タンパク質を用いたPCR、メチル化感受性制限酵素を使ったメチル化の有無の測定、定量的PCR、DNAチップ、パイロシーケンシングおよびバイサルファイトシーケンシングからなる群から選択してもよいが、これに限定されない。
具体的には、メチル化特異PCR法は、試料DNAに重亜硫酸塩を処理した後にPCRを遂行するプライマーをCpGジヌクレオチドのメチル化の有無に応じて異なる種類のプライマーを設計して使用する方法である。プライマーの結合部位がメチル化された場合は、メチル化されたプライマーによってPCRが進行し、メチル化されなかった場合は、正常プライマーによってPCRが進行する。つまり、試料DNAに重亜硫酸塩を処理した後、2種類のプライマーを同時に使ってPCRを行った後、結果を比較する方法である。
リアルタイムメチル化特異PCRは、メチル化特異PCR法をリアルタイム測定方法に転換したものであり、ゲノムDNAに重亜硫酸塩を処理した後、メチル化された場合に該当するPCRプライマーを設計し、これらのプライマーを用いてリアルタイムPCRを行うことである。この場合、増幅された塩基配列と相補的なTanManプローブを用いて検出する方法と、Sybergreenを用いて検出する2つの方法がある。よって、リアルタイムメチル化特異的PCRは、メチル化されたDNAのみを選択的に定量分析することができる。この場合、体外メチル化DNA(in vitro methylated DNA)サンプルを用いて標準曲線を作成し、標準化のために塩基配列内に5'-CpG-3'配列がない遺伝子を陰性対照群にて一緒に増幅してメチル化度を定量分析する方法である。
メチル化感受性制限酵素を用いてメチル化の有無を測定する方法において、メチル化感受性制限酵素は、CpGジヌクレオチドを作用部位とし、この部位がメチル化された場合は酵素としての作用ができない。よって、試料DNAをメチル化感受性制限酵素で処理した後、酵素標的部位を含むようにPCRで増幅すると、メチル化された場合は制限酵素が作用せずPCRが増幅されるが、メチル化されていない正常部位は制限酵素によって切断されてPCRが増幅されないため、特定のDNA部位のメチル化の有無を測定することができる。
メチル化DNA特異的結合タンパク質を用いたPCRまたはDNAチップ法は、メチル化DNAのみに特異的に結合するタンパク質をDNAと混合すると、メチル化DNAにのみ特異的にタンパク質が結合するため、メチル化DNAのみを選択的に分離することができる。ゲノムDNAをメチル化DNA特異的結合タンパク質と混合した後、メチル化されたDNAのみを選択的に単離する。これらの分離されたDNAをイントロン部位に該当するPCRプライマーを用いて増幅した後、アガロース電気泳動でメチル化の有無を測定する方法である。また、定量PCR法でもメチル化の有無を測定することができ、メチル化DNA特異的結合タンパク質で分離したメチル化DNAは、蛍光色素で標示し、相補的なプローブが集積されたDNAチップにハイブリダイゼーションすることによりメチル化の有無を測定することができる。ここで、メチル化DNA特異的結合タンパク質はMBD2btに限定されない。
また、重亜硫酸塩で処理されたDNAのパイロシーケンシング(bisulfite pyrosequencing)は、以下の原理に基づく。CpGジヌクレオチド部位でメチル化が起こると、5-メチルシトシン(5-mC)が形成され、この変形された塩基は重亜硫酸塩の処理した時にウラシルに変化する。試料から抽出されたDNAに重亜硫酸塩を処理する際にCpGジヌクレオチドがメチル化された場合、シトシン(cytosine)で保存され、残りのメチル化されていないシトシンはウラシルに変化する。重亜硫酸塩で処理されたDNAの配列分析は、好ましくはパイロシーケンシング法を使って行うことができる。パイロシーケンシングにつく詳細な説明は当該業界に公知となっている。
一方、Tetタンパク質を用いたバイサルファイト非依存的検出法として、Tetタンパク質を用いてメチル化されたCのみがTに変換させてメチル化部位の塩基を検出することもできる(LIU, Yibin, et al., Nature Biotechnology volume 37, pages 424 -429(2019)を参照).
