CN118064592A - 用于检测前列腺癌的核酸组合、试剂盒及应用 - Google Patents

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CN118064592A CN202410377780.5A CN202410377780A CN118064592A CN 118064592 A CN118064592 A CN 118064592A CN 202410377780 A CN202410377780 A CN 202410377780A CN 118064592 A CN118064592 A CN 118064592A
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Abstract

本申请属于分子生物学检测领域，更具体地，涉及用于检测前列腺癌的核酸组合、试剂盒及应用。本申请提供了能够用于检测前列腺癌的甲基化分子标志物，其包括FAIM2基因的Chr12:49903810‑49904210正链的全长或部分区域，和/或，OSBPL5基因的Chr11:3160499‑3160899负链的全长或部分区域。本申请提供的用于检测前列腺癌的核酸组合和试剂盒，通过检测样本中前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平，能够有效区分前列腺癌患者、泌尿系统良性疾病受试者和健康受试者，对前列腺癌尿液样本进行高灵敏度、高特异性的检测，有利于前列腺癌的早期检出，提高患者的生存率。

Description

用于检测前列腺癌的核酸组合、试剂盒及应用
技术领域
本申请属于分子生物学检测领域，更具体地，涉及用于检测前列腺癌的核酸组合、试剂盒及应用。
背景技术
前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是老年男性高发的癌症之一，其发病率和死亡率高峰在70岁左右。因此，实现前列腺癌早期诊断是提高患者的存活率和生命质量的有效手段。目前确诊前列腺癌最准确的方法为穿刺活检，该方法为有创侵入性检测，具有一定风险性且患者依从性低。需要开发非侵入性的诊断方法和产品实现前列腺癌早期筛查。
液态活检作为癌症诊断和治疗过程的一种临床解决方案，该方法为无创检测，且患者依从性高。通过在尿液中筛选高灵敏度、高特异性的前列腺癌差异甲基化的分子标志物对于提高前列腺癌的检出率是十分重要的。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本申请的目的在于提供了用于检测前列腺癌的核酸组合、试剂盒及应用，旨在解决现有的分子标志物检测前列腺癌尿液样本的灵敏度、特异性有待提升，易出现假阳性和假阴性结果等的技术问题。
为实现上述目的，本申请提供了用于检测前列腺癌的核酸组合，其为用于检测样本中前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平的核酸组合；以GRCh38为参考基因组，上前列腺癌甲基化分子标志物包括FAIM2基因的Chr12:49903810-49904210正链的全长或部分区域，和/或OSBPL5基因的Chr11:3160499-3160899负链的全长或部分区域。
优选地，上述核酸组合包括用于检测上述前列腺癌甲基化分子标志物甲基化水平的引物对，和/或检测探针。
优选地，上述核酸组合包括用于检测Chr12:49903810-49904210正链甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；
和/或，用于检测Chr11:3160499-3160899负链甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对。
优选地，上述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示；上述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示；上述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示；上述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示。
优选地，上述核酸组合包括用于检测Chr12:49903810-49904210正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一检测探针；
和/或，用于检测Chr11:3160499-3160899负链甲基化水平的第二甲基化引物对和第二检测探针。
进一步优选地，上述核酸组合包括如下组合中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.18所示的第一检测探针；
(2)SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第二检测探针。
本申请还提供了用于检测前列腺癌的试剂盒，其包括上述核酸组合。
优选地，上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
优选地，上述检测探针的5'端包含有荧光报告基团，3'端包含有荧光淬灭基团。
本申请还提供了上述核酸组合或上述试剂盒在制备检测前列腺癌的产品中的应用。
总体而言，通过本申请所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本申请提供的用于检测前列腺癌的核酸组合、试剂盒，通过检测样本中前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平，能够对前列腺癌进行无创、高灵敏度、高特异性检测，降低假阳性和假阴性结果的检出，检测准确度。
(2)本申请提供了能够用于检测前列腺癌的甲基化分子标志物，包括FAIM2基因的Chr12:49903810-49904210正链的全长或部分区域和/或OSBPL5基因的Chr11:3160499-3160899负链的全长或部分区域，根据上述前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平，能够有效区分前列腺癌患者、泌尿系统良性疾病受试者和健康受试者，在实现无创检测的同时，提高前列腺癌检测的灵敏度和特异性。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中，“检测”前列腺癌是指检测疾病存在与否，即判断受试者是否患有前列腺癌。
