CN117248018A - 一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒。本发明提供的试剂盒通过检测样本中多核苷酸分子的甲基化水平能够对子宫内膜癌进行早期检测，提供了能够用于子宫内膜癌(Ⅰ期和Ⅱ期)早期检测的生物标志物。该试剂盒对子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本具有优异的检测效果，对Ⅰ期、Ⅱ期子宫内膜癌均具有较高的检测灵敏性和特异性，能够有效区分早期子宫内膜癌患者和健康人。

Description

一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒。
背景技术
子宫内膜癌在发达国家是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，在中国居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位，据2015年国家癌症中心统计，中国发病率为63.4/10万，死亡率21.8/10万。导致子宫内膜癌的相关危险因素包括高水平的雌激素(可能由肥胖、糖尿病、高脂肪饮食引起)，初潮早，未育，绝经延迟，林奇综合征(Lynch Syndrome)，高龄(55岁以上)以及应用激素替代和他莫昔芬等。近年子宫内膜癌发病率呈现上升趋势。约有70％的子宫内膜样癌患者，发现时局限于子宫体。子宫内膜癌大部分是局限性病变，生存率相对较高，但常忽略早期不规则阴道流血和阴道排液等症状，失去早期诊断的机会。
目前，尚缺乏有效的子宫内膜癌筛查手段，因此寻找新的生物学靶点，开发兼具高灵敏性和高特异性的生物标志物用于子宫内膜癌早期诊断是十分有必要的。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒，以改善现有技术对子宫内膜癌的诊断手段不足、缺少能够用于子宫内膜癌(Ⅰ期和Ⅱ期)早期检测的生物标志物等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种检测多核苷酸分子甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌检测产品中的应用，所述多核苷酸分子选自(a)-(c)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)或(b)具有90％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)或(b)保持一致。
优选地，所述多核苷酸分子选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
优选地，所述子宫内膜癌包括Ⅰ期子宫内膜癌和Ⅱ期子宫内膜癌中的至少一种；所述子宫内膜癌检测产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
本发明还提供了一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测多核苷酸分子的甲基化水平的引物对，所述多核苷酸分子选自(a)-(c)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)或(b)具有90％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)或(b)保持一致。
优选地，所述多核苷酸分子选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
优选地，所述引物对包括如下所示甲基化引物对中的至少一组：
SEQ ID NO.16～17所示的第一甲基化引物对；SEQ ID NO.20～21所示的第二甲基化引物对；SEQ ID NO.24～25所示的第三甲基化引物对；SEQ ID NO.28～29所示的第四甲基化引物对。
优选地，所述引物对还包括非甲基化引物对，所述试剂盒包括如下组合中的至少一组：
SEQ ID NO.16～17所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.18～19所示的第一非甲基化引物对；SEQ ID NO.20～21所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.22～23所示的第二非甲基化引物对；SEQ ID NO.24～25所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.26～27所示的第三非甲基化引物对；SEQ ID NO.28～29所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.30～31所示的第四非甲基化引物对。
优选地，所述试剂盒还包括检测探针，所述试剂盒包括如下组合中的至少一组：
SEQ ID NO.16～17所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.32所示的第一检测探针；SEQ ID NO.20～21所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.33所示的第二检测探针；SEQID NO.24～25所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.34所示的第三检测探针；SEQ IDNO.28～29所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.35所示的第四检测探针。
优选地，所述检测探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团。
优选地，所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明提供的一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒，通过检测样本中多核苷酸分子的甲基化水平能够对子宫内膜癌进行早期检测，提供了能够用于子宫内膜癌(Ⅰ期和Ⅱ期)早期检测的生物标志物。本发明提供的试剂盒对子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本具有优异的检测效果，检测早期子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的灵敏性可达91.4％，检测健康人宫颈脱落细胞样本的特异性可达94.6％，能够有效区分早期子宫内膜癌患者和健康人。此外，该试剂盒对Ⅰ期、Ⅱ期子宫内膜癌均具有较高的检测灵敏性和特异性，其检测Ⅰ期、Ⅱ期子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的灵敏性可达89.7％、94.7％。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中，“检测”子宫内膜癌是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有子宫内膜癌。
