CN117106899A - 一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,更具体地,涉及一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒通过检测样本中TPM4P1基因CpG岛上的靶区域的甲基化水平可以有效区分恶性肺结节患者和良性肺结节患者,提供了能够用于肺结节良恶性检测的生物标志物。该试剂盒能够低侵袭性、低成本、高灵敏性、高特异性的检测肺结节良恶性血液样本,能够有效区分恶性肺结节患者和良性肺结节受试者,降低假阴性结果的检出,检测准确度高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,更具体地,涉及一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和致死率在恶性肿瘤中占据首位。由于肺癌早期常无明显症状,临床上多数患者出现症状就诊时已为晚期,肺癌患者整体生存率不高。基于这一严峻现状,各国均将早筛早诊作为肺癌防治的重点。
目前肺癌早筛的方法有肿瘤标记物、胸部DR、胸部CT、痰细胞学检查等。影像学中肺结节呈现出类圆形的局灶性肺部阴影,密度有所增高,为实性或者是亚实性,多以直径在3cm的结节存在,但这些结节缺乏特异性,难以进行良恶性鉴别。
因此,探索精确且较无创的诊断方法,精准识别良恶性肺结节,减少患者的漏检率及错检率对促进肺癌防治工作极为关键。研究肺结节良恶性差异生物标志物,从而建立对肺癌早期预警,肺结节良恶性鉴别的高灵敏性、高特异性的临床检测方案。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供了一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用,以改善现有技术对肺结节良恶性的诊断手段不足、检测准确度低、容易出现假阴性/假阳性结果等技术问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种用于检测肺结节良恶性的引物对,其为用于检测样本中肺结节良恶性生物标志物的甲基化水平的引物对,所述肺结节良恶性生物标志物选自TPM4P1基因CpG岛上的靶区域。
优选地,以GRCh38.p14为参考基因组,所述TPM4P1基因CpG岛上的靶区域选自Chr10:100115071-100115478负链的全长或部分区域。
优选地,所述引物对包括用于检测Chr10:100115071-100115478负链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对,所述甲基化引物对包括SEQ ID NO.4~5所示的第一甲基化引物对;和/或,SEQ ID NO.8~9所示的第二甲基化引物对。
进一步优选地,所述引物对还包括用于检测Chr10:100115071-100115478负链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对。
进一步优选地,所述引物对包括SEQ ID NO.4~5所示的第一甲基化引物对和SEQID NO.6~7所示的第一非甲基化引物对;和/或,SEQ ID NO.8~9所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.10~11所示的第二非甲基化引物对。
本发明还提供了一种用于检测肺结节良恶性的引物探针组合,其包括所述引物对,还包括检测探针。
优选地,所述引物探针组合包括SEQ ID NO.4~5所示的第一甲基化引物对和SEQID NO.15所示的第一检测探针;和/或,SEQ ID NO.8~9所示的第二甲基化引物对和SEQ IDNO.16所示的第二检测探针。
本发明还提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒,其包括所述引物对或所述引物探针组合。
优选地,所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
优选地,所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团,3'端包含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了所述引物对或所述引物探针组合或所述试剂盒在制备肺结节良恶性诊断产品中的应用。
优选地,所述恶性肺结节包括实性肺结节和亚实性肺结节中的至少一种。
优选地,所述肺结节良恶性诊断产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
(1)本发明提供的一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒,通过检测样本中TPM4P1基因CpG岛上的靶区域的甲基化水平可以有效区分恶性肺结节患者和良性肺结节患者,提供了能够用于肺结节良恶性检测的生物标志物,该标志物对于肺部结节良恶性检测具有较好的灵敏性和特异性,能准确判别良恶性肺结节,对于及时诊断、改善预后、降低死亡率有重要意义。
(2)本发明提供的试剂盒能够有效区分恶性肺结节患者和良性肺结节受试者,实现低侵袭性、低成本、高灵敏性、高特异性的检测肺结节良恶性,其检测恶性肺结节血液样本的总灵敏性可达88.1%,其中,检测实性结节的灵敏性可达88.9%,检测亚实性结节的灵敏性可达87.5%。此外,该试剂盒检测良性肺结节血液样本的特异性可达92.1%,能够降低假阴性结果的检出,检查准确度高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态,涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下,术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中,“检测”肺结节良恶性是指检测疾病的存在与否,即判断受试者是否患有恶性肺结节。