CpGジヌクレオチド部位でメチル化が発生し、シトシンが5-メチルシトシン(5-mC)が形成された場合、Tet(ten-eleven translocation)タンパク質を処理した際にCpGジヌクレオチドがメチル化された場合にウラシルに変化し、メチル化されていないシトシンは保存される。Tet処理されたDNAの配列分析は、パイロシーケンシング法のみに対して限定されるものではなく、メチル化感受性PCR(methylation-sensitive PCR,MSP)、マイクロアレイ(microarray)、次世代シーケンシング(next generation sequencing,NGS)などの方法を使って分析することができる。
好ましくは、本発明の膀胱癌の診断のための情報を提供する方法は、a)個体から試料を収得する段階、b)試料からゲノムDNAを収得する段階、c)収得したゲノムDNAを非メチル化されなかったシトシン塩基を変形させる化合物を処理する段階、d)前記処理されたDNAをIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3及びBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のプロモーターを増幅することができるパイロシーケンシング用プライマーを利用してPCRにより増幅することにより、PCR産物を得る段階、及びe)前記PCR産物をシーケンシングプライマーを用いてパイロシーケンシングすることによりメチル化度を測定する段階を含むことを特徴とする方法によって遂行してもよい。
前記b)段階のゲノムDNAの収得は、当該業界で通常に用いられるフェノール/クロロホルム抽出法、SDS抽出法、CTAB分離法、または商業的に販売されているDNA抽出キットを用いて行うことができる。
本発明において、用語「試料」とは、遂行する分析の種類に応じて、個々人、体液、細胞株、組織培養などから得られる全ての生物学的体液を含む幅広い範囲の体液を意味するものである。哺乳動物から体液および組織の生検を獲得する方法は通常的に広く知られており、本発明において、前記試料は、好ましくは組織、細胞、血液、血漿、血清、糞便および尿を含む人体由来物からなる群から選択してもよい。癌組織の異常なメチレーションの変化は、細胞、全血、血清、血漿、唾液、喀痰、脳脊髄液または尿などの生物学的試料から得たゲノムDNAのメチレーション変化と相当な類似性を示すので、本発明のマーカーを用いる場合、膀胱癌の発生予測に対して、血液や体液などによる簡単な診断が可能であるという利点がある。
一方、本発明は、膀胱癌の再発または進行の診断に必要な情報を提供するために、個体から分離した生物学的試料におけるIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する方法を提供する。
本方法における「個体」とは、動物、好ましくは哺乳動物、特に、ヒトを含む動物でもよく、動物に由来の細胞、組織、器官などでもよい。前記個体は、前記効果を必要とする患者でもよく、好ましくは膀胱癌と疑われる患者、膀胱癌と診断された患者、または膀胱癌治療を受けた患者でもよい。
また、「試料」は、前記記載の通りであるが、好ましくは再発または進行の診断のための試料は、個体または患者から収得した尿でもよい。
本発明における膀胱癌の再発または進行の診断は、膀胱癌の予後を含んでもよく、「予後」とは、膀胱癌の治療中または治療後の病の進行経過を意味することであり、好ましくは、治療後の病の進行経過を意味してもよく、総生存率(overall survival)、無病生存率または無原発性転移生存率(distant metastasis free survival)を含むが、これらに限定されない。また、前記膀胱癌の進行とは、膀胱癌の完治、再発、転移または転移性再発を含む概念であり、より好ましくは転移性再発を意味するが、これに限定されない。
本発明は、膀胱癌診断用製剤を製造するためのIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤の使用を提供する。
本発明は
a)個体から試料を収得する段階;
b)前記試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;及び、
c)前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む、膀胱癌診断方法を提供する。
a)個体から試料を収得する段階;
b)前記試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;及び、
c)前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む、膀胱癌診断方法を提供する。
一実施態様において、本発明は、下記段階を含む個体の膀胱癌を診断および治療する方法を提供する。
i)個体から試料を収得する段階;
ii)前記試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3、およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;
iii)前記測定されたメチル化レベルを正常対照サンプルの前記同じ遺伝子のCpG部
位のメチル化レベルと比較する段階;及び、
