CN117778573A - 一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用 - Google Patents
一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用。本发明提供了能够用于检测甲状腺癌的生物标志物，其包括ESAM基因、IL21R基因和FSCN2基因中的至少一个。本发明提供的试剂盒通过检测样本中甲状腺癌生物标志物的甲基化水平，能够有效区分甲状腺癌患者和健康人，在实现无创检测的同时，可以对甲状腺癌进行高灵敏性、高特异性检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用。
背景技术
甲状腺癌(thyroid carcinoma)是最常见的甲状腺恶性肿瘤，包括乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌四种病理类型。以恶性度较低、预后较好的乳头状癌最常见，除髓样癌外，绝大部分甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞。发病率与地区、种族、性别有一定关系。女性发病较多，男女发病比例为1:(2～4)。任何年龄均可发病，但以青壮年多见。绝大多数甲状腺癌发生于一侧甲状腺腺叶，常为单个肿瘤。
目前，由于超声影像对恶性病变诊断率不高，因此，临床上一般通过细针穿刺活检(fine needle aspiration biopsy，FNAB)鉴别甲状腺结节的性质。而良恶性甲状腺结节的临床处理不同，对患者的医疗花费和预后也有显著差异，因此在诊疗阶段具备良好的筛查手段对甲状腺结节良恶性进行准确评估，制定个性化精准治疗方案等方面都有极大的参考价值。
因此，有必要探索一种新的甲状腺癌诊断方法，近年来，液体活检技术广泛应用于癌症的诊疗和预后监测，作为一种非侵入性检查方式逐渐受到关注，其在甲状腺癌早诊中显示出了一定的潜力。所以寻找新的生物标志物用于甲状腺癌诊断试剂产品是存在需求的。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用，以改善现有技术检测甲状腺癌的手段不足，检测甲状腺癌的灵敏性、特异性低等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合，所述甲状腺癌生物标志物包括如下基因中的至少一个：ESAM基因、IL21R基因和FSCN2基因。
优选地，以GRCh38.p14为参考基因组，所述甲状腺癌生物标志物包括如下至少一个：
所述ESAM基因的chr11:124758793-124759193的全长区域或部分区域；
所述IL21R基因的chr16:27449926-27450276的全长区域或部分区域；
所述FSCN2基因的chr17:81536917-81537317的全长区域或部分区域。
优选地，所述核酸组合包括用于检测所述甲状腺癌生物标志物的甲基化水平的甲基化引物对。
优选地，所述核酸组合还包括用于检测所述甲状腺癌生物标志物甲基化水平的非甲基化引物对。
进一步优选地，所述核酸组合包括如下组合中的至少一组：
第一核酸组合，SEQ ID NO.10～11所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.12～13所示的第一非甲基化引物对；
第二核酸组合，SEQ ID NO.14～15所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.16～17所示的第二非甲基化引物对；
第三核酸组合，SEQ ID NO.18～19所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.20～21所示的第三非甲基化引物对；
第四核酸组合，SEQ ID NO.22～23所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.24～25所示的第四非甲基化引物对。
优选地，所述核酸组合还包括检测探针。
进一步优选地，所述核酸组合包括如下组合中的至少一组：
第五核酸组合，SEQ ID NO.14～15所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.29所示的第一检测探针；
第六核酸组合，SEQ ID NO.18～19所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.30所示的第二检测探针。
优选地，所述检测探针的5'端含有荧光报告基团，3'端含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种用于检测甲状腺癌生物标志物的试剂盒，其包括所述核酸组合。
优选地，所述试剂盒还包括内参基因的上下游引物及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
本发明还提供了所述核酸组合或所述试剂盒在制备甲状腺癌诊断产品中的应用。
优选地，所述甲状腺癌诊断产品包括引物、探针、试剂盒、芯片、测序文库、膜条和蛋白阵列中的至少一种。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒，通过检测样本中甲状腺癌生物标志物的甲基化水平，能够对甲状腺癌进行高灵敏性、高特异性检测。上述试剂盒检测甲状腺癌血液样本的灵敏性可达87.8％，检测健康人血液样本的特异性可达95.4％。