术语“受试者”是指接受观察、检测或实验的对象。一些实施例中,受试者可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)以及啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)。一些实施例中,哺乳动物可以是人。
术语“样本”或“样品”包括从任何个体(较佳地为人)或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。例如,所述样本可以包括但不限于:血液样本、组织样本(如石蜡包埋样本)、细胞样本;较佳地,所述样本包括但不限于:血液样本、血浆样本、血清样本,或其组合。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而调控基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“生物标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标,如蛋白质、DNA或RNA等。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应,PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)”是通过对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理,非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶,在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基,在反应完成时被保留;然后在非甲基化区域设计引物进行PCR扩增,将扩增得到的PCR产物进行克隆测序,将测得的序列与原始序列比对,统计甲基化位点及数量,并分析甲基化程度。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物,若Ct值满足所述要求(例如在血液样本中Ct≤45),则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应系统中,除加入甲基化检测引物以外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5'荧光基团和3'淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5'-3'核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
“结节”是一种病因未明的多系统多器官的肉芽肿性疾病,常侵犯肺、双侧肺门淋巴结、眼、皮肤等器官。肺结节的“良性”和“恶性”表示肺结节的性质,肺结节包括实性或部分实性或磨玻璃结节,一些实施例中,肺结节为实性或部分实性。“恶性”肺结节通常指具有癌变。
DNA甲基化是一种表观遗传修饰,能在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。在肿瘤的超早期,DNA甲基化异常便会发生。具体的,正常细胞中CpG岛一般是去甲基化状态,在肿瘤细胞中抑癌基因启动子区域CpG岛会被DNMT(DNA甲基转移酶)高度甲基化,从而减弱肿瘤抑制来增加肿瘤的发生。在肿瘤发生的不同阶段,DNA甲基化位点和程度存在差异,肿瘤基因总的甲基化水平降低而某些基因的启动子甲基化水平升高。由于DNA甲基化的早期变化明显,后期变化比较平稳,利用甲基化检测对肿瘤进行早期筛查具有很大应用潜力。
本发明提供了一种用于检测肺结节良恶性的引物对,其为用于检测样本中肺结节良恶性生物标志物的甲基化水平的引物对,上述肺结节良恶性生物标志物选自TPM4P1基因CpG岛上的靶区域。
一些实施例中,以GRCh38.p14为参考基因组,上述TPM4P1基因CpG岛上的靶区域选自Chr10:100115071-100115478负链的全长或部分区域。
可以理解的是,在检测Chr10:100115071-100115478负链的甲基化水平时,可以针对其全长区域进行检测,还可以针对其部分区域进行检测。
一些实施例中,上述引物对包括用于检测Chr10:100115071-100115478负链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对,上述甲基化引物对包括SEQ ID NO.4~5所示的第一甲基化引物对;和/或,SEQ ID NO.8~9所示的第二甲基化引物对。
一些实施例中,上述引物对还包括用于检测Chr10:100115071-100115478负链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对。较佳实施例中,上述非甲基化引物对包括SEQ ID NO.6~7所示的第一非甲基化引物对;和/或,SEQ ID NO.10~11所示的第二非甲基化引物对。
更佳实施例中,上述引物对包括SEQ ID NO.4~5所示的第一甲基化引物对和SEQID NO.6~7所示的第一非甲基化引物对;和/或,SEQ ID NO.8~9所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.10~11所示的第二非甲基化引物对。
需要说明的是,若一种引物对与上述第一甲基化引物对、上述第一非甲基化引物对、上述第二甲基化引物对和上述第二非甲基化引物对所示的核苷酸序列具有至少85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%等)以上的序列一致性,且该引物对同样具有一定的肺结节良恶性诊断功能(特异性或灵敏性与本申请引物对相比,相当或略有下降或略有提高或大幅提高等),也在本发明保护范围内。