iv)前記判断された個体に膀胱癌を治療するための治療薬を投与するか、または手術を通じて神経変性疾患を治療する段階。
i)個体から試料を収得する段階;
ii)前記試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3、およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;
iii)前記測定されたメチル化レベルを正常対照サンプルの前記同じ遺伝子のCpG部
位のメチル化レベルと比較する段階;及び、
iv)前記判断された個体に膀胱癌を治療するための治療薬を投与するか、または手術を通じて神経変性疾患を治療する段階。
前記i)~iv)段階を含む方法らは、前述のa)~c)段階を含む方法に基づいて理解できる。
前記iv)段階は、前記iii)段階で疾患が診断された個体に治療薬の投与や手術などの手段によって前記疾患の治療を行う段階である。
本発明の前記「治療」とは、膀胱癌または前記疾患の症状を改善することを包括的に指し、これは、疾患の治癒、実質的予防、または状態の改善をすることを含んでもよく、膀胱癌をはじめとする1つの症状またはほとんどの症状を緩和、治癒または予防することを含むが、これに限定することではない。
前記「治療薬」とは、通常的に膀胱癌の治療に対して使用される薬物の種類であれば、その種類は特に限定しない。また、前記治療薬は、「治療学的に有効な量」で個体に投与され、前記治療学的に有効な量は、当業者が薬物の固有の性質、投与経路および治療の回数のみならず、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率などの多様な要因らを考慮して患者の有効投与量を決定することができる。前記治療薬の投与経路は、特に限定されず、経口的または非経口的に投与されるものであってもよく、局所的投与のみならず、全身的経路の投与を全部含む。前記非経口的投与は、これに限定されないが、一例として鼻腔内薬物塗布、皮下注射等であってもよく、さらに他の一例として筋肉内注射、静脈注射等の方法を使うものであってもよい。
本発明の前記「試料」とは、疾患が疑われる個体から分離し収得するものであり、これに限定されないが、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、喀痰、粘膜液および尿からなる群から選択することができ、「個体」とは、動物、好ましくは哺乳動物、特に、ヒトを含む動物でもよく、動物に由来の細胞、組織、器官などでもよい。前記個体は前記治療効果を必要とする患者でもよい。
本明細書において、用語「~を含む(comprising)」とは、「含有する(including)」または「~を特徴とする(characterized by)」と同じ意味で使われ、本発明による組成物または方法において、具体的に言及されていない追加の構成成分または方法の段階などを排除しない。また、用語「~からなる(consisting of)」とは、別途の記載がいない追加の要素、段階、または成分などを除外することを意味する。用語「~から必須的になる(essentially consisting of)」とは、組成物または方法の範囲において、記載された物質または段階の他にも、その基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない物質または段階などを含み得ることを意味する。
前述のように、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3及びBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位の過メチル化は膀胱癌に特異的に現れるので、本発明による組成物、キット、チップ又は方法を用いて、膀胱癌を正確かつ迅速に診断することができ、さらに早期診断および治療の以後の再発モニタリングを可能にする。
以下、本発明の理解を補うために好ましい実施例を提示する。しかし、以下の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、これによって本発明の内容が限定されるものではない。
実施例1:膀胱癌特異的メチル化遺伝子の選別
膀胱癌で特異的に発見されるメチル化遺伝子を選別するために、大規模メチレーション・マイクロアレイチップ(methylation microarray chip)データを用いて膀胱癌患者の癌手術から得た癌組織と正常組織の大規模メチル化の比較研究を行った。当該研究において使われた腫瘍組織とは、膀胱癌の癌組織を意味し、非腫瘍組織とは、正常組織を含む癌組織以外の組織を意味する。分析に使われる膀胱癌腫瘍組織の数は412個であり、非腫瘍組織の数は21個である。
膀胱癌で特異的に発見されるメチル化遺伝子を選別するために、大規模メチレーション・マイクロアレイチップ(methylation microarray chip)データを用いて膀胱癌患者の癌手術から得た癌組織と正常組織の大規模メチル化の比較研究を行った。当該研究において使われた腫瘍組織とは、膀胱癌の癌組織を意味し、非腫瘍組織とは、正常組織を含む癌組織以外の組織を意味する。分析に使われる膀胱癌腫瘍組織の数は412個であり、非腫瘍組織の数は21個である。
