CN116179698A - 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用 - Google Patents

检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用 Download PDF

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CN116179698A CN202211536064.4A CN202211536064A CN116179698A CN 116179698 A CN116179698 A CN 116179698A CN 202211536064 A CN202211536064 A CN 202211536064A CN 116179698 A CN116179698 A CN 116179698A
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苏雅婷
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王方媛
张良禄
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Abstract

本发明涉及一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用；目标区域包括区域1或者区域1的部分区域，或/和，区域2或者区域2的部分区域；以GRCh38.p14为参考，区域1为Chr6:27679636‑27680274正链，区域2为Chr6:10390489‑10390886正链。本申请以这些区域为目标区域，通过检测这些目标区域或其部分区域的甲基化水平，进而有效区分健康人、子宫内膜良性病变患者和子宫内膜癌症患者。并且，本申请对其他子宫恶性肿瘤(例如宫颈癌)的检出率不高，适用于宫颈脱离细胞样本，能够实现子宫内膜癌的简单、快捷、微创检测，灵敏度高，特异性强。

Description

检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产 品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
背景技术
子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。近年来，子宫内膜癌的发病率在全球范围内呈现逐年上升的趋势，且患者年龄愈来愈年轻化。据统计，在2018年，全球有超过38万的子宫内膜癌新发病例，有89929例的死亡病例。子宫内膜癌发病率的增加部分归因于与其发生和发展相关的危险因素的流行率的上升，如肥胖、糖尿病、高血压等。
子宫内膜癌通常分为2种类型，即Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型是最常见的形式，Ⅰ型癌症患者在所有子宫内膜癌患者中的比例约为70％，Ⅰ型子宫内膜癌的发生与无孕激素拮抗的雌激素持续刺激相关，Ⅰ型癌症也被称为子宫内膜腺癌，且这种类型的癌症通常是低级别的。Ⅱ型癌症通常是高级别的，主要包括乳头状浆液性癌和透明细胞癌，Ⅱ型癌症预后较差，复发和转移的风险较高。Ⅱ型子宫内膜癌患者在所有子宫内膜癌患者中的比例约10％，但是Ⅱ型癌症与40％的子宫内膜癌死亡病例相关。子宫内膜增生是子宫内膜癌的前体病变，1％～3％的子宫内膜增生患者有癌变的风险，这其中非典型性增生患者比单纯增生或复杂性增生患者具有更高的癌变风险，约有30％～40％的非典型性子宫内膜增生患者伴随有子宫内膜腺癌。
通常情况下，子宫内膜癌的患者在确诊前会出现非正常的阴道出血症状，这为癌症的早期诊断和治愈性治疗提供的宝贵的机会。但是，很多妇科疾病，如阴道炎、盆腔炎、子宫内膜息肉、子宫肌瘤、子宫腺肌症、子宫内膜萎缩等也会导致非正常的阴道出血，因此，在确诊前的诊断过程中，这些患者需要接受较多的检查并承受巨大的心理压力。常用的诊断子宫内膜癌的方法为阴道超声法，但是在患者发生子宫腺肌症、多发性子宫肌瘤、子宫内膜息肉或既往的子宫手术的条件下，阴道超声诊断的性能会大打折扣，即常规的影像学方法难以区分子宫良性疾病和子宫内膜癌。此时，通常会对患者进行子宫内膜活检以判断其是否为子宫内膜癌患者，但是子宫内膜活检受取样的限制较大，且为有创操作。
因此，有必要开发一种分子诊断试剂，能够有效区分子宫内膜癌患者或子宫良性病变患者，从而妥善诊断非正常阴道出血的患者，以减轻患者的心理压力，避免对良性疾病患者进行过度诊疗。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请实施例的目的之一包括将检测目标区域(Chr6:27679636-27680274、Chr6:10390489-10390886或者它们的部分片段)的甲基化水平的试剂用于制备子宫内膜癌诊断产品，以将子宫内膜癌患者与子宫良性病变患者有效区分，实现子宫内膜癌的微创诊断。
在本申请的第一方面，提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用；
所述目标区域包括：区域1或者区域1的部分区域，或/和，区域2或者区域2的部分区域；
以GRCh38.p14为参考，
区域1为Chr6:27679636-27680274正链，
区域2为Chr6:10390489-10390886正链。