(2)本发明提供了能够用于检测甲状腺癌的生物标志物，包括ESAM基因、IL21R基因和FSCN2基因中的至少一个，根据上述生物标志物的甲基化信息，能够有效区分甲状腺癌患者和健康人，在实现无创检测的同时，提高甲状腺癌的检测灵敏性和特异性。优选实施例中，本发明提供的试剂盒通过检测IL21R基因(区域2)和/或FSCN2基因(区域3)组合的甲基化水平，检测甲状腺癌血液样本的灵敏性可达87.8％。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中，“检测”甲状腺癌是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有甲状腺癌。
术语“受试者”是指接受观察、检测或实验的对象。一些实施例中，受试者可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。一些实施例中，哺乳动物可以是人。
术语“样本”或“样品”包括从任何个体(较佳地为人)或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。例如，所述样本可以包括但不限于：血液样本、组织样本(如石蜡包埋样本)、细胞样本；较佳地，所述样本包括但不限于：血液样本、血浆样本、血清样本，或其组合。
术语“生物标志物”或“标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，如蛋白质、DNA或RNA等，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应，PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“硫化测序(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)”是通过对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶，在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基，在反应完成时被保留；然后在非甲基化区域设计引物进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物进行克隆测序，将测得的序列与原始序列比对，统计甲基化位点及数量，并分析甲基化程度。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在血浆样本中Ct≤45)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5'荧光报告基团和3'荧光淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光报告基团附近存在荧光淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5'-3'核酸外切酶活性会消化探针，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
本发明提供了一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合，上述甲状腺癌生物标志物包括如下基因中的至少一个：ESAM基因、IL21R基因和FSCN2基因。
一些实施例中，上述甲状腺癌生物标志物包括IL21R基因和/或FSCN2基因。
一些实施例中，以GRCh38.p14为参考基因组，所述甲状腺癌生物标志物包括如下至少一个：
上述ESAM基因的chr11:124758793-124759193的全长区域或部分区域；
上述IL21R基因的chr16:27449926-27450276的全长区域或部分区域；
上述FSCN2基因的chr17:81536917-81537317的全长区域或部分区域。
一些实施例中，上述chr17:81536917-81537317的部分区域包括Chr17:81537117-81537211和Chr17:81537217-81537287中的至少一个。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测上述甲状腺癌生物标志物的甲基化水平的甲基化引物对。
一些实施例中，上述甲基化引物对包括用于检测ESAM基因、IL21R基因和FSCN2基因中的至少一个的甲基化水平的甲基化引物对。
一些实施例中，上述甲基化引物对包括用于检测chr11:124758793-124759193、chr16:27449926-27450276和chr17:81536917-81537317中至少一个区域的甲基化水平的甲基化引物对。可以理解的是，在检测上述chr11:124758793-124759193、chr16:27449926-27450276、chr17:81536917-81537317的甲基化水平时，可以对其全长区域进行检测，还可以对其部分区域进行检测。
一些实施例中，上述chr17:81536917-81537317的部分区域包括Chr17:81537117-81537211和Chr17:81537217-81537287中的至少一个。
较佳实施例中，上述甲基化引物对包括如下至少一组：