术语“样本”是指可能包含需要进行分析的目标区域的任何物质，包括生物样本。在本申请中，“样本”或“生物样本”可以是直接从生物来源获得的样本或者是被处理的样本。样本或生物样本包括但不限于体液(例如全血、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰、眼泪、粘液、羊水等)、渗出液、骨髓样本、腹水、骨盆冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液、鼻、喉或生殖器拭子的提取物、消化组织的细胞悬浮液、或粪类物质的提取物、以及来自人、动物(例如非人哺乳动物)和植物的组织和器官样本，以及由此衍生出的加工样本。
术语“受试者”可以是哺乳动物或哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。在本申请中，哺乳动物是指任何种类的哺乳动物，优选人(包括人、人受试者或人患者)。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”是指一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“甲基化分子标志物”是指一种生化指标，其包括至少一个甲基化基因座和/或至少一个甲基化基因座的甲基化状态，例如高甲基化基因座。特别地，甲基化分子标志物是甲基化状态在癌症个体和非癌个体呈现差异化的一个或多个核酸基因座。其中，“甲基化基因座”是指包含至少一个差异甲基化区域的DNA区域或片段。在选定的条件下，例如癌症状态下，甲基化基因座是高甲基化的，即相比于非癌状态包括更多数量或频率的甲基化位点；或者，在癌症状态下，甲基化基因座可以是低甲基化的，即相比于非癌状态包括较少数量或频率的甲基化位点。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本申请中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指正向引物和反向引物组成的组。
术语“甲基化转化试剂”是指包含(在一些实施例中)亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐、重亚硫酸氢盐或其组合的试剂，经过甲基化转化试剂处理的DNA，其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变，可以区分例如CpG二核苷酸序列等中的甲基化胞苷和未甲基化胞苷。
术语“TaqMan探针”是指包含5'荧光报告基团和3'淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5'-3'核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。当检测探针所携带的荧光基团不同时，TaqMan qPCR反应体系可满足同时检测多个目标基因的需求。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经甲基化转化试剂处理后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可区分甲基化与非甲基化的DNA序列。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经甲基化转化试剂转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。在本申请公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物对，若Ct值满足所述要求(例如在尿液样本中Ct≤45)，则表明目标序列是甲基化的。
本申请提供了用于检测前列腺癌的核酸组合，其为用于检测样本中前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平的核酸组合；以GRCh38为参考基因组，上述前列腺癌甲基化分子标志物包括FAIM2基因的Chr12:49903810-49904210正链的全长或部分区域，和/或OSBPL5基因的Chr11:3160499-3160899负链的全长或部分区域。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测Chr12:49903810-49904210正链和/或Chr11:3160499-3160899负链的甲基化水平的引物对。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测Chr12:49903810-49904210正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；
和/或，用于检测Chr11:3160499-3160899负链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对。
较佳实施例中，上述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示；上述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示；上述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示；上述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.13～14所示。
需要说明的是，若一种引物对与上述第一甲基化引物对、上述第一非甲基化引物对、上述第二甲基化引物对、上述第二非甲基化引物对所示的核苷酸序列具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的前列腺癌诊断功能(特异性或灵敏性与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本申请保护范围内。
一些实施例中，上述样本选自组织(例如组织切片)、全血、血浆、血清、胸腔积液、腹水、羊水、唾液、骨髓、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。在本申请的一些优选实施例中，上述待测样本为组织、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣或尿液上清。在本申请的一些更优选实施例中，上述待测样本为尿液。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测Chr12:49903810-49904210正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一检测探针；
和/或，用于检测Chr11:3160499-3160899负链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二检测探针。