术语“受试者”是指接受观察、检测或实验的对象。一些实施例中，受试者可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。一些实施例中，哺乳动物可以是人。
术语“样本”或“样品”包括从任何个体(较佳地为人)或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。例如，所述的样本可以包括但不限于：血液样本、组织样本(如石蜡包埋样本)、宫颈样本、宫腔样本、胸腔积液样本、肺泡灌洗液样本、腹水样本、腹水灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、细胞样本；较佳地，所述的样本包括但不限于：宫颈刮片或刷片样本、宫颈拭子、宫腔组织(刮出物)、宫颈脱落细胞、宫腔刮出物、宫腔灌洗液、阴道分泌物。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“生物标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，如蛋白质、DNA或RNA等。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应，PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50 pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
术语“亚硫酸氢盐转化试剂”是指包含(在一些实施例中)亚硫酸氢盐的试剂、亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或其组合，其可用以区分CpG二核苷酸序列等中的甲基化胞苷和未甲基化胞苷。
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在胞嘧啶核苷酸的第5位碳原子上添加一个甲基基团从而生成5-甲基胞嘧啶的生物学过程，是目前研究的最深入的一种表观遗传调控机制，其可在不改变DNA序列的情况下影响物种的遗传性状。异常的DNA甲基化模式可用于预测子宫内膜癌的风险。因此，基于DNA高甲基化状态的检测，可应用于子宫内膜癌早期筛查、辅助诊断、疗效评估、复发监测，覆盖子宫内膜癌诊疗的全流程。
本发明提供了一种检测多核苷酸分子甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌检测产品中的应用，上述多核苷酸分子选自(a)-(c)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)或(b)具有90％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)或(b)保持一致。
一些实施例中，上述互补序列是与SEQ ID NO.1～4任一所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应互补形成的核苷酸序列。
在本申请的一些实施例中，上述试剂所针对的是与SEQ ID NO.1～4任一所示的核苷酸序列、或其互补序列、或前述两者的部分连续区域有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的序列。较佳的实施例中，上述具有序列一致性的序列仍保持与SEQ ID NO.1～4任一所示的核苷酸序列、或其互补序列中的CpG二核苷酸位点不发生变化。
一些实施例中，上述多核苷酸分子选自如SEQ ID NO.1～4任一所示的核苷酸序列中的一者或至少两者的组合。
一些实施例中，上述多核苷酸分子选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
一些实施例中，上述子宫内膜癌包括Ⅰ期子宫内膜癌和Ⅱ期子宫内膜癌中的至少一种。
一些实施例中，上述子宫内膜癌检测产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。需要说明的是，本发明提供的子宫内膜癌检测产品并不限于上述所列举的检测多核苷酸分子甲基化水平的试剂，只要能满足子宫内膜癌的诊断或辅助诊断的需求的产品均在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒，上述试剂盒包括用于检测多核苷酸分子的甲基化水平的引物对，上述多核苷酸分子选自(a)-(c)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)或(b)具有90％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)或(b)保持一致。
一些实施例中，上述多核苷酸分子选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
发明人发现，上述多核苷酸分子的甲基化水平与子宫内膜癌显著相关。上述多核苷酸分子的甲基化状态可以被量化，并用于衡量其甲基化水平。一些实施例中，包含上述多核苷酸分子的样本可以广泛地采集自受试者的组织、细胞和体液等，特别是可以采集自受试者的宫颈脱落细胞进行检测。一些实施例中，上述多核苷酸分子也可以使用DNA重组技术、PCR法、利用DNA/RNA自动合成仪的方法等一般的技术来合成。一些实施例中，上述多核苷酸分子的甲基化水平可以通过使用上述引物对检测受试者样本而获得。
可以理解的是，在检测上述多核苷酸分子的甲基化水平时，可以针对上述任一多核苷酸分子的全长区域进行检测，还可以针对上述任一多核苷酸分子的部分区域进行检测。