用于检测chr11:124758793-124759193的甲基化水平的第一甲基化引物对；用于检测chr16:27449926-27450276的甲基化水平的第二甲基化引物对；用于检测Chr17:81537117-81537211的甲基化水平的第三甲基化引物对；用于检测Chr17:81537217-81537287的甲基化水平的第四甲基化引物对。
一些实施例中，上述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示；上述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示；上述第三甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18～19所示；上述第四甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.22～23所示。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测上述甲状腺癌生物标志物的甲基化水平的非甲基化引物对。
一些实施例中，上述非甲基化引物对包括用于检测ESAM基因、IL21R基因和FSCN2基因中的至少一个的甲基化水平的非甲基化引物对。
较佳实施例中，上述非甲基化引物对包括用于检测chr11:124758793-124759193、chr16:27449926-27450276和chr17:81536917-81537317中至少一个区域的甲基化水平的非甲基化引物对。可以理解的是，在检测上述chr11:124758793-124759193、chr16:27449926-27450276、chr17:81536917-81537317的甲基化水平时，可以对其全长区域进行检测，还可以对其部分区域进行检测。
一些实施例中，上述chr17:81536917-81537317的部分区域包括Chr17:81537117-81537211和Chr17:81537217-81537287中的至少一个。
更佳实施例中，上述非甲基化引物对包括如下至少一组：
用于检测chr11:124758793-124759193的甲基化水平的第一非甲基化引物对；用于检测chr16:27449926-27450276的甲基化水平的第二非甲基化引物对；用于检测Chr17:81537117-81537211的甲基化水平的第三非甲基化引物对；用于检测Chr17:81537217-81537287的甲基化水平的第四非甲基化引物对。
在本发明具体实施例中，上述核酸组合包括如下组合中的至少一组：
第一核酸组合，SEQ ID NO.10～11所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.12～13所示的第一非甲基化引物对；
第二核酸组合，SEQ ID NO.14～15所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.16～17所示的第二非甲基化引物对；
第三核酸组合，SEQ ID NO.18～19所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.20～21所示的第三非甲基化引物对；
第四核酸组合，SEQ ID NO.22～23所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.24～25所示的第四非甲基化引物对。
需要说明的是，若一种引物对与上述甲基化引物对、上述非甲基化引物对所示的核苷酸序列具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的甲状腺癌诊断功能(特异性或灵敏性与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
一些实施例中，上述核酸组合还包括检测探针。
较佳实施例中，上述检测探针包括靶向chr16:27449926-27450276的第一检测探针，和/或，靶向Chr17:81537117-81537211的第二检测探针。
更佳实施例中，上述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，上述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
在本发明具体实施例中，上述核酸组合包括如下组合中的至少一组：
第五核酸组合，SEQ ID NO.14～15所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.29所示的第一检测探针；
第六核酸组合，SEQ ID NO.18～19所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.30所示的第二检测探针。
本发明还提供了一种用于检测甲状腺癌生物标志的试剂盒，其包括上述核酸组合。
一些实施例中，上述试剂盒还包括内参基因的上下游引物及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中，上述内参基因可以为但不限于ACTB。在一个可选地具体示例中，内参基因ACTB的上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.26～27所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.28。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他内参基因，此时，内参引物对对应设计即可。