在其中一些实施例方式中，所述区域1的部分区域选自如下定义的区域1-1、区域1-2和区域1-3中的一个或者多个：区域1-1为Chr6:27679695-27679811、区域1-2为Chr6:27679919-27680065和区域1-3为Chr6:27680099-27680254；
或/和，
所述区域2的部分区域选自如下定义的区域2-1、区域2-2和区域2-3中的一个或者多个：区域2-1为Chr6:10390551-10390673、区域2-2为Chr6:10390668-10390804和区域2-3为Chr6:10390758-10390876。
在其中一些实施例方式中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量PCR法。
在其中一些实施例方式中，所述试剂包括用于检测目标区域的甲基化水平的核酸组合。
在其中一些实施例方式中，所述核酸组合通过所述亚硫酸氢盐测序法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对；
在其中一些实施例方式中，用于检测所述区域1甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的检测引物对，或/和，用于检测所述区域2甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的检测引物对。
在其中一些实施例方式中，所述核酸组合通过所述甲基化特异性荧光定量PCR法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对以及检测探针。
在其中一些实施例方式中，用于检测所述区域1-1甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.13所示的检测探针；用于检测所述区域1-2甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.14和SEQ IDNo.15所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.16所示的检测探针；用于检测所述区域1-3甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.19所示的检测探针；用于检测所述区域2-1甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.22所示的检测探针；用于检测所述区域2-2甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.23和SEQ IDNo.24所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.25所示的检测探针；或/和，用于检测所述区域2-3甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.28所示的检测探针。
在其中一些实施例方式中，检测的样本类型包括细胞样本、血液样本或者组织样本。
在本申请的第二方面，提供一种子宫内膜癌诊断试剂盒，包括第一方面中所定义的试剂。
在其中一些实施例方式中，所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、质控品、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、DNA提取试剂和DNA纯化试剂中的一种或者多种。
在其中一些实施例方式中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请的发明人发现子宫内膜良性疾病和子宫内膜癌中Chr6:27679636-27680274、Chr6:10390489-10390886区域的甲基化状态截然不同，基于该发现，发明人以这些区域为目标区域，通过检测这些目标区域或其部分区域的甲基化水平，进而有效区分健康人、子宫内膜良性病变患者和子宫内膜癌症患者。并且，本申请对其他子宫恶性肿瘤(例如宫颈癌)的检出率不高，适用于宫颈脱离细胞样本，能够实现子宫内膜癌的简单、快捷、微创检测，灵敏度高，特异性强。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本申请所使用的术语“和/或”、“或/和”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A和/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，B，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。“以上”包括本数，比如“两种以上”包括两种、三种或更多种。
本申请中，“至少一者”、“至少一种”是指可以是所列项目中的任一项，或者是其中任意两种以上的组合。
本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。可以理解，本文中被检测基因的目标区域是包括至少一个CpG二核苷酸(CG)的DNA序列。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，将一个甲基基团转移到胞嘧啶碱基的第5位碳原子上。肿瘤抑制基因启动子区域DNA的甲基化是癌变过程中的重要事件，异常的DNA甲基化通常发生在癌症的早期且稳定存在。DNA的异常甲基化通常导致抑癌基因失活和癌基因的激活。鉴于此，发生甲基化改变的基因可以作为诊断癌变或癌前病变的分子标记物，具有一定的诊断价值。在进行癌症阴、阳性的判定过程中，筛选到合适的分子标记物并对其进行甲基化检测是非常关键的。