膀胱癌特異的メチル化遺伝子の選別のために、各組織からDNAを抽出し、Infinium Human Methylation 450 Beadchip microarrayを用いて遺伝子部位のメチル化度を確認した。
各組織から抽出されたDNAは、バイサルファイト処理により変換され、これによってDNA部位のメチル化の有無に応じてサイトシン塩基を変形した。当該マイクロアレイ実験に使われるプローブは、遺伝子のメチル化部位のサイトシン塩基の変形の有無を確認するために、メチル化、非メチル化特異的に設計された。
当該マイクロアレイ実験は、それぞれ遺伝子のメチル化部位を示す約45万個(450k)のプローブを通じて遺伝子のメチル化度を測定し、試験を通じて導出された各プローブの結果はβ値にて示した。β値は0から1までの値を有し、1に近いほど該当する遺伝部位のメチル化度が高いと判断した。
腫瘍群と非腫瘍群との間の差別的なメチル化部位(differentially methylated regions、DMRs)を確認するために、経験的ベイズt-test(empirical Bayes t-test)であるLimma(Linear Models for Microarray Data)法を使って、群間の統計的に有意なメチル化の差異を示す遺伝子部位を確認した。
Limma法は、群間の差異を確認する複数のメチル化の統計分析法の中で最も外れ値(outlier)に少ない影響を受けることが知られている。よって、一部のサンプルの非正常的測定値により少ない影響を受けるため、癌特異的マーカーを見つけるのに適した方法である。本実験では、Limma法により導出された補正p値(adjusted p-value)値が少ないほど、2つの群の間に有意なメチル化に差異があると判断した。
特に、腫瘍特異的メチル化部位を探索するために、腫瘍群と非腫瘍群の間に有意なβ値の差がある遺伝子部位のうち、非腫瘍より腫瘍組織でより高いメチル化部位を癌特異的バイ
オマーカー候補に選定した。
オマーカー候補に選定した。
その結果、データセット(dataset)でのlimma分析の結果、非腫瘍群に比べて腫瘍群間の比較時に45万個のプローブのうち1万番目以内の低いp値を有し、群間のβ値が0.3以上の大きな差を遺伝子部位を腫瘍特異的過メチル化部位(hypermethyalted regions)として選別した。これにより、約45万個の遺伝部位のうち、データセットで腫瘍特異的過メチル化を示す352個の遺伝部位をバイオマーカー候補として選別した。
これらの遺伝部位のうち偽遺伝子ではなく、当該部位がCpG島部位に存在し、遺伝子の転写開始部位(transcription start site,TSS)から+/-3000塩基(3kb)の間に選別された遺伝部位にあり、常染色体(autosome)に存在する場合、膀胱癌特異的過メチル化遺伝子として選別した。その結果、下記表2に示すように、総6個の遺伝子が選別された(図1を参照)。
実施例2:細胞株における膀胱癌診断遺伝子の膀胱癌特異性の確認
選別された6つの遺伝子の高いメチル化が膀胱癌細胞に起因するかを確認するために、公共データベースを活用し、大幅に膀胱癌に由来の20個の癌細胞株(cancer cell lines)におけるメチル化パターンを分析した。当該データは、各細胞株から抽出したDNAを標準化した製造業者のメチル化分析試験過程に従ってInfinium Human Methylation 450 B
eadchip microarray実験を行った。
選別された6つの遺伝子の高いメチル化が膀胱癌細胞に起因するかを確認するために、公共データベースを活用し、大幅に膀胱癌に由来の20個の癌細胞株(cancer cell lines)におけるメチル化パターンを分析した。当該データは、各細胞株から抽出したDNAを標準化した製造業者のメチル化分析試験過程に従ってInfinium Human Methylation 450 B
eadchip microarray実験を行った。
遂行された実験の結果値は、前記実施例1と同様に、約45万個のプローブを介して遺伝子のメチル化度を測定し、各プローブのメチル化値はβ値として提示される。β値は0から1までの値を有し、1に近いほど該当遺伝部位のメチル化度が高いと判断する。
前記20個の膀胱癌細胞株は以下の通りである:5637(comic ID:687452)、639-V(comic ID:906798)、647-V(comic ID:906797)、BFTC-905(comic ID:910926)、CAL-29(comic ID:1290730)、DSH1(comic ID:753552)、HT-1197(comic ID:907065)、HT-1376(comic ID:907066)、J82(comic ID:753566)、KU-19-19 (comic ID:907312)、LB831-BLC(comic ID:753584)、RT-112(comic ID:909704)、RT4(comic ID:687455)、SCABER(comic ID:1299051)、SW1710 (comic ID: 909749)、SW780(comic ID:687457)、T-24(comic ID:724812)、TCCSUP(comic ID:687459)、UM-UC-3(comic ID:724838)、VM-CUB-1(comic ID:909780)