较佳实施例中，上述核酸组合包括如下组合中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.18所示的第一检测探针；
(2)SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第二检测探针。
本申请还提供了用于检测前列腺癌的试剂盒，其包括上述核酸组合。
一些实施例中，上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
本申请对内参基因不作限定，例如但不限于ACTB。在本申请的一些具体实施例中，内参基因ACTB的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他内参基因此时，内参基因的检测引物对和检测探针对应设计即可。
一些实施例中，本申请所用检测探针为荧光探针，可选地检测探针为TaqMan探针，上述第一检测探针、第二检测探针和内参基因的检测探针均含有荧光报告基团和荧光淬灭基团，其中检测探针的5'端包含有荧光报告基团，上述各检测探针的荧光报告基团独立地选自FAM、ROX、CY5、VIC、TET、JOE和HEX中的任意一种或多种；检测探针的3'端包含有荧光淬灭基团，上述各检测探针的荧光淬灭基团独立地选自MGB、BHQ1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种或多种。各检测探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于前述所列举。
一些实施例中，上述核酸提取试剂包括但不限于裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。
一些实施例中，上述甲基化转化试剂上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。本申请对甲基化转化试剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以。
一些实施例中，上述PCR反应试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
一些实施例中，上述阳性对照品是指其中包含甲基化的分子标志物，用于监测试剂的检测性能，上述阴性对照品是指其中不包含甲基化的分子标志物，用于监测实验是否受到污染。
基于本申请公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术检测前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平，对前列腺癌进行诊断，无论采用何种技术，都在本申请的保护范围。上述检测样本中前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平的方法包括但不限于亚硫酸氢盐测序(BSP)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、基于限制酶的测序、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)、甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、基于限制酶的微阵列分析、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本申请还提供了上述核酸组合或上述试剂盒在制备检测前列腺癌的产品中的应用。
一些实施例中，上述前列腺癌包括但不限于引物、探针、试剂盒、芯片、测序文库、膜条和蛋白阵列中的至少一种。可选地，上述产品可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。
本发明提供的试剂盒能够实现前列腺癌的鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、前列腺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。其中，上述前列腺癌的鉴别诊断具体可以是用于确认个体是否患有前列腺癌或者更加有可能患有前列腺癌；上述微小病灶残留评估及动态监测具体可以是用于确认个体中是否残留微小病灶；上述前列腺癌复发及预后的辅助判断是指前列腺癌复发的风险和预后情况预测，具体可以是用于确认个体前列腺癌复发的可能性或恶化倾向，可用于指导临床诊疗；上述药物疗效评耐药监测具体可以是用于确认某种药物或治疗手段是否对前列腺癌个体有效。
基于此，本申请还提供了一种通过检测样本中前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平来诊断前列腺癌的方法，包括如下步骤：提取受试者尿液样本DNA并用甲基化转化试剂进行处理，以经转化和纯化的DNA为模板，加入用于检测前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平的引物对和与引物对对应的检测探针，以及其它试剂，进行qPCR反应，基于检测结果，进而判断待测样本为前列腺癌阴性或阳性。本发明提供的试剂盒通过对尿液样本进行检测，能够准确地筛查前列腺癌高危人群，帮助实现前列腺癌的早诊早治，有效避免假阳性、假阴性结果的检出。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。应当理解的是，与如下实施例中的试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本申请。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1基于Sanger测序法分析目标区域检测组织样本的性能
采用59例前列腺癌组织样本和59例癌旁正常组织样本作为训练集样本，尝试分别以FAIM2基因的靶区域(Chr12:49903810-49904210正链)、OSBPL5的靶区域(Chr11:3160499-3160899负链)作为诊断前列腺癌的甲基化分子标志物，采用Sanger测序法验证其在前列腺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的甲基化水平，以明确其是否可作为诊断前列腺癌的甲基化分子标志物。并选择检测组织样本的灵敏度≥80％，检测癌旁正常组织样本的特异性≥80％的区域进行下一步验证。训练集中的组织样本均为经福尔马林固定且经石蜡包埋的样本，所有样本的收集过程已获得伦理委员会的审批，所有志愿者在样本收集前已签署知情同意书。
用于前列腺癌诊断的甲基化分子标志物在前列腺癌样本中需表现为高甲基化，而在癌旁正常组织样本中表现为低甲基化或未甲基化。上述完全甲基化的甲基化分子标志物经甲基化转化试剂处理后获得完全甲基化序列，上述完全未甲基化的甲基化分子标志物经甲基化转化试剂处理后获得非甲基化序列。本实施例对上述甲基化分子标志物经甲基化转化试剂处理后的序列(见表1)进行桑戈尔测序，以分析前列腺癌组织样本和癌旁正常组织样本中甲基化分子标志物的甲基化水平。