一些实施例中，上述第一检测探针、上述第二检测探针、上述内参基因的检测探针的5'端均含有荧光报告基团，3'端均含有荧光淬灭基团。上述各检测探针的荧光报告基团独立地选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种；上述各检测探针的荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时，不同检测探针上连接的荧光基团不同。各检测探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。
一些实施例中，上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。本发明对甲基化转化试剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重亚硫酸盐(例如重硫酸钠、重硫酸钾、重硫酸铵)和亚硫酸氢盐(例如亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。
一些实施例中，上述扩增试剂包括但不限于扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中，上述阳性对照是指其中包含甲基化的甲状腺癌生物标志物，用于监测试剂盒的检测性能。上述阴性对照是指其中不包含甲基化的甲状腺癌生物标志物，用于监测实验是否受到污染。
一些实施例中，上述试剂盒还包括用于容纳受试者生物样品的容器。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由各种材料制成，例如玻璃或塑料。一些实施方式中，上述试剂盒还包括使用和解释检测结果的说明。
一些实施例中，上述样本包括但不限于通过本领域技术人员已知的任何方法获得的个体的细胞、组织、器官和/或生物体液。一些实施方式中，上述样本选自下组：组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、手术切除样本、分离的血细胞、分离自血液的细胞，及其任意组合。一些实施方式中，上述体液选自下组：全血、血清、血浆，及其任意组合。
本发明对检测样本中上述甲状腺癌生物标志物的甲基化水平的方法不作特殊限定，所用方法可以是但不限于硫化测序PCR(BSP)、甲基化特异性PCR(qMSP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、甲基化CpG岛扩增(MCA)、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)、甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了一种通过检测样本中甲状腺癌生物标志物的甲基化水平进而检测甲状腺癌的方法，包括如下步骤：采集受试者外周血，分离血浆或血清，抽取血浆样本中游离DNA，采用甲基化转化试剂对其进行转化，然后对转化后的DNA进行纯化，并采用本发明提供的上述检测试剂盒进行qPCR扩增，通过qMSP法检测样本中甲状腺癌生物标志物的甲基化水平，从而判断待测血浆样本是否为甲状腺癌。
本发明还提供了上述核酸组合或上述试剂盒在制备甲状腺癌诊断产品中的应用。
一些实施例中，上述诊断包括但不限于甲状腺癌的鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、甲状腺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。其中，上述甲状腺癌的鉴别诊断具体可以是用于确认个体是否患有甲状腺癌或者更加有可能患有甲状腺癌；上述微小病灶残留评估及动态监测具体可以是用于确认个体中是否残留微小病灶；上述甲状腺癌复发及预后的辅助判断是指甲状腺癌复发的风险和预后情况预测，具体可以是用于确认个体甲状腺癌复发的可能性或恶化倾向，可用于指导临床诊疗；上述药物疗效评耐药监测具体可以是用于确认某种药物或治疗手段是否对个体有效。
一些实施例中，上述甲状腺癌诊断产品包括引物、探针、试剂盒、芯片、测序文库、膜条和蛋白阵列中的至少一种。可选地，上述产品可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等形态。
本申请的发明人发现，ESAM基因、IL21R基因和FSCN2基因在甲状腺癌组织样本中的甲基化水平明显高于其在癌旁正常组织样本中的甲基化水平，能够作为用于检测甲状腺癌的生物标志物。因此，本申请提供了一种通过检测样本中上述甲状腺癌生物标志物的甲基化状态对甲状腺癌进行诊断的核酸组合、试剂盒和方法，能够无创、准确地评估甲状腺癌。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1甲状腺癌生物标志物及检测区域的确定
收集临床确诊为甲状腺癌的癌组织样本50例、癌旁组织样本50例及健康人外周血50例作为训练集筛选特异甲基化的区域，选择检测组织样本的灵敏性、特异性均≥80％，检测外周血样本的特异性≥90％的区域进入下一步验证。所有样本的收集过程已获得伦理委员会的审批。
以GRCh38.p14为参考基因组，本发明提供的甲状腺癌生物标志物为分离的多核苷酸分子，上述多核苷酸分子包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO.1的物理位置为ESAM基因chr11:124758793-124759193负链，SEQ IDNO.2的物理位置为IL21R基因chr16:27449926-27450276负链，SEQ ID NO.3的物理位置为FSCN2基因chr17:81536917-81537317负链。