本发明还提供了一种用于检测肺结节良恶性的引物探针组合,其包括上述甲基化引物对,还包括检测探针。较佳实施例中,上述检测探针包括SEQ ID NO.15所示的第一检测探针;和/或,SEQ ID NO.16所示的第二检测探针。
更佳实施例中,上述引物探针组合包括SEQ ID NO.4~5所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.15所示的第一检测探针;和/或,SEQ ID NO.8~9所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.16所示的第二检测探针。
本发明还提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒,其包括上述引物对或上述引物探针组合。
一些实施例中,上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中,上述内参基因可以为但不限于ACTB。在一个可选地具体示例中,内参基因ACTB的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12~13所示,检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他内参基因,此时,内参引物对对应设计即可。
一些实施例中,上述检测探针和上述内参基因的检测探针的5'端包含有荧光报告基团,3'端包含有荧光淬灭基团,上述各探针的荧光报告基团独立地选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种;上述各探针的荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时,不同检测探针上连接的荧光基团不同。各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。
一些实施例中,上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。本发明对甲基化转化试剂无特别限制,现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以,如肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。
一些实施例中,上述扩增试剂包括但不限于扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中,上述阳性对照是指其中包含甲基化的生物标志物,用于监测试剂盒中试剂的检测性能。上述阴性对照是指其中不包含甲基化的生物标志物,用于监测实验是否受到污染。
一些实施方式中,上述样本包括但不限于分离自受试者的器官、组织、细胞和/或体液的组合物。一些实施方式中,上述器官包括肺;上述组织包括上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织;上述细胞包括肺结节细胞;上述体液包括血液、血浆、血清、细胞外液、组织液、淋巴液等,或其组合。
基于本发明公开的内容,本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述多核苷酸分子的甲基化水平进行检测,对肺结节良恶性进行诊断,无论采用何种技术,其都是属于本发明的保护范围。上述检测样本中肺结节良恶性生物标志物的甲基化水平的方法包括但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序(BSP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了上述引物对或上述引物探针组合或上述试剂盒在制备肺结节良恶性诊断产品中的应用。
一些实施例中,上述恶性肺结节包括实性肺结节和亚实性肺结节中的至少一种。
一些实施例中,上述肺结节良恶性诊断产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。可选地,上述产品可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。需要说明的是,本发明提供的肺结节良恶性诊断产品并不限于上述所列举的试剂盒,只要能满足肺结节良恶性的诊断或辅助诊断的需求的产品均在本发明的保护范围内。
本发明还提供了上述试剂盒在检测恶性肺结节或用在检测患有恶性肺结节的风险提高、疑似患有恶性肺结节或已经患有恶性肺结节的受试者的用途。
本发明还提供了一种通过检测样本中多核苷酸分子的甲基化水平进而检测肺结节良恶性的方法,包括如下步骤:
S1、提取受试者血液样本的DNA,采用甲基化转化试剂对其进行转化,然后对转化后的DNA进行纯化;
S2、采用本发明提供的上述试剂盒进行qPCR扩增,通过MSP法检测血液样本中生物标志物的甲基化水平;
S3、基于S2的结果,进而判断待测血液样本是否为恶性肺结节。
本发明提供的上述方法能够低侵袭性地进行高灵敏性和高特异性的肺结节良恶性的诊断,由此带来早期的治疗和预后的改善,进一步地,还能够监视疾病憎恶、监视外科治疗、放射线疗法的治疗和化学疗法的治疗的有效性。应当理解的是,本申请中的肺结节的评价结果仅用于预测肺结节患者的结节良恶性,有些患者的结节具有恶性肿瘤的特征而实际可能为良性结节,反之亦然,还需要使用其他手段去综合判断。该方法的直接目的是获得中间结果以辅助医生诊断而非诊断结果。
除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过本领域已知方法制备。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。