選別された6つの遺伝子の膀胱癌細胞株でメチル化レベルを確認した結果、各遺伝子のメチル化の中央値は0.93以上であり、腫瘍組織における選別された遺伝子の高いメチル化レベルのように高いレベルのメチル化値を示した(図2を参照)。よって、選択された遺伝子は膀胱癌において特異的にメチル化を有することが確認できた。
実施例3:末梢血単核細胞における膀胱癌診断遺伝子の低メチル化レベルの確認
末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)は球状核を有する末梢血液細胞である。そのような末梢血単核細胞は、T細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞(NK cell、natural killer cell)などの免疫関連細胞を含む。
末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)は球状核を有する末梢血液細胞である。そのような末梢血単核細胞は、T細胞、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞(NK cell、natural killer cell)などの免疫関連細胞を含む。
選別された6つの遺伝子のメチル化レベルを確認するためには、癌試料の収得段階が要求される。この試料は、遂行される分析の種類に応じて、個々人、体液、細胞株、組織培養などから得られる全ての癌に関連する生物学的体液を含む幅広い範囲の体液を意味する。試料の収得過程において、末梢血単核細胞の汚染は、最も頻繁に発生し得るメチル化の測定を阻害する要因であり、末梢血単核細胞内の測定しようとする遺伝子のメチル化により癌試料の遺伝子メチル化レベルが影響を受ける。
選別された6つの遺伝子が末梢血単核細胞の汚染から影響を受けるかを確認するために、総110人から末梢血単核細胞のメチル化パターンを分析した。当該データは、末梢血単核細胞から抽出したDNAを実施例1および2と同様に標準化された製造業者のメチル化分析試験過程に従い、Infinium Human Methylation 450 Beadchip microarray実験を行った。遂行した実験の結果値は、約45万個のプローブを介して遺伝子のメチル化度を測定し、各プローブのメチル化値はβ値にて提示される。β値は、0から1までの値を有し、1に近いほど該当する遺伝部位のメチル化度合いが高いと判断する。
選別された6つの遺伝子の末梢血単核細胞でメチル化レベルを確認した結果、各遺伝子のメチル化の中央値は0.10未満であり、腫瘍組織における選別された遺伝子の高いメチル化レベルとは異なり、低いレベルのメチル化値を示した(図3を参照)。よって、選別された遺伝子は膀胱癌において特異的にメチル化を有することが確認できた。
また、末梢血単核細胞を構成する細胞群別に分けてメチル化分析を行い、特定の細胞群が試料内のメチル化レベル測定に影響を及ぼすかについて分析を行った。総6名の正常人の血液試料から全血(whole blood)、末梢血単核細胞(PBMC)だけでなく、末梢血単核細胞を構成する顆粒球(granulocyte)、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD56+NK細胞、C
D19+B細胞、CD14+、単核球(monocyte)、好中球(neutrophil)、好酸球(eosinophilia)に細胞群を分類し、DNAメチル化レベルを分析した。メチル化レベルは、実施例1および2と同様に、Infinium Human Methylation 450 Beadchip microarray実験によって測定した。
D19+B細胞、CD14+、単核球(monocyte)、好中球(neutrophil)、好酸球(eosinophilia)に細胞群を分類し、DNAメチル化レベルを分析した。メチル化レベルは、実施例1および2と同様に、Infinium Human Methylation 450 Beadchip microarray実験によって測定した。
選別された6つの遺伝子の末梢血単核細胞を細かく細胞群別にレベルを確認した結果、各遺伝子のメチル化の中央値は最大0.16未満に選別された遺伝子は末梢血単核細胞それぞれにおいても低レベルのメチル化値を示した(図4を参照)。
この結果は、選別された遺伝子が末梢血単核細胞において低いメチル化レベルを示し、試料からの当該遺伝子のメチル化の測定に対する末梢血単核細胞の汚染から受ける影響が非常に制限的であることを意味する。
実施例4:膀胱癌診断遺伝子の診断性能の評価
選別された遺伝子の膀胱癌における診断マーカーとしての有用性を確認するために、メチル化度による膀胱癌診断の精度を評価した。
選別された遺伝子の膀胱癌における診断マーカーとしての有用性を確認するために、メチル化度による膀胱癌診断の精度を評価した。
診断の精度を評価するためには感度と特異度を使用する。連続する診断検査の測定値の可能な切断値(cut-off value)に対する感度と特異度の値の計算により、切断値に応じた感度と特異度の変化を示すROC(Receiver Operating Characteristic)曲線を表すことができる。診断の精度は、ROC曲線の下の面積(area under the ROC curve、AUC)によって測定することができる。AUC値は0.5から1の間の値を有し、その値が大きいほど診断の精度が高いと評価する。AUC値が1である場合、診断結果は完全に正確な検査であることを意味するが、0.5の場合はランダムな結果と同じであると判断する。