多核苷酸分子SEQ ID NO.1～3经亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐处理后，DNA双链中的“C”转化为“U”，通过随后的PCR，将“U”转化为“T”，但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化(见表1)。
表1SEQ ID NO.1～3经亚硫酸氢盐处理后的序列
根据上述经亚硫酸氢盐处理后的多核苷酸分子设计引物，对于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR，BSP)需要设计两对引物，一对是针对于经亚硫酸氢盐处理后的甲基化序列(完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列)；另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理后的非甲基化序列(完全未甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列)。根据甲基化引物对只特异性扩增甲基化序列，非甲基化引物对只特异性扩增非甲基化序列的引物设计原则，分别设计各个生物标志物特异性的甲基化引物对和非甲基化引物对(见表2)。对分离自ESAM基因的SEQ ID NO.1设计的第一核酸组合，其扩增的区域为Chr11:124759011-124759114(区域1)；对分离自IL21R基因的SEQ ID NO.2设计的第二核酸组合，其扩增的区域为Chr16:27449974-27450064(区域2)；对分离自FSCN2基因的SEQ ID NO.3设计的第三核酸组合和第四核酸组合，其扩增的区域分别为Chr17:81537117-81537211(区域3)、Chr17:81537217-81537287(区域4)。
表2甲基化引物对和非甲基化引物对的核苷酸序列
基于上述设计的引物对和焦磷酸测序法检测基因ESAM、IL21R和FSCN2在甲状腺癌组织样本、癌旁正常组织样本、外周血样本的甲基化状态，具体步骤如下：
1)样本DNA的提取
DNA样品为甲状腺癌组织、癌旁正常组织和外周血时，采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP304)提取各样本的细胞基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
2)亚硫酸氢盐转化和纯化处理
将提取好的各个样本的基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843)，具体操作参见试剂盒说明书。
3)PCR反应
以经亚硫酸氢盐转化后的多核苷酸分子为模板，加入SYBR Green PCR Mix、甲状腺癌甲基化生物标志物(SFRS1基因的靶区域、ST3GAL6基因的靶区域)的甲基化引物对和非甲基化引物对进行PCR扩增，同时加入内参基因ACTB的上下游引物，上游引物为：5'-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3'(SEQ ID NO.26)，下游引物为：5'-AATAACACCCCCACCCTGC-3'(SEQ ID NO.27)。PCR反应体系、反应条件见表3、表4。
表3SYBR Green PCR反应体系
| 组分 | 用量(μL) |
| SYBR Green PCR Mix | 17.5 |
| 甲基化(非甲基化)上游引物(10μM) | 0.5 |
| 甲基化(非甲基化)下游引物(10μM) | 0.5 |
| ACTB上游引物(10μM) | 0.5 |
| ACTB下游引物(10μM) | 0.5 |
| 模板DNA | 4 |
| 超纯水 | 补至25 |
表4SYBR Green PCR反应程序
4)焦磷酸测序
将PCR产物送至测序公司进行焦磷酸测序，分析测序峰图、以焦磷酸测序的关键CpG位点的甲基化状态为准。具体地，一个CpG核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种：即甲基化和未甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化，如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶的测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T，则认为该位点是部分甲基化的。如果某一扩增子中95％以上的CpG二核苷酸位点中的C是甲基化的，则认为该样本在这一区域是甲基化的。
5)结果分析
PCR反应结束后，将扩增产物测序的结果同病理结果进行比对，计算该扩增产物的CpG位点的甲基化状态来计算此靶区域的灵敏性和特异性。灵敏性＝甲基化阳性样本/病理结果为阳性的样本；特异性＝甲基化阴性样本/病理结果为阴性的样本。检测结果见表5。
表5生物标志物在训练集上的灵敏性和特异性