实施例1肺结节良恶性生物标志物及检测区域的确定
收集临床确诊为恶性肺结节的癌组织样本48例、癌旁组织样本48例及健康人外周血30例作为训练集筛选特异甲基化的区域,选择组织样本的灵敏性和特异性≥85%,外周血样本的特异性≥90%的检测区域进入下一步验证。所有样本的收集过程已获得伦理委员会的审批。
本发明提供的肺结节良恶性生物标志物为分离的多核苷酸分子(SEQ ID NO.1),其位于TPM4P1基因的10号染色体负链第100115071~100115478位的碱基的片段,该多核苷酸分子的核苷酸序列中有多处甲基化的位点,发生在胞嘧啶的C-5位,产物称为5-甲基胞嘧啶(5-mC)。SEQ ID NO.1序列从5'-3'有43个甲基化位点,所有甲基化位点均已用标识出来,具体如下:
上述多核苷酸分子经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化。SEQ ID NO.1经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸包括SEQ ID NO.2(完全甲基化序列)和SEQ ID NO.3(非甲基化序列),将其应用于设计检测引物或检测试剂盒。
SEQ ID NO.2:
SEQ ID NO.3:
根据经亚硫酸氢盐处理的多核苷酸设计引物时,先输入原始的DNA序列,程序将会显示2种序列:一种是输入的原始的DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物。
对于BSP需要设计两对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化序列;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化序列。根据甲基化引物只特异性扩增甲基化的序列,非甲基化引物只特异性扩增非甲基化的序列的引物设计原则,对多核苷酸序列SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3设计引物,包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示甲基化引物对、SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示非甲基化引物对;包括SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示甲基化引物对、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示非甲基化引物对。核酸组合(SEQ ID NO.4~5和SEQ ID NO.8~9)的扩增产物包含SEQ ID NO.1中03~22号CpG位点;核酸组合(SEQ IDNO.6~7和SEQ ID NO.10~11)的扩增产物包含SEQ ID NO.1中26~39号CpG位点。
核酸组合(SEQ ID NO.4~5和SEQ ID NO.8~9)的序列(5'-3')如下:
甲基化上游引物SEQ ID NO.4:TTTTCGCGTCGTTCGTTCTC;
甲基化下游引物SEQ ID NO.5:ACGCCCGCCGCAAATG;
非甲基化上游引物SEQ ID NO.8:GCGGTTTGTGTTGTTTGTTTGT;
非甲基化下游引物SEQ ID NO.9:GGCAACACCCACCACAAACA。
核酸组合(SEQ ID NO.6~7和SEQ ID NO.10~11)的序列如下:
甲基化上游引物SEQ ID NO.6:CGGACGATAGTTGTACGGTCGC;
甲基化下游引物SEQ ID NO.7:CCGACGACAACCGAACCG;
非甲基化上游引物SEQ ID NO.10:GGCGGATGATAGTTGTATGGTTG T;
非甲基化下游引物SEQ ID NO.11:ACCCCAACAACAACCAAACCA。
焦磷酸测序法检测TPM4P1基因关键CpG位点在组织、外周血样本的甲基化状态。
1.样本DNA的提取
所述DNA样品为肺部组织样本时,采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP304)提取各样本的细胞基因组DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
2.亚硫酸氢盐转化和纯化处理
将提取好的各个样本的基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化,所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843),具体实验操作参见试剂盒说明书,转化完成后,用30μL纯化水进行洗脱。
3.PCR反应
以亚硫酸氢盐转化后的DNA为模板,加入SYBR Green PCR Mix、TPM4P1基因的甲基化引物对和非甲基化引物对进行PCR扩增,同时加入内参基因ACTB的上下游引物,上游引物为:AAGGTGGTTGGGT GGTTGTTTTG(SEQ ID NO.12),下游引物为:AATAACACCCCCACCCTGC(SEQID NO.13)。PCR反应体系、反应条件见表1、表2。
表1SYBR Green PCR反应体系
组分 | 用量(μL) |
SYBR Green PCR Mix | 17.5 |
甲基化(非甲基化)上游引物(10μM) | 0.5 |
甲基化(非甲基化)下游引物(10μM) | 0.5 |
ACTB上游引物(10μM) | 0.5 |
ACTB下游引物(10μM) | 0.5 |
模板DNA | 5 |
超纯水 | 补至50 |
表2SYBR Green PCR反应程序
4.焦磷酸测序