本申请的第一方面
本申请提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用；
所述目标区域包括：区域1或者区域1的部分区域，或/和，区域2或者区域2的部分区域；
以GRCh38.p14为参考，
区域1为Chr6:27679636-27680274正链，
区域2为Chr6:10390489-10390886正链。
可选地，所述目标区域为区域1或者区域1和区域2的组合。进一步地，所述目标区域为区域1和区域2的组合，区域1和区域2联合诊断早期子宫内膜癌的灵敏度高。
可选地，所述区域1的部分区域选自如下定义的区域1-1、区域1-2和区域1-3中的一个或者多个：区域1-1为Chr6:27679695-27679811、区域1-2为Chr6:27679919-27680065和区域1-3为Chr6:27680099-27680254；可选地，所述区域1的部分区域为区域1-2和区域1-3，进一步地，所述区域1的部分区域为区域1-2；
或/和，
所述区域2的部分区域选自如下定义的区域2-1、区域2-2和区域2-3中的一个或者多个：区域2-1为Chr6:10390551-10390673、区域2-2为Chr6:10390668-10390804和区域2-3为Chr6:10390758-10390876；可选地，所述区域2的部分区域为区域2-2和区域2-3，进一步地，所述区域2的部分区域为区域2-2。
可选地，所述目标区域为区域1-1和区域2-1的组合，区域1-1和区域2-2的组合、区域1-1和区域2-3的组合、区域1-2和区域2-1的组合，区域1-2和区域2-2的组合、区域1-2和区域2-3的组合、区域1-3和区域2-1的组合，区域1-3和区域2-2的组合、区域1-3和区域2-3的组合。可选地，所述目标区域为区域1-2和区域2-1的组合、区域1-2和区域2-2的组合、区域1-2和区域2-3的组合、区域1-3和区域2-2的组合、区域1-3和区域2-3的组合。
可选地，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量PCR法。
可选地，所述试剂包括用于检测目标区域的甲基化水平的核酸组合。
可选地，所述核酸组合通过所述亚硫酸氢盐测序法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对；
可选地，用于检测所述区域1甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的检测引物对，或/和，用于检测所述区域2甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的检测引物对。
可选地，所述核酸组合通过所述甲基化特异性荧光定量PCR法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对以及检测探针。
可选地，用于检测所述区域1-1甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.13所示的检测探针；用于检测所述区域1-2甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.16所示的检测探针；用于检测所述区域1-3甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.19所示的检测探针；用于检测所述区域2-1甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.20和SEQID No.21所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.22所示的检测探针；用于检测所述区域2-2甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.25所示的检测探针；或/和，用于检测所述区域2-3甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.28所示的检测探针。
可选地，检测的样本类型包括细胞样本、血液样本或者组织样本。
本申请的第二方面
本申请提供一种子宫内膜癌诊断试剂盒，包括第一方面中所定义的试剂。
可选地，所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、质控品、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、DNA提取试剂和DNA纯化试剂中的一种或者多种。
可选地，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1、亚硫酸氢盐测序法检测组织样本中目标区域的甲基化水平
本实施例采用亚硫酸氢盐测序法分析子宫内膜癌组织样本和子宫内膜良性疾病组织样本中目标区域1和区域2的甲基化状态，发现在子宫内膜良性疾病和癌症情况下目标区域的甲基化状态截然不同，进而认为可以根据待测样本中目标区域1和目标区域2的甲基化状态来区分子宫内膜良性和恶性疾病。具体实验过程如下：
1.样本收集