一些实施例中，上述引物对包括如下所示甲基化引物对中的至少一组：用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一甲基化引物对；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二甲基化引物对；用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三甲基化引物对；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四甲基化引物对。
较佳实施例中，上述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17所示；上述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20～21所示；上述第三甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24～25所示；上述第四甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.28～29所示。
一些实施例中，上述引物对还包括如下所示非甲基化引物对中的至少一组：用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一非甲基化引物对；用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二非甲基化引物对；用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三非甲基化引物对；用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四非甲基化引物对。
较佳实施例中，上述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18～19所示；上述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23所示；上述第三非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.26～27所示；上述第四非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30～31所示。
更佳实施例中，上述试剂盒包括如下组合中的至少一组：SEQ ID NO.16～17所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.18～19所示的第一非甲基化引物对；SEQ ID NO.20～21所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.22～23所示的第二非甲基化引物对；SEQ ID NO.24～25所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.26～27所示的第三非甲基化引物对；SEQ IDNO.28～29所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.30～31所示的第四非甲基化引物对。
需要说明的是，若一种引物对与上述引物对(第一甲基化引物对、第一非甲基化引物对、第二甲基化引物对、第二非甲基化引物对、第三甲基化引物对、第三非甲基化引物对、第四甲基化引物对、第四非甲基化引物对)所示的核苷酸序列至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定子宫内膜癌诊断功能(特异性或灵敏性与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明保护范围内。
一些实施例中，上述试剂盒还包括检测探针。较佳实施例中，上述检测探针选自SEQ ID NO.32～35所示核苷酸序列中的至少一个。
更佳实施例中，上述试剂盒包括如下组合中的至少一组：SEQ ID NO.16～17所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.32所示的第一检测探针；SEQ ID NO.20～21所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.33所示的第二检测探针；SEQ ID NO.24～25所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.34所示的第三检测探针；SEQ ID NO.28～29所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.35所示的第四检测探针。
一些实施例中，上述引物对和检测探针可以使用DNA自动合成装置来化学合成，本申请并不对DNA自动合成装置进行限定，本领域技术人员可根据情况进行选择。
一些实施例中，上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中，上述内参基因可以为但不限于ACTB，上述内参基因ACTB的检测引物对为(上游引物：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.13)，下游引物：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.14))，内参基因ACTB的检测探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.15)。
一些实施例中，上述检测探针和上述内参基因的检测探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团，上述各探针的荧光报告基团独立地选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种；上述各探针的荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。
一些实施例中，上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。一些实施例中，上述甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐。
一些实施例中，上述扩增试剂包括但不限于扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中，上述阳性对照是指其中包含甲基化的多核苷酸分子，用于监测试剂盒中试剂的检测性能。上述阴性对照是指其中不包含甲基化的多核苷酸分子，用于监测实验是否受到污染。