将PCR产物送至测序公司进行焦磷酸测序,分析测序峰图、以焦磷酸测序的关键CpG位点的甲基化状态为准。具体地,一个CpG核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种:即甲基化和未甲基化,其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化,如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶的测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T,则认为该位点是部分甲基化的。如果某一扩增子中95%以上的CpG二核苷酸位点中的C是甲基化的,则认为该样本在这一区域是甲基化的。
5.结果分析
PCR反应结束后,将扩增产物测序的结果同病理结果进行比对,计算该扩增产物的CpG位点的甲基化状态来计算此目标区域的灵敏度和特异性。灵敏性=甲基化阳性样本/病理结果为阳性的样本;特异性=甲基化阴性样本/病理结果为阴性的样本。检测结果见表3。
表3不同CpG位点在训练集的组织、外周血样本上的灵敏性和特异性
由表3可以看出,以多核苷酸序列SEQ ID NO.1作为肺结节良恶性生物标志物,其在恶性肺结节癌组织样本中的甲基化水平明显高于其在癌旁正常组织样本中的甲基化水平,且其在外周血样本中低甲基化,具备良好的特异性,特异性均大于90.0%。通过设计甲基化引物对和非甲基化引物对扩增经亚硫酸氢盐转化的模板DNA,再使用焦磷酸测序法检测多核苷酸序列的甲基化水平,可以有效区分恶性肺结节癌组织样本和癌旁正常组织样本。具体地,核酸组合1通过检测SEQ ID NO.1中03~22号CpG位点的甲基化水平检测恶性肺结节癌组织样本的灵敏性为93.8%,检测癌旁正常组织样本的特异性为85.4%;核酸组合2通过检测SEQ ID NO.1中26~39号CpG位点的甲基化水平检测恶性肺结节癌组织样本的灵敏性可达95.8%,检测癌旁正常组织样本的特异性可达87.5%。
实施例2在血液样本上检测TPM4P1基因靶区域的关键CpG位点的甲基化状态
利用焦磷酸测序的方法在30例恶性结节血液样本及30例良性结节血液样本的测试集中对筛选得到的差异甲基化位点进行评估,具体过程如下:
1.提取DNA样品
所述DNA样品为血液样本时,采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(目录号:DP709)进行血浆cfDNA提取,所用血浆体积为1.5mL,具体操作参见试剂盒说明书,提取完成后,用50μL纯化水进行洗脱。
2.亚硫酸氢盐转化和纯化处理
将提取好的各个样本的基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化,所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843),具体实验操作参见试剂盒说明书,转化完成后,用30μL纯化水进行洗脱。
3.PCR反应、焦磷酸测序、结果分析同实施例1。具体检测结果见表4。
表4不同CpG位点在测试集血液样本上的灵敏性和特异性
由表4可知,通过检测测试集血液样本中多核苷酸分子SEQ ID NO.1的甲基化状态可以区分肺结节良恶性。核酸组合1检测血液样本的灵敏性和特异性分别为83.3%和86.7%,核酸组合2检测血液样本的灵敏性和特异性分别为86.7%和90.0%。
实施例3基于qMSP法用于区分良恶性肺结节的甲基化检测试剂盒
本实施例在试验过程中对采集的样本经过编盲后,再由试验操作者进行试验,结果判读者根据判读标准,将得到的检测结果与病理结果(金标准)进行比对,考察肺结节生物标志物的临床有效性。
为了实现无创检测和进一步提高试剂盒诊断肺结节良恶性的血液样本灵敏性,本实施例共纳入207例肺结节患者,其中病理诊断明确恶性结节42例(包括实性结节18例,亚实性结节24例),良性结节165例。本研究经本院伦理委员会审核满足展开标准,且患者均签署知情同意书文件。纳入标准:肺实质内存在直径低于30mm病灶,呈现圆形或者椭圆形,不伴随有肺不张、纵隔淋巴结肿大、肺炎、胸腔积液等情况;接受胸部CT扫描结合血清学指标后确诊;体格检查、辅助检查,均无发现患者出现远处转移。排除标准:存在有直径在30mm以上的肺实质内肿块;出现远处转移;在手术前接受系统化疗干预;临床资料缺失或者信息丢失。本实施通过检测受试者血液样本中多核苷酸的甲基化水平来诊断肺结节患者。具体过程如下:
1.DNA样品提取、亚硫酸氢盐转化和纯化处理同实施例2。
2.qPCR反应
以亚硫酸氢盐转化后的多核苷酸序列为模板设计检测探针,具体甲基化引物对和探针组合见表5。用TaqMan探针法对临床样本进行TPM4P1基因的靶区域的PCR扩增。检测TPM4P1基因的单靶区域的甲基化水平时,每个PCR管中需加入反应成分、模板、TPM4P1基因的单一靶区域的甲基化引物对和检测探针,以及内参基因ACTB的检测引物对(SEQ IDNO.12~13)和检测探针(SEQ ID NO.14:5'-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-3')。若同时检测TPM4P1基因的双靶区域的甲基化水平,每个PCR管中除加入上述组分外,还需加入另一靶区域对应的甲基化引物对和检测探针。靶区域检测探针的5'端为荧光报告基团,如FAM、ROX、VIC、CY5等,其3'端为荧光淬灭基团,如TAMRA、BHQ、MGB等。本实施例中,检测探针SEQ ID NO.15:ATTCAAACCCTACCGCAACA的5'端的荧光报告基团为ROX,检测探针SEQ ID NO.16:CGACCCCGATACAAA的5'端的荧光报告基团为VIC;3'端的荧光淬灭基团均为BHQ或BHQ1,ACTB基因的检测探针5'端的荧光报告基团为FAM,3'端的荧光淬灭基团为MGB。此外还需要设置阴性和阳性对照:阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液,其它成分与实验管相同;阳性对照PCR管的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含完全甲基化的经亚硫酸氢盐转化后的靶区域的质粒等体积的混合物,其它成分也与实验管相同。qPCR反应体系见表6,qPCR反应条件见表7。