表1甲基化分子标志物的DNA序列及经甲基化转化试剂处理后的序列
靶基因 靶区域 DNA序列(5'-3') 完全甲基化序列(5'-3') 非甲基化序列(5'-3')
FAIM2 靶区域1 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.3
OSBPL5 靶区域2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.6
1)组织样本DNA的提取、转化和纯化
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取石蜡包埋的组织样本基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化，随后对转化的DNA进行纯化。
2)PCR扩增
使用表2所示的扩增引物对进行PCR反应，扩增组织样本中的靶区域，并进行Sanger测序。具体地，首先配制PCR反应体系(见表3)，以亚硫酸氢盐转化后的样本DNA为模板，同时加入SYBR Green PCR Mix、靶区域的甲基化引物对和非甲基化引物对(见表2)以及内参基因ACTB的上下游引物：5'-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3'(SEQ ID NO.15)，5'-AATAACACCCCCACCCTGC-3'(SEQ ID NO.16)，然后根据表4所示的反应程序进行PCR扩增。
表2甲基化引物对和非甲基化引物对
表3 SYBR Green PCR反应体系
组分 用量(μL)
SYBR Green PCR Mix 17.5
甲基化(非甲基化)上游引物对(10μM) 0.5
甲基化(非甲基化)下游引物对(10μM) 0.5
ACTB的上游引物(10μM) 0.5
ACTB的下游引物(10μM) 0.5
模板DNA 4
超纯水 补至25
表4 SYBR Green PCR反应程序
3)Sanger测序及结果分析
将PCR产物送至测序公司进行Sanger测序，分析测序峰图、以Sanger测序的关键CpG位点的甲基化状态为准。具体地，一个CpG核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种：即甲基化和未甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化，如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶的测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T，则认为该位点是部分甲基化的。如果某一扩增子中95％以上的CpG二核苷酸位点中的C是甲基化的，则认为该样本在这一区域是甲基化的。
根据上述标准将扩增产物的测序结果同病理结果进行比对，根据扩增产物的CpG位点的甲基化状态计算此目标区域的灵敏度和特异性。灵敏度＝病理结果为阳性的样本检出甲基化阳性的比例；特异性＝病理结果为阴性的样本检出甲基化阴性的比例。检测结果见表5。
表5靶区域的CpG位点在训练集组织样本上的灵敏性和特异性
表5中，靶区域1、靶区域2在前列腺癌组织样本的甲基化水平显著高于癌旁正常组织样本，采用甲基化引物对和非甲基化引物对检测靶区域1、靶区域2的甲基化水平诊断前列腺癌的性能优异，检测前列腺癌组织样本的灵敏性均大于84％，检测癌旁正常组织样本的特异性均大于81％，靶区域1、靶区域2均满足上述筛选标准，可进行下一步验证。
实施例2qMSP法在测试集样本上分析靶区域检测前列腺癌尿液样本的性能
考虑到甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)技术在临床应用中更加快速、便捷且成本较低，因此，本实施例提供了qMSP法检测靶区域1、靶区域2的甲基化水平进而诊断前列腺癌尿液样本的性能。
1)样本收集
收集28例经病理检测确诊的前列腺癌患者尿液样本，健康受试者尿液样本83例。每份尿液样本的体积均大于10mL。所有尿液样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有尿液样本均采用匿名化处理。
2)尿液样本DNA提取、亚硫酸氢盐转化和纯化同实施例1。
3)甲基化特异性荧光定量PCR检测(qMSP)
以前列腺癌甲基化分子标志物(靶区域1、靶区域2)经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为模板，设计用于甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)的引物对和检测探针，要求该引物对具有良好的扩增特异性，即该引物对仅扩增发生甲基化的DNA模板，不扩增未发生甲基化的DNA模板，同时也不会引起其它非特异性扩增；另外，该引物对具有良好的扩增效率，即其对各个靶区域的扩增效率在90％～110％之间。满足上述要求的引物对和检测探针的核苷酸序列如表6所示。基于TaqMan探针的qPCR反应可以在一个反应体系中同时检测多个目标基因，只需每个目标基因特异性的检测探针5'端携带的荧光基团不同即可。本实施例中，内参基因ACTB的检测探针(SEQ ID NO.17:GGAGTGGTTTTTGGGTTTG)5'端荧光基团为FAM，3'端荧光淬灭基团为MGB；靶区域1的检测探针5'端荧光基团为ROX，3'端荧光淬灭基团为MGB；靶区域2的检测探针5'端荧光基团为VIC，3'端荧光淬灭基团为MGB。将上述甲基化引物、检测探针人工合成备用。
表6靶区域1、靶区域2的甲基化引物对和检测探针
靶区域 甲基化引物对(5'-3') 检测探针(5'-3')
靶区域1 SEQ ID NO.7～8 SEQ ID NO.18:CGCAACATCTTCCCAAA
靶区域2 SEQ ID NO.11～12 SEQ ID NO.19:CCTTCCTCTACTAACCATC
以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的体液样本DNA作为模板，分别使用表6中提供的引物对和检测探针进行qMSP反应，qMSP的反应体系如表7所示，反应程序如表8所示。在对每个样本进行qPCR反应时，均需要检测内参基因ACTB的量，用以监测样本质量及结果判读。在每块PCR反应板内，除设置实验孔用以检测待测样本以外，还需要同时设置阳性对照孔和阴性对照孔。阳性对照孔的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含完全甲基化且亚硫酸氢盐转化后靶区域DNA序列的质粒混合物(等体积混合)，其它成分与实验管相同；阴性对照孔的模板为TE缓冲液，其它成分也与实验管相同。