一些实施例中，上述试剂盒还可以包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)。容器可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器。试剂盒还可以进一步包括用于接收生物样品的适合装置、用于实施在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述多核苷酸分子的甲基化水平进行检测，对子宫内膜癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。上述检测样本中多核苷酸分子的甲基化水平的方法包括但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了上述试剂盒用在检测子宫内膜癌或用在检测患有子宫内膜癌的风险提高、疑似患有子宫内膜癌或已经患有子宫内膜癌的受试者的用途。
本发明还提供了一种通过检测样本中多核苷酸分子的甲基化水平进而检测子宫内膜癌的方法，包括如下步骤：
S1、提取受试者宫颈脱落细胞样本的DNA，采用甲基化转化试剂对其进行转化，然后对转化后的DNA进行纯化；
S2、采用本发明提供的上述试剂盒进行qPCR扩增，通过MSP法检测宫颈脱落细胞样本中多核苷酸分子的甲基化水平；
S3、基于S2的结果，进而判断待测宫颈脱落细胞样本为子宫内膜癌阴性或阳性。
一些实施方式中，所述样本包括但不限于子宫内膜癌组织、宫颈样本、宫腔样本、宫颈刮片或刷片样本、宫颈拭子、宫腔组织(刮出物)、宫颈脱落细胞、宫腔刮出物、宫腔灌洗液、阴道分泌物、血液、血清或血浆。
本发明提供的上述方法能够低侵袭性地进行灵敏性和特异性高的子宫内膜癌的早期诊断，由此带来早期的治疗和预后的改善，进一步地，还能够监视疾病憎恶、监视外科治疗、放射线疗法的治疗和化学疗法的治疗的有效性。本发明的方法能够特异性地检测子宫内膜癌，能够有效区分子宫内膜癌患者和健康人。
本发明的方法及试剂盒用于诊断子宫内膜癌时，准确性非常高，上述子宫内膜癌生物标志物在子宫内膜癌早期筛查、疗效判定、辅助诊断、预后监测等领域极具应用价值。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1基于DNA甲基化的子宫内膜癌生物标志物及检测区域的确定
采用68例子宫内膜癌组织样本及68例癌旁对照的组织样本作为训练集进行焦磷酸测序，选择灵敏性≥80％，特异性≥85％的检测区域进行下一步验证。具体过程如下：
本发明提供的子宫内膜癌生物标志物为分离的多核苷酸分子，上述多核苷酸分子包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，其中SEQID NO.1(靶区域1)、SEQ ID NO.2(靶区域2)分别位于L1TD1基因的1号染色体负链的第62194932～62195132位和第62194835～62194928位的碱基的片段，SEQ ID NO.3(靶区域3)、SEQ ID NO.4(靶区域4)分别位于C14orf39基因的14号染色体负链的第60485559～60485722位和第60507060～60507181位的碱基的片段。上述多核苷酸分子的核苷酸序列中有多处甲基化的位点，发生在胞嘧啶的C-5位，产物称为5-甲基胞嘧啶(5-mC)。SEQ ID NO.1序列从5’-3’有20个甲基化位点，SEQ ID NO.2序列从5’-3’有7个甲基化位点，SEQ ID NO.3序列从5’-3’有14个甲基化位点，SEQ ID NO.4序列从5’-3’有15个甲基化位点，所有甲基化位点均已用标识出来，具体如下：
SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.2：
SEQ ID NO.3：
SEQ ID NO.4：
上述多核苷酸分子经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，DNA双链中的“C”转化为“U”，通过随后的PCR，将“U”转化为“T”，但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化。靶区域1～4(SEQ ID NO.1～4)经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的完全甲基化序列和非甲基化序列如表1所示，将其应用于设计检测引物或检测试剂盒。
表1完全甲基化序列和非甲基化序列
引物的成功设计对于PCR是至关重要的，对于硫化测序PCR(bisulfitesequencing PCR，BSP)需要设计两对引物，一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化序列；另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化序列，其中甲基化引物只特异性扩增甲基化的序列，非甲基化引物只特异性扩增非甲基化的序列。根据以上引物设计原则，对不同靶区域设计对应的甲基化引物对和非甲基化引物对，具体信息见表2。
表2甲基化引物对和非甲基化引物对的核苷酸序列
上述甲基化引物对SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.17和非甲基化引物对SEQ IDNO.18～SEQ ID NO.19扩增的靶区域包含SEQ ID NO.1中01～20号CpG位点。甲基化引物对SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.21和非甲基化引物对SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.23扩增的靶区域包含SEQ ID NO.2中01～06号CpG位点。甲基化引物对SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.25和非甲基化引物对SEQ ID NO.26～SEQ ID NO.27扩增的靶区域包含SEQ ID NO.3中01～14号CpG位点。甲基化引物对SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.29和非甲基化引物对SEQ ID NO.30～SEQ ID NO.31扩增的靶区域包含SEQ ID NO.4中01～15号CpG位点。
训练集中的子宫内膜癌的组织样本68例和癌旁组织样本68例分别作为实验组和对照组进行PCR和焦磷酸测序检测靶区域的关键CpG位点的甲基化状态。所有样本的收集过程已获得伦理委员会的审批，所有志愿者在样本收集前均已签署知情同意书。具体检测方法如下：