由表5可以看出，ESAM基因、IL21R基因和FSCN2基因作为甲状腺癌生物标志物，其在甲状腺癌组织样本中的甲基化水平明显高于其在癌旁正常组织样本中的甲基化水平。根据上述初步筛选标准，第一核酸组合通过检测ESAM基因中区域1的甲基化水平，检测外周血样本的特异性不满足要求，故剔除区域1。IL21R基因中区域2和FSCN2基因中区域3、区域4可进入下一步验证。
实施例2在测试集上检测IL21R基因和FSCN2基因的甲基化状态
利用焦磷酸测序的方法在38例甲状腺癌患者的血液样本及38例健康人血液样本的测试集中对筛选得到的差异甲基化位点进行评估，具体过程如下：
1)提取DNA样品
DNA样品为血液样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(目录号：DP709)进行血浆cfDNA提取，所用血浆体积为1.5mL，具体操作参见试剂盒说明书，提取完成后，用50μL纯化水进行洗脱。
2)亚硫酸氢盐转化和纯化处理
将提取好的各个样本的基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书，转化完成后，用30μL纯化水进行洗脱。
3)PCR反应、焦磷酸测序、结果分析同实施例1。检测结果见表6。
表6生物标志物在测试集上的灵敏性和特异性
由表6可知，在测试集中，通过检测IL21R基因中区域2和FSCN2基因中区域3、区域4的甲基化状态可以区分甲状腺癌样本和健康样本。其中，第二核酸组合通过检测IL21R基因中区域2的甲基化水平检测血液样本的灵敏性和特异性分别为81.6％和94.7％，第三核酸组合通过检测FSCN2基因中区域3的甲基化水平检测血液样本的灵敏性和特异性分别为84.2％和92.1％，第四核酸组合通过检测FSCN2基因中区域4的甲基化水平检测血液样本的灵敏性和特异性分别为78.9％和86.8％。综合来看，选择IL21R基因中区域2和FSCN2基因中区域3进入后续临床样本的验证。
实施例3基于qMSP法检测甲状腺癌血液样本的检测试剂盒
本实施例在试验过程中对采集的样本经过编盲后，再由试验操作者进行试验，结果判读者根据判读标准，将得到的检测结果与病理结果(金标准)进行比对，考察甲状腺癌甲基化生物标志物的临床有效性。
为了实现无创检测和进一步提高试剂盒诊断甲状腺癌血液样本的灵敏性，本实施例共纳入151例健康人血液样本，49例甲状腺癌患者血液样本。本研究经本院伦理委员会审核满足展开标准，且患者均签署知情同意书文件。本实施例通过检测受试者血液样本中IL21R基因的区域2和/或FSCN2基因的区域3的甲基化水平来诊断甲状腺癌患者。具体过程如下：
1)DNA样品提取、亚硫酸氢盐转化和纯化处理同实施例2。
2)qPCR反应
以亚硫酸氢盐转化后的多核苷酸序列为模板设计检测探针(见表7)，用TaqMan探针法对临床样本进行区域2、区域3的PCR扩增。检测IL21基因中区域2或FSCN2基因中区域3的单一区域的甲基化水平时，每个PCR管中需加入反应成分、模板、区域2或区域3的甲基化引物对和检测探针，以及内参基因ACTB的检测引物对(SEQ ID NO.26～27)和检测探针(SEQID NO.28：5'-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-3')。若同时检测区域2和区域3组合的甲基化水平，每个PCR管中除加入上述组分外，还需加入另一区域对应的甲基化引物对和检测探针。此外还需要设置阴性和阳性对照：阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液，其它成分与实验管相同；阳性对照PCR管的模板为103copies/μL含完全甲基化且亚硫酸氢盐转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含转化后靶区域的质粒等体积的混合物，其它成分也与实验管相同。上述检测探针均为TaqMan探针，其5'端为荧光报告基团，如FAM、ROX、VIC、CY5等；3'端为荧光淬灭基团，如TAMRA、BHQ、BHQ1、MGB等。本实施例中，检测探针SEQ ID NO.29和检测探针SEQ IDNO.30的5'端的荧光报告基团分别为ROX、VIC，3'端的荧光淬灭基团均为BHQ或BHQ1，ACTB基因的检测探针5'端的荧光报告基团为FAM，3'端的荧光淬灭基团为MGB。qPCR反应体系见表8，qPCR反应条件见表9。
表7生物标志物的甲基化引物对和检测探针的核苷酸序列
表8qPCR反应体系
| 组分 | 规格 | 体积(μL) |
| Platinum IIPCR缓冲液 | 5× | 5 |
| dNTPs | 各2.5mM | 3 |
| 每一区域的甲基化上游引物 | 10μM | 0.5 |
| 每一区域的甲基化下游引物 | 10μM | 0.5 |
| 每一区域的检测探针 | 10μM | 0.5 |
| ACTB基因的上游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB基因的下游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB基因的检测探针 | 10μM | 0.5 |
| DNA聚合酶 | / | 0.5 |
| 待测样本DNA | / | 5 |
| 纯化水 | / | 补至25 |
表9qPCR程序
qPCR反应结束后，需手动调整基线和设置合适的阈值，基线通常是3～15个循环的荧光信号，阈值置于指数扩增期内。
3)结果分析
分析qPCR反应的结果，要求①阴性对照PCR管无扩增；②阳性对照PCR管有明显的指数增长期，且阳性对照PCR管目标区域的Ct值在26～30之间；③待测样本的内参基因的Ct值小于等于34。