本实施例收集了经组织病理活检确诊为子宫内膜癌患者的癌组织样本和配对的癌旁正常组织样本，包括76例子宫内膜癌组织样本和46例子宫内膜癌旁正常组织样本，且所述患者在确诊之前未经历任何癌症相关的治疗；此外，本实施例收集了98例经组织病理活检确诊为良性疾病患者的子宫内膜组织样本，这些良性疾病包括：子宫内膜息肉、子宫肌瘤、子宫腺肌症等。所有的组织样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有组织样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者签署了知情同意书，所有组织样本采用匿名化处理。
2.样本中模板DNA的提取
对于组织样本，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.亚硫酸氢盐转化
将提取好的样本基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化和转化后的纯化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.PCR扩增及测序
分别以区域1(Chr6:27679636-27680274)和区域2(Chr6:10390489-10390886)为目标区域，根据转化后的DNA序列设计兼并引物对，兼并引物对中不含CG二核苷酸位点，因此，亚硫酸氢盐的处理不影响兼并引物对对模板的扩增，其既可以以甲基化片段作为模板进行扩增，也可以以非甲基化片段作为模板进行扩增。区域1和区域2的原始DNA序列、完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化的序列以及完全未甲基化且经亚硫酸氢盐转化的序列如表1所示。
区域1和区域2的兼并引物对的序列如表2所示。
人工合成兼并引物对后，按照表3的配方配置PCR反应体系，PCR扩增程序见表4，在PCR扩增结束后，使用简并引物对对扩增产物进行桑格尔测序，测序送公司进行，同时从5’端和3’端测序。
表1、区域1和区域2的核苷酸序列
Figure BDA0003977706210000051
Figure BDA0003977706210000061
表2、扩增区域1和区域2的兼并引物对
Figure BDA0003977706210000062
Figure BDA0003977706210000071
表3、添加简并引物的PCR反应体系
组分 用量(μL)
10×Taq buffer(Mg2+Free) 5
25mM Mg2+ 4
dNTP Mix(10mM each) 1
上游引物(10μM) 1
下游引物(10μM) 1
热启动Taq DNA聚合酶 0.5
模板DNA 10
超纯水 补至50
表4、PCR反应程序
Figure BDA0003977706210000072
5.结果分析
甲基化水平分析：
根据测序峰图对每个样本各个扩增子中的差异CpG位点的甲基化情况进行分析。一个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种，即非甲基化和甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。如果一个扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该基因区域是甲基化阳性的。
样本判定标准：
1)以区域1为目标区域的条件下，若待测组织样本在该区域为甲基化阳性，则该组织样本为子宫内膜癌阳性样本；若待测组织样本在区域1为甲基化阴性，则该组织样本为子宫内膜癌阴性样本。
2)以区域2为目标区域的条件下，若待测组织样本在该区域为甲基化阳性，则该组织样本为子宫内膜癌阳性样本；若待测组织样本在区域2为甲基化阴性，则该样本为子宫内膜癌阴性样本。
3)以区域1和区域2作为目标区域的条件下，若待测组织样本在区域1和区域2中至少一个区域为甲基化阳性，则该组织样本为子宫内膜癌阳性样本；若待测组织样本在区域1和区域2都为甲基化阴性，则该组织样本为子宫内膜癌阴性样本。
统计利用亚硫酸氢盐测序法分析区域1和区域2的甲基化水平进而判定各类组织样本的灵敏度和特异性，如表5所示。
灵敏度为病理结果为阳性的样本中该方法判定为阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中该方法判定为阴性的比例。
表5、亚硫酸氢盐测序法分析目标区域的甲基化水平进而判定各类组织样本的性能
Figure BDA0003977706210000073
据统计，早期(Ⅰ期和Ⅱ期)子宫内膜癌患者的5年生存率可达70％，而Ⅲ期和Ⅳ期子宫内膜癌患者的5年生存率分别为40％～50％和15％～20％。因此，有必要在早期对子宫内膜癌患者进行诊断并治疗。由表5可以看出，通过亚硫酸氢盐测序法分析区域1和/或区域2的甲基化水平进而诊断待测组织样本是否为子宫内膜癌样本的性能很好。具体地，区域1诊断早期子宫内膜癌的灵敏度为80.00％，区域2诊断早期子宫内膜癌的灵敏度为68.89％，区域1和区域2联合诊断早期子宫内膜癌的灵敏度高达93.33％；区域1和/或区域2诊断中晚期子宫内膜癌的灵敏度均较高，其范围为90.32％～100％。另外，区域1、区域2和区域1+区域2诊断子宫内膜癌旁正常组织的特异性分别为91.30％、95.65％和91.30％。
考虑到该技术方案的适用人群为出现阴道异常出血的孕龄女性和绝经期女性，因此，有必要分析该技术方案区分子宫良性疾病和子宫内膜癌的性能。在表5中，单独检测区域1、单独检测区域2和同时检测区域1+区域2诊断子宫内膜息肉、子宫肌瘤、子宫腺肌症等子宫良性疾病的特异性分别为94.90％、97.96％和92.86％，可见，检测目标区域能够有效区分子宫良性疾病和恶性疾病。