1)组织样本DNA的提取、转化和纯化
使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP304)提取收集的组织样本DNA，具体操作参见试剂盒说明书。使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843)对提取的组织样本DNA进行转化，转化完成后，用30μL纯化水进行洗脱，具体操作参见试剂盒说明书。
2)PCR反应
以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板，加入SYBR Green PCR Mix、L1TD1基因的靶区域和C14orf39基因的靶区域的甲基化引物对和非甲基化引物对进行PCR扩增，同时加入内参基因ACTB的检测引物对(上游引物：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.13)，下游引物：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.14))。PCR反应体系见表3，PCR反应条件见表4。
表3 SYBR Green PCR反应体系
组分 用量(μL)
SYBR Green PCR Mix 17.5
甲基化(非甲基化)上游引物(10μM) 0.5
甲基化(非甲基化)下游引物(10μM) 0.5
ACTB上游引物(10μM) 0.5
ACTB下游引物(10μM) 0.5
模板DNA 5
超纯水 补至50
表4 SYBR Green PCR反应程序
3)焦磷酸测序
将PCR产物送至测序公司进行焦磷酸测序，分析测序峰图、以焦磷酸测序的靶区域1～4(SEQ ID NO.1～4)的关键CpG位点的甲基化状态为准。具体地，一个CpG核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种：即甲基化和未甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化，如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶的测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T，则认为该位点是部分甲基化的。如果某一扩增子中95％以上的CpG二核苷酸位点中的C是甲基化的，则认为该样本在这一区域是甲基化的。
4)结果分析
PCR反应结束后，将扩增产物测序的结果同病理结果进行比对，计算该扩增产物的CpG位点的甲基化状态来计算此目标区域的灵敏度和特异性。灵敏性＝甲基化阳性样本/病理结果为阳性的样本；特异性＝甲基化阴性样本/病理结果为阴性的样本。检测结果见表5。
表5靶区域的CpG位点在训练集组织样本上的灵敏性和特异性
表5中，靶区域1～4在子宫内膜癌组织的甲基化水平显著高于正常子宫内膜组织(健康人)，采用甲基化引物对和非甲基化引物对检测靶区域1～4(SEQ ID NO.1～4)的甲基化水平进而诊断子宫内膜癌组织样本和癌旁正常组织样本的性能优异，检测子宫内膜癌组织样本的灵敏性均大于91％，检测特异性均大于83％，靶区域1～4满足灵敏度≥80％，特异性≥85％，所以靶区域1～4可进行下一步验证。其中，甲基化引物对SEQ ID NO.16～SEQ IDNO.17和非甲基化引物对SEQ ID NO.18～SEQ ID NO.19通过检测SEQ ID NO.1中01～20号CpG位点的甲基化水平检测癌旁正常组织样本的特异性可达88.2％；甲基化引物对SEQ IDNO.24～SEQ ID NO.25和非甲基化引物对SEQ ID NO.26～SEQ ID NO.27通过检测SEQ IDNO.3中01～14号CpG位点的甲基化水平诊断子宫内膜癌组织样本的灵敏性可达95.6％。
实施例2焦磷酸测序法在测试集样本上检测L1TD1基因靶区域和C14orf39基因靶区域的关键CpG位点的甲基化状态
利用焦磷酸测序的方法在30例子宫内膜癌脱落细胞样本及30例健康受试者宫颈脱落细胞样本的测试集中对筛选得到的差异甲基化位点进行验证，最终筛选验证得到对早期子宫内膜癌的早诊效能最佳目标区域。具体过程如下：
1)宫颈脱落细胞样本DNA的提取、转化和纯化
使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210836号)提取收集的宫颈脱落细胞样本DNA，具体操作参见试剂盒说明书。提取完成后，用50μL纯化水进行洗脱。使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843)对提取的脱落细胞样本DNA进行亚硫酸氢盐转化，具体操作参见试剂盒说明书，转化完成后，用30μL纯化水进行洗脱。
2)PCR反应
以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板，加入SYBR Green PCR Mix、L1TD1基因的靶区域和C14orf39基因的靶区域的甲基化引物对和非甲基化引物对进行PCR扩增，同时加入内参基因ACTB的检测引物对(上游引物：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.13)，下游引物：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.14))。PCR反应体系见表3，PCR反应条件见表4。
3)焦磷酸测序
将PCR产物送至测序公司进行焦磷酸测序，分析测序峰图、以焦磷酸测序的靶区域1～4(SEQ ID NO.1～4)的关键CpG位点的甲基化状态为准。具体地，一个CpG核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种：即甲基化和未甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化，如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶的测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T，则认为该位点是部分甲基化的。如果某一扩增子中95％以上的CpG二核苷酸位点中的C是甲基化的，则认为该样本在这一区域是甲基化的。
4)结果分析
PCR反应结束后，将扩增产物测序的结果同病理结果进行比对，计算该扩增产物的CpG位点的甲基化状态来计算此目标区域的灵敏度和特异性。灵敏性＝甲基化阳性样本/病理结果为阳性的样本；特异性＝甲基化阴性样本/病理结果为阴性的样本。检测结果见表6。