表5检测探针
核酸组合 | 检测CpG位点 | 甲基化引物对 | 检测探针 |
3 | SEQ ID NO.1中03~22号CpG位点 | SEQ ID NO.4~5 | SEQ ID NO.15 |
4 | SEQ ID NO.1中26~39号CpG位点 | SEQ ID NO.6~7 | SEQ ID NO.16 |
表6qPCR反应体系
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表7qPCR程序
qPCR反应结束后,需手动调整基线和设置合适的阈值,基线通常是3~15个循环的荧光信号,阈值置于指数扩增期内。
3.结果分析
分析qPCR反应的结果,要求①阴性对照PCR管无扩增;②阳性对照PCR管有明显的指数增长期,且阳性对照PCR管目标区域的Ct值在26~30之间;③待测样本的内参基因的Ct值小于等于34。
若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求,则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读,否则,当次实验无效,必须重新进行检测。对于血液样本,阳性判断值为45,若使用某一对甲基化引物对和检测探针进行扩增的Ct值≤45,则判定该样本在此扩增区域为甲基化阳性;若使用某一对甲基化引物对和检测探针进行扩增的Ct值>45,则判定该样本在此扩增区域为甲基化阴性。具体检测结果见表8。
表8不同CpG位点在血液样本上的验证
由表8可看出,对于血液样本,以多核苷酸分子SEQ ID NO.1作为肺结节良恶性生物标志物,仍然可以有效区分恶性肺结节患者和良性肺结节患者。核酸组合3、核酸组合4诊断恶性肺结节血液样本的总灵敏性均大于85%,检测实性结节血液样本的灵敏性分别为83.3%、88.9%,检测亚实性结节血液样本的灵敏性均为87.5%。另外,核酸组合3、核酸组合4检测良性肺结节血液样本的特异性均大于等于91.5%,检测准确度高,可有效提高恶性肺结节的检出率,降低假阴性结果的检出,避免良性肺结节的过度诊疗。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测肺结节良恶性的引物对,其特征在于,其为用于检测样本中肺结节良恶性生物标志物的甲基化水平的引物对,所述肺结节良恶性生物标志物选自TPM4P1基因CpG岛上的靶区域。
2.根据权利要求1所述的引物对,其特征在于,以GRCh38.p14为参考基因组,所述TPM4P1基因CpG岛上的靶区域选自Chr10:100115071-100115478负链的全长或部分区域。
3.根据权利要求1或2所述的引物对,其特征在于,所述引物对包括用于检测Chr10:100115071-100115478负链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对,所述甲基化引物对包括SEQ ID NO.4~5所示的第一甲基化引物对;和/或,SEQ ID NO.8~9所示的第二甲基化引物对。
4.根据权利要求3所述的引物对,其特征在于,所述引物对还包括用于检测Chr10:100115071-100115478负链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对;
所述引物对包括SEQ ID NO.4~5所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.6~7所示的第一非甲基化引物对;和/或,SEQ ID NO.8~9所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.10~11所示的第二非甲基化引物对。
5.一种用于检测肺结节良恶性的引物探针组合,其特征在于,其包括权利要求1至3任一项所述的引物对,还包括检测探针;
所述引物探针组合包括SEQ ID NO.4~5所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.15所示的第一检测探针;和/或,SEQ ID NO.8~9所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.16所示的第二检测探针。
6.一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1至4任一项所述的引物对或权利要求5所述的引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,其还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒,其特征在于,所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团,3'端包含有荧光淬灭基团。
9.权利要求1至4任一项所述的引物对或权利要求5所述的引物探针组合或权利要求6至8任一项所述的试剂盒在制备肺结节良恶性诊断产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述恶性肺结节包括实性肺结节和亚实性肺结节中的至少一种;所述肺结节良恶性诊断产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
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