虽然单独检测区域1或区域2诊断子宫内膜癌的灵敏度较高且特异性很好，但是同时检测区域1和区域2可以显著提高其对早期子宫内膜癌的检出率，更有利于实现子宫内膜癌的早诊早治，综合考虑，可以同时分析区域1和区域2的甲基化水平来诊断子宫内膜癌。
实施例2、甲基化特异性荧光定量PCR法检测组织样本中目标区域的甲基化水平
考虑到临床应用，本实施例进一步采用甲基化特异性荧光定量PCR法检测区域1和/或区域2的甲基化水平，进而分析该方法诊断子宫内膜癌的性能。具体实验流程如下：
1.临床样本的收集、模板DNA的提取、转化和纯化同实施例1。
2.甲基化特异性荧光定量PCR反应
将经亚硫酸氢盐转化后的DNA分别进行甲基化荧光定量PCR反应以检测各个样本中目标区域的甲基化状态，为了提高PCR的扩增效率，将区域1和区域2分别分为3个短片段区域(不超过160bp)，即区域1-1、区域1-2、区域1-3、区域2-1、区域2-2和区域2-3，并针对每个短片段区域设计多对甲基化检测引物对和检测探针。用SYBR荧光定量PCR体系分析针对每个目标区域的每对检测引物的性能，要求扩增曲线具有明显的指数增长期，扩增效率在90％～110％的范围内，且无非特异性扩增。得到满足上述所有要求的针对每个短片段区域的甲基化引物对以后，对每对引物对设计相应的检测探针，检测探针均为TaqMan探针，探针5’端为荧光基团，探针3’端为荧光淬灭基团，要求检测引物对与检测探针之间、检测探针与目标区域之间无非特异性结合。最后在荧光定量PCR体系中验证甲基化引物对和检测探针联用的效果，保留具有指数扩增期的引物对和探针作为最终的检测产品。
通过上述方法，最终筛选得到的甲基化检测引物对和检测探针如表6所示。针对各个短片段区域的检测引物对和探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点如表7所示。
表6、各短片段区域的检测引物对和检测探针
Figure BDA0003977706210000081
表7、甲基化引物对和检测探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点
Figure BDA0003977706210000082
Figure BDA0003977706210000091
以转化后的组织样本DNA为模板，使用表6中提供的检测引物对和检测探针进行荧光定量PCR反应来扩增每个样本中所述6个不同的短片段目标区域。若只检测一个目标区域，在PCR反应体系中，需加入目标区域特异性的甲基化检测引物对和检测探针，以及内参基因ACTB的检测引物对和检测探针。若同时检测两个目标区域，在PCR反应体系中，需同时加入2个目标区域特异性的甲基化检测引物对和检测探针，以及内参基因ACTB的检测引物对和检测探针。内参基因ACTB用于评估样本中DNA的含量和质量，本实施例中用到的扩增ACTB基因片段的上游引物序列为：5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID No.29)，扩增ACTB基因片段的下游引物序列为：5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’(SEQ ID No.30)，与之对应的检测探针序列为：5’-VIC-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-BHQ1-3’(SEQ ID No.31)。在每个PCR反应体系中，目标区域的检测探针的5’端荧光基团分别为FAM和/或ROX，3’端荧光淬灭基团为BHQ1和/或MGB。具体地，按照表8提供的配方配置PCR扩增体系(表8为同时检测两个目标区域条件下的扩增体系，若只检测一个目标区域，则不加入另一个目标区域的检测引物对和检测探针，对应地用超纯水补足总体积为25μL)，配方中用到的DNA聚合酶及缓冲液等成分均购自Invitrogen(Cat:14966005)。此外，在检测组织样本中每一个目标区域时，需要同时设置质控实验，即需要设置阳性对照PCR管和阴性对照PCR管。对于某一目标区域，阳性对照PCR管和阴性对照PCR管的配置体系与实验测试PCR管相同，但是阳性对照PCR管的模板为103拷贝/微升的含转化后该目标区域的质粒和103拷贝/微升的含转化后ACTB基因片段的质粒等体积混合而成，阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液。当阳性对照PCR管、实验测试PCR管和阴性对照PCR管的体系配置完成后，按照表9提供的程序在荧光定量PCR仪上进行反应。
表8、qPCR反应体系
组分 规格 体积(μL)
Platinum II PCR缓冲液 5× 5
dNTPs 各2.5mM 3
一个区域上游引物 10μM 0.5
一个区域下游引物 10μM 0.5
一个区域检测探针 10μM 0.5
另一个区域上游引物 10μM 0.5
另一个区域下游引物 10μM 0.5
另一个区域检测探针 10μM 0.5
ACTB上游引物 10μM 0.5
ACTB下游引物 10μM 0.5
ACTB检测探针 10μM 0.5
DNA Polymerase / 0.5
待测样本DNA / 5
超纯水 / 补至25
表9、qPCR反应程序
Figure BDA0003977706210000092
Figure BDA0003977706210000101