表6靶区域在测试集样本上的特异性和灵敏性
区域 脱落细胞特异性 脱落细胞灵敏性
靶区域1 96.7％(29/30) 83.3％(25/30)
靶区域2 90.0％(27/30) 76.7％(23/30)
靶区域3 93.3％(28/30) 86.7％(26/30)
靶区域4 90.0％(27/30) 80.0％(24/30)
由表6可得出以下结论：在子宫内膜癌发生高甲基化的目标区域可通过检测宫颈脱落细胞来实现，靶区域1～4在宫颈脱落细胞中的检测特异性范围为90.0％～96.7％，检测灵敏性范围为76.7％～86.7％。将靶区域1～4再进一步在临床样本上验证检测性能。
实施例3基于qMSP法用于早期子宫内膜癌脱落细胞样本检测的甲基化试剂盒
本实施例在试验过程中对采集的样本经过编盲后，再由试验操作者进行试验，结果判读者根据判读标准，将得到的检测结果与病理结果(金标准)进行比对，考察子宫内膜癌标志物的临床有效性。
为了实现无创检测和进一步提高试剂盒诊断子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的灵敏度，共收集健康人宫颈脱落细胞样本166例，纳入病理诊断为子宫内膜癌的宫颈脱落细胞样本58例，其中58例子宫内膜癌患者中，39例为Ⅰ期，19例为Ⅱ期，所有患者术前均未接受放疗或化疗。本实施例中，结合临床经验将Ⅰ/Ⅱ期子宫内膜癌定义为早期子宫内膜癌。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。本实施通过检测受试者宫颈脱落细胞样本中靶区域的甲基化水平来诊断早期子宫内膜癌患者。具体过程如下：
1)宫颈脱落细胞样本DNA的提取、转化和纯化
使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210836号)提取收集的宫颈脱落细胞样本DNA，具体操作参见试剂盒说明书。提取完成后，用50μL纯化水进行洗脱。使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843)对提取的脱落细胞样本DNA进行亚硫酸氢盐转化，具体操作参见试剂盒说明书，转化完成后，用30μL纯化水进行洗脱。
2)qPCR反应
以亚硫酸氢盐转化后的多核苷酸序列为模板设计检测探针，具体检测引物和探针组合见表7。用TaqMan探针法对临床样本进行靶区域的PCR扩增。检测单一目标区域的甲基化水平时，PCR反应管中除加入必需的反应成分、模板、单一靶区域的甲基化引物对和检测探针以外，还需加入内参基因ACTB的检测引物对(SEQ ID NO.13～14)和检测探针(SEQ IDNO.15：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG)。此外还需要设置阴性和阳性对照：阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液，其它成分与实验管相同；阳性对照PCR管的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒和103 copies/μL含转化后靶区域的质粒等体积的混合物，其它成分也与实验管相同。若检测靶区域组合的甲基化水平，PCR反应管中除加入上述组分以外，还需加入另一靶区域的甲基化引物对和检测探针。
表7甲基化引物对和检测探针的核苷酸序列
靶区域 甲基化引物对(5’-3’) 检测探针(5’-3’) 检测CpG位点
靶区域1 SEQ ID NO.16～17 SEQ ID NO.32 SEQ ID NO.1中01～20号CpG位点
靶区域2 SEQ ID NO.20～21 SEQ ID NO.33 SEQ ID NO.2中01～06号CpG位点
靶区域3 SEQ ID NO.24～25 SEQ ID NO.34 SEQ ID NO.3中01～14号CpG位点
靶区域4 SEQ ID NO.28～29 SEQ ID NO.35 SEQ ID NO.4中01～15号CpG位点
上述检测探针均为TaqMan探针，其5’端为荧光报告基团，如FAM、ROX、VIC、CY5等；3’端为荧光淬灭基团，如TAMRA、BHQ、MGB等。本实施例中，检测探针SEQ ID NO.32和检测探针SEQ ID NO.33的5’端的荧光报告基团均为ROX；检测探针SEQ ID NO.34和检测探针SEQID NO.35的5’端的荧光报告基团均为VIC；3’端的荧光淬灭基团均为BHQ或BHQ1。内参基因ACTB的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB。qPCR反应体系见表8(若只检测单一靶区域，则不加入另一靶区域的甲基化引物对和检测探针，其余体积用纯化水补足)，qPCR反应条件见表9。
表8 TaqMan PCR反应体系
表9 TaqMan PCR程序
qPCR反应结束后，需手动调整基线和设置合适的阈值，基线通常是3～15个循环的荧光信号，阈值置于指数扩增期内。
3)结果分析
分析qPCR反应的结果，要求①阴性对照PCR管无扩增；②阳性对照PCR管有明显的指数增长期，且阳性对照PCR管目标区域的Ct值在26～30之间；③待测样本的内参基因的Ct值小于等于34。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求，则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读，否则，当次实验无效，必须重新进行检测。
对于脱落细胞样本，阳性判断值为37.8，若使用某一对甲基化引物对和检测探针进行扩增的Ct值≤37.8，则判定该样本在此扩增区域为甲基化阳性；若使用某一对甲基化引物对和检测探针进行扩增的Ct值＞37.8，则判定该样本在此扩增区域为甲基化阴性。在靶区域组合检测时，若待测样本中区域组合中任意一个靶区域为甲基化阳性，则该样本为子宫内膜癌阳性样本，仅当待测样本中区域组合中的两个靶区域均为甲基化阴性，则该样本为子宫内膜癌阴性样本。根据以上标准，具体检测结果见表10。
表10靶区域的CpG位点在宫颈脱落细胞样本的灵敏性和特异性