表7 PCR反应体系
表8PCR反应程序
qPCR反应结束后，调整基线(一般将第3～15个循环所对应的信号值设置为基线水平)，并设置阈值，阈值必须位于指数扩增期内，穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线，阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果，要求①阴性对照管无扩增；②阳性对照PCR管有明显的指数增长期，且阳性对照PCR管的目标基因的Ct值在26～30之间；③待测样本的内参基因ACTB的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求，则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读，否则，当次实验无效，必须重新进行检测。
4)结果判读
尿液样本的阳性判断值为45，若使用甲基化检测引物对和检测探针扩增的Ct值≤45，认为该样本在此扩增区域为甲基化阳性，该样本为前列腺癌阳性样本；若使用甲基化检测引物对和探针扩增的Ct值＞45，认为该样本在此扩增区域为甲基化阴性，该样本为前列腺癌阴性样本。通过qMSP法检测单一靶区域的甲基化水平，诊断受试者尿液样本的性能见表9。
表9qMSP法检测单一靶区域的甲基化水平诊断受试者尿液样本的性能
表9中，靶区域1、靶区域2检测前列腺癌尿液样本的灵敏度均大于等于78.7％，检测健康受试者尿液样本的特异性均大于等于94％，能够有效降低假阳性样本和假阴性样本的检出。
实施例3前列腺癌甲基化分子标志物(靶区域1、靶区域2)检测受试者尿液样本的性能验证
本实施例另收集了前列腺癌和对照者的尿液样本，以在不同的样本集合中验证上述甲基化分子标志物诊断前列腺癌的性能。共收集82例经病理检测确诊的前列腺癌患者尿液样本，248例进行常规体检的健康受试者尿液样本，43例泌尿系统良性疾病(包括前列腺增生、泌尿道感染、腺性膀胱炎、肾结石、肾积水等)受试者尿液样本。每份尿液样本的体积均大于10mL。尿液样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有尿液样本均采用匿名化处理。本实施通过检测受试者尿液样本中前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平来诊断前列腺癌患者，检测过程中对采集的样本经过编盲后，再由试验操作者进行试验，结果判读者根据判读标准，将得到的检测结果与病理结果(金标准)进行比对，考察前列腺癌甲基化分子标志物的临床有效性。
尿液样本DNA的提取、亚硫酸氢盐转化和纯化、qMSP检测、Ct值读取和质量控制同实施例2。前列腺癌甲基化标志物检测临床尿液样本的性能验证结果见表10。
表10前列腺癌甲基化标志物检测临床尿液样本的性能验证
由表10可以看出，在373例独立验证集中，靶区域1和/或靶区域2作为前列腺癌甲基化标志物诊断前列腺癌尿液样本的性能优异，其检测前列腺癌尿液样本的灵敏度范围为81.7％～84.1％，检测健康受试者尿液样本的特异性范围为93.0％～96％，检测泌尿系统良性疾病尿液样本的特异性范围为93％～97.7％。
综上，检测靶区域1和靶区域2的组合，或者靶区域1或靶区域2中的任意一个区域的甲基化水平都能够有效区分前列腺癌患者、健康受试者和泌尿系统良性疾病受试者，并可以进行无创诊断，有利于前列腺癌的早期检出，提高患者的生存率。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于检测前列腺癌的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合为用于检测样本中前列腺癌甲基化分子标志物的甲基化水平的核酸组合；以GRCh38为参考基因组，所述前列腺癌甲基化分子标志物包括FAIM2基因的Chr12:49903810-49904210正链的全长或部分区域，和/或OSBPL5基因的Chr11:3160499-3160899负链的全长或部分区域。
2.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括用于检测所述前列腺癌甲基化分子标志物甲基化水平的引物对，和/或检测探针。
3.根据权利要求2所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括用于检测Chr12:49903810-49904210正链甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；
和/或，用于检测Chr11:3160499-3160899负链甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对。
4.根据权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示；所述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示；所述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示；所述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示。
5.根据权利要求2所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括用于检测Chr12:49903810-49904210正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一检测探针；
和/或，用于检测Chr11:3160499-3160899负链甲基化水平的第二甲基化引物对和第二检测探针。
6.根据权利要求5所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括如下组合中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.18所示的第一检测探针；
(2)SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第二检测探针。
7.用于检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至6任一项所述的核酸组合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团，3'端包含有荧光淬灭基团。
10.权利要求1至6任一项所述的核酸组合或权利要求7至9任一项所述的试剂盒在制备检测前列腺癌的产品中的应用。
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