qPCR反应结束后，调整基线，并设置阈值，阈值必须位于指数扩增期内，穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线，阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果，要求：①阴性对照PCR管无扩增(即不起线)；②阳性对照PCR管有明显的指数增长期，且阳性对照PCR管目标基因的Ct值在26～30之间；③待测样本的内参基因的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求，则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读，否则，当次实验无效，必须重新进行检测。
3.结果分析
甲基化水平分析：
根据qPCR的Ct值分析待测样本的甲基化水平。对于本实施例中的某一子宫内膜组织样本，若扩增某一短片段目标区域的Ct值≤38，则认为该组织样本中此区域为甲基化阳性，若扩增某一短片段目标区域的Ct值＞38，则认为该组织样本中此区域为甲基化阴性。
样本判定标准：
1)以区域1或区域2中的一个短片段为目标区域的条件下，若待测组织样本在该区域为甲基化阳性，则此待测组织样本为子宫内膜癌阳性样本；若待测组织样本在该区域为甲基化阴性，则此待测组织样本为子宫内膜癌阴性样本。
2)以区域1中的一个短片段和区域2中的一个短片段作为目标区域的条件下，若待测组织样本在至少一个短片段目标区域为甲基化阳性，则该待测组织样本为子宫内膜癌阳性样本；若待测组织样本在2个短片段目标区域都为甲基化阴性，则该待测组织样本为子宫内膜癌阴性样本。
以区域1或区域2中的一个短片段作为目标区域、以及以区域1中的一个短片段和区域2中的一个短片段作为目标区域，进而通过分析目标区域的甲基化状态诊断子宫内膜组织样本的性能如表10所示。
表10、qPCR法分析目标区域的甲基化水平进而诊断各类组织样本的性能
Figure BDA0003977706210000102
Figure BDA0003977706210000111
由表10可以看出，以区域1或区域2中的一个短片段作为目标区域、以及以区域1中的一个短片段和区域2中的一个短片段作为目标区域都对子宫内膜癌组织样本有一定的检出率。具体地，以区域1或区域2中的一个短片段作为目标区域的条件下，其检测早期子宫内膜癌组织样本的灵敏度范围为62.22％～77.78％，其检测中晚期子宫内膜癌组织样本的灵敏度范围为83.87％～93.55％，其检测子宫内膜癌组织样本的总灵敏度范围为71.05％～84.21％；以区域1中的一个短片段和区域2中的一个短片段作为目标区域的条件下，其检测早期子宫内膜癌组织样本的灵敏度范围为75.56％～91.11％，其检测中晚期子宫内膜癌组织样本的灵敏度范围为93.55％～100％，其检测子宫内膜癌组织样本的总灵敏度范围为84.21％～94.74％。另外，表10中所列举的目标区域对子宫内膜癌旁正常组织样本和子宫良性疾病组织样本的检测特异性都很高，其检测子宫内膜癌旁正常组织样本的特异性均高于84％，其检测子宫良性疾病组织样本的特异性均高于91％。总体来看，以区域1中的一个短片段和区域2中的一个短片段作为目标区域对组织样本的检测灵敏度高于以区域1或区域2中的一个短片段作为目标区域，且前者的检测特异性相较于后者没有明显降低。
实施例3、甲基化特异性荧光定量PCR法检测细胞样本中目标区域的甲基化水平
1.样本收集
本实施例收集了经组织病理活检确诊为子宫内膜癌患者的宫颈脱落细胞样本共120例，收集了经组织病理活检确诊为宫颈癌患者的宫颈脱落细胞样本共78例，收集了经组织病理活检确诊为子宫良性疾病(子宫内膜息肉、子宫肌瘤、子宫腺肌症等)患者的宫颈脱落细胞样本145例，收集了参加体检的健康女性的宫颈脱落细胞样本共130例。所有细胞样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者签署了知情同意书，所有样本采用匿名化处理。
2.脱落细胞样本中模板DNA的提取
对于宫颈脱落细胞，采用天根生化科技有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取(Cat:DP304)，具体操作按照说明书进行。
3.样本DNA的转化和纯化同实施例1。
4.甲基化特异性荧光定量PCR反应
考虑到以区域1中的一个短片段和区域2中的一个短片段作为目标区域的检测性能优于单独使用区域1或区域2中的一个短片段作为目标区域，因此，本实施例仅采用前者作为目标区域，即在一个PCR反应体系中，同时加入2个目标区域的检测引物对和检测探针。按照实施例2中提供的方法，以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的脱落细胞样本DNA为模板，使用表6中的检测引物对和检测探针，进行甲基化特异性荧光定量PCR反应检测各个待测细胞样本的甲基化水平。qPCR反应的对照设置以及质量控制同实施例2。
5.样本判定标准同实施例2。
以区域1中的一个短片段和区域2中的一个短片段作为目标区域，通过qPCR法分析目标区域的甲基化状态诊断宫颈脱落细胞样本的性能如表11所示。
表11、qPCR法分析目标区域的甲基化水平进而诊断宫颈脱落细胞样本的性能
Figure BDA0003977706210000112
Figure BDA0003977706210000121