若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求，则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读，否则，当次实验无效，必须重新进行检测。对于血液样本，阳性判断值为45，若使用某一对甲基化引物对和检测探针进行扩增的Ct值≤45，则判定该样本在此扩增区域为甲基化阳性；若使用某一对甲基化引物对和检测探针进行扩增的Ct值＞45，则判定该样本在此扩增区域为甲基化阴性。在检测区域2和区域3组合时，若待测样本中区域2或区域3中至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为甲状腺癌阳性样本，仅当待测样本中区域2和区域3均为甲基化阴性，则该样本为甲状腺癌阴性样本。检测结果见表10。
表10生物标志物在临床血液样本上的验证
由表10可看出，对于临床血液样本，通过qMSP法检测血液样本中IL21R基因中区域2、FSCN2基因中区域3的甲基化水平进而诊断甲状腺癌的性能良好。第五核酸组合通过检测IL21R基因中区域2的甲基化水平检测甲状腺癌血液样本的灵敏性为83.7％，检测健康人血液样本特异性为95.4％。第六核酸组合通过检测FSCN2基因中区域3的甲基化水平检测甲状腺癌样本的灵敏性为85.7％，检测健康人血液样本特异性为92.7％。通过检测区域2和区域3组合的甲基化水平检测甲状腺癌血液样本的灵敏度为87.8％，相较于单一区域2、区域3均有提升；通过检测区域2和区域3组合的甲基化水平检测健康人血液样本的特异性为92.1％，略低于单一区域2、区域3，仍处于较高水平。
综上，本发明提供的试剂盒通过检测样本中上述生物标志物的甲基化水平，可以对甲状腺癌进行高灵敏性、高特异性检测，能够对甲状腺癌进行临床医学的辅助诊断。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合，其特征在于，所述甲状腺癌生物标志物包括如下基因中的至少一个：ESAM基因、IL21R基因和FSCN2基因。
2.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，以GRCh38.p14为参考基因组，所述甲状腺癌生物标志物包括如下至少一个：
所述ESAM基因的chr11:124758793-124759193的全长区域或部分区域；
所述IL21R基因的chr16:27449926-27450276的全长区域或部分区域；
所述FSCN2基因的chr17:81536917-81537317的全长区域或部分区域。
3.根据权利要求1或2所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括用于检测所述甲状腺癌生物标志物的甲基化水平的甲基化引物对。
4.根据权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括用于检测所述甲状腺癌生物标志物甲基化水平的非甲基化引物对；
所述核酸组合包括如下组合中的至少一组：
第一核酸组合，SEQ ID NO.10～11所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.12～13所示的第一非甲基化引物对；
第二核酸组合，SEQ ID NO.14～15所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.16～17所示的第二非甲基化引物对；
第三核酸组合，SEQ ID NO.18～19所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.20～21所示的第三非甲基化引物对；
第四核酸组合，SEQ ID NO.22～23所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.24～25所示的第四非甲基化引物对。
5.根据权利要求3所述的核酸组合，其特性在于，所述核酸组合还包括检测探针；
所述核酸组合包括如下组合中的至少一组：
第五核酸组合，SEQ ID NO.14～15所示的第二甲基化引物对和SEQ IDNO.29所示的第一检测探针；
第六核酸组合，SEQ ID NO.18～19所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.30所示的第二检测探针。
6.根据权利要求5所述的核酸组合，其特征在于，所述检测探针的5'端含有荧光报告基团，3'端含有荧光淬灭基团。
7.一种用于检测甲状腺癌生物标志物的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1至6任一项所述的核酸组合。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括内参基因的上下游引物及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
9.权利要求1至6任一项所述的核酸组合或权利要求7或8所述的试剂盒在制备甲状腺癌诊断产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述甲状腺癌诊断产品包括引物、探针、试剂盒、芯片、测序文库、膜条和蛋白阵列中的至少一种。
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