由表10可看出，通过MSP法检测宫颈脱落细胞样本中L1TD1基因的靶区域和C14orf39基因的靶区域的甲基化水平进而诊断早期子宫内膜癌的性能良好。L1TD1基因的靶区域(靶区域1、靶区域2)检测Ⅰ期子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的灵敏性分别为84.6％、82.1％，检测Ⅱ期子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的灵敏性分别为94.7％、84.2％；C14orf39基因的靶区域(靶区域3、靶区域4)检测Ⅰ期子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的灵敏性分别为87.2％、84.6％，检测Ⅱ期子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的灵敏性分别为94.7％、89.5％。靶区域1～4检测宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的总灵敏性范围为82.8％～89.7％，检测健康人宫颈脱落细胞样本的特异性均大于等于91％。
对比表5、表10发现，通过检测单一靶区域的甲基化水平检测健康人宫颈脱落细胞样本的特异性高于检测癌旁正常组织样本，这表明上述甲基化引物对和检测探针对健康人宫颈脱落细胞样本具有优异的检测特异性，检测准确度高。
将L1TD1基因的靶区域和C14orf39基因的靶区域进行组合，即将靶区域1～2分别于靶区域3～4组合检测，发现靶区域组合检测子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的总灵敏性大多高于单一靶区域检测，或与单一靶区域检测持平，检测总灵敏性最高可达91.4％；靶区域组合检测健康人宫颈脱落细胞样本的特异性略低于单一靶区域检测，但仍处于较高水平，检测特异性均大于90％。具体地，靶区域1+靶区域3检测Ⅰ期、Ⅱ期子宫内膜癌宫颈脱落细胞样本的灵敏性可达89.7％、94.7％，检测健康人宫颈脱落细胞样本的特异性为92.8％，优于其它靶区域组合。
综上，本发明提供的试剂盒通过检测单一靶区域或靶区域组合的甲基化水平，诊断早期子宫内膜癌患者宫颈脱落细胞样本的性能优异，对Ⅰ期、Ⅱ期子宫内膜癌均具有较高的检测灵敏性，对健康人宫颈脱落细胞样本具有优异的检测特异性，检测准确度高。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测多核苷酸分子甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌检测产品中的应用，其特征在于，所述多核苷酸分子选自(a)-(c)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)或(b)具有90％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)或(b)保持一致。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸分子选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述子宫内膜癌包括Ⅰ期子宫内膜癌和Ⅱ期子宫内膜癌中的至少一种；所述子宫内膜癌检测产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
4.一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测多核苷酸分子的甲基化水平的引物对，所述多核苷酸分子选自(a)-(c)中至少一项：
(a)包括SEQ ID NO.1～4任一所示核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)或(b)具有90％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)或(b)保持一致。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多核苷酸分子选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的组合。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对包括如下所示甲基化引物对中的至少一组：
SEQ ID NO.16～17所示的第一甲基化引物对；SEQ ID NO.20～21所示的第二甲基化引物对；SEQ ID NO.24～25所示的第三甲基化引物对；SEQ ID NO.28～29所示的第四甲基化引物对。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对还包括非甲基化引物对，所述试剂盒包括如下组合中的至少一组：
SEQ ID NO.16～17所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.18～19所示的第一非甲基化引物对；SEQ ID NO.20～21所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.22～23所示的第二非甲基化引物对；SEQ ID NO.24～25所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.26～27所示的第三非甲基化引物对；SEQ ID NO.28～29所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.30～31所示的第四非甲基化引物对。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测探针，所述试剂盒包括如下组合中的至少一组：
SEQ ID NO.16～17所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.32所示的第一检测探针；SEQ ID NO.20～21所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.33所示的第二检测探针；SEQ IDNO.24～25所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.34所示的第三检测探针；SEQ ID NO.28～29所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.35所示的第四检测探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团。
10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
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