由表11可以看出，以区域1中的一个短片段和区域2中的一个短片段作为目标区域，通过甲基化特异性荧光定量PCR的方法检测宫颈脱落细胞样本中目标区域的甲基化水平，可以有效区分子宫内膜癌患者和非子宫内膜癌患者。具体地，所述目标区域检测早期子宫内膜癌患者宫颈脱落细胞样本的灵敏度范围为73.53％～88.24％，其检测中晚期子宫内膜癌患者宫颈脱落细胞样本的灵敏度范围为92.31％～100％，其检测子宫内膜癌患者宫颈脱落细胞样本的总体灵敏度范围为81.67％～93.33％；所述目标区域检测子宫良性疾病患者宫颈脱落细胞样本的特异性范围为91.03～95.17％，其检测健康女性宫颈脱落细胞样本的特异性范围为93.08％～98.46％。此外，所述目标区域对宫颈癌患者细胞样本的检出率不高，因此，虽然检测的样本为宫颈脱落细胞，但是不会造成误诊。
综上，通过分析目标区域的甲基化水平进而诊断子宫内膜癌的效果很好，且对癌症早期患者有较高的检出率，以便于在早期对患者进行治疗，有利于提高子宫内膜癌患者的生存质量和生命周期。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用；
所述目标区域包括：区域1或者区域1的部分区域，或/和，区域2或者区域2的部分区域；
以GRCh38.p14为参考，
区域1为Chr6:27679636-27680274正链，
区域2为Chr6:10390489-10390886正链。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述区域1的部分区域选自如下定义的区域1-1、区域1-2和区域1-3中的一个或者多个：区域1-1为Chr6:27679695-27679811、区域1-2为Chr6:27679919-27680065和区域1-3为Chr6:27680099-27680254；
或/和，
所述区域2的部分区域选自如下定义的区域2-1、区域2-2和区域2-3中的一个或者多个：区域2-1为Chr6:10390551-10390673、区域2-2为Chr6:10390668-10390804和区域2-3为Chr6:10390758-10390876。
3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量PCR法。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用于检测目标区域的甲基化水平的核酸组合。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述核酸组合通过所述亚硫酸氢盐测序法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对；
可选地，用于检测所述区域1甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示的检测引物对，或/和，用于检测所述区域2甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQID No.9和SEQ ID No.10所示的检测引物对。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述核酸组合通过所述甲基化特异性荧光定量PCR法实现对所述目标区域的甲基化水平的检测，所述核酸组合包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对以及检测探针；
可选地，用于检测所述区域1-1甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.11和SEQID No.12所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.13所示的检测探针；用于检测所述区域1-2甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.16所示的检测探针；用于检测所述区域1-3甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.19所示的检测探针；用于检测所述区域2-1甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.20和SEQ IDNo.21所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.22所示的检测探针；用于检测所述区域2-2甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.25所示的检测探针；或/和，用于检测所述区域2-3甲基化水平的核酸组合包括序列如SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的检测引物对和序列如SEQ ID No.28所示的检测探针。
7.根据权利要求1、2、4至6中任一项所述的应用，其特征在于，检测的样本类型包括细胞样本、血液样本或者组织样本。
8.一种子宫内膜癌诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至7任一项所定义的试剂。
9.根据权利要求8所述的子宫内膜癌诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、质控品、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、DNA提取试剂和DNA纯化试剂中的一种或者多种。
10.根据权利要求9所述的子宫内膜癌诊断试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
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