選別された遺伝子を用いた非腫瘍組織と腫瘍組織との間のメチル化の度合いによる癌分類精度を収集したメチレーション・データセットを用いて分析した結果、図5のように、全ての選択された遺伝子が0.906以上のAUC値を有し、高い診断精度を示し、選別された遺伝子が膀胱癌の診断に有用であることを確認した(図5参照)。
以上のように、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位の過メチル化は膀胱癌において特異的に現れるため、本発明による組成物、キット、チップまたは方法を利用し、膀胱癌を正確かつ迅速な診断ができるのみならず、早期診断及び再発モニタリングにも利用することができる。
Claims (14)
- IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤を含む膀胱癌診断用組成物。
- 前記CpG部位が遺伝子の転写開始部位から+/-3000塩基(3kb)の間に位置することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定するための製剤は、
非メチル化サイトシンまたはメチル化サイトシン塩基を変形させる化合物;
IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子CpG部位のメチル化された配列に特異的なプライマー;及び、
非メチル化された配列に特異的なプライマーを含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。 - 前記非メチル化サイトシン塩基を変形させる化合物がバイサルファイトまたはその塩であり、前記メチル化サイトシン塩基を変形させる化合物がTetタンパク質であることを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
- IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位を含む断片を増幅するためのプライマー対を含む膀胱癌診断用キット。
- IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位を含む断片とハイブリダイゼーションすることができるプローブが固定されている膀胱癌診断用核酸チップ。
- 膀胱癌の発生が疑われる患者の試料から、IFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;及び、
前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む、膀胱癌診断のための情報を提供する方法。 - 前記メチル化レベルを測定する方法が、バイサルファイト非依存性(bisulfite-free)検出法、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応(methylation-specific polymerase chain reaction)、リアルタイムメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応(real time methylation-specific polymerase chain reaction)、メチル化DNA特異的結合タンパク質を用いたPCR、定量PCR、パイロシーケンシングおよびバイサルファイトシーケンシングからなる群から選択された方法である、請求項7に記載の方法。
- 前記試料が、組織、細胞、血液、血漿、血清、糞便および尿からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 膀胱癌の再発または進行の診断に必要な情報を提供するために、個体から分離した生物学的試料におけるIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル
化レベルを測定する方法。 - 前記個体が膀胱癌と診断された患者または膀胱癌治療を受けた患者であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記生物学的試料が尿であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 膀胱癌診断用製剤を製造するためのIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する製剤の使用。
- a)個体から試料を収得する段階;
b)前記試料からIFFO1、MARCH11、BARHL2、NR2E1、KCNA3およびBOLLからなる群から選択されたいずれか1つ以上の遺伝子のCpG部位のメチル化レベルを測定する段階;
c)前記測定されたメチル化レベルを正常対照群試料の前記同じ遺伝子のCpG部位のメチル化レベルと比較する段階;を含む、膀胱癌の診断方法。
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