CN116179693A - 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断产品中的应用 - Google Patents

检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断产品中的应用 Download PDF

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CN116179693A CN202211336648.7A CN202211336648A CN116179693A CN 116179693 A CN116179693 A CN 116179693A CN 202211336648 A CN202211336648 A CN 202211336648A CN 116179693 A CN116179693 A CN 116179693A
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Abstract

本发明涉及一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断产品中的应用；所述妇科恶性肿瘤为卵巢癌、子宫颈癌或者子宫内膜癌。相对于传统技术，本申请的有益效果包括：本申请的发明人发现了与妇科恶性肿瘤卵巢癌、子宫颈癌或者子宫内膜癌相关的一组标志物，采用检测该组标志物的DNA的甲基化水平的试剂，能够实现妇科恶性肿瘤的无创及早期诊断，且具有检测灵敏度高、特异性高以及便捷的特点。

Description

检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断 产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断产品中的应用。
背景技术
妇科恶性肿瘤即女性生殖系统肿瘤，主要包括卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌等，其严重威胁妇女的身心健康，是导致妇女死亡的主要原因之一。在妇科恶性肿瘤中，子宫内膜癌发病率最高，而卵巢癌死亡率最高。一些妇科恶性肿瘤在发病早期通常无特异性的病症，多数患者因身体不适到医院进行检查时病程已进入中晚期，从而错失了最佳的手术治疗时机。因此，要加强对妇女的健康教育，提高其保健意识和健康观念，此外，还需建立全面的筛查制度，促进妇科恶性肿瘤的筛查、早期诊断和早期治疗，以提高患者的治愈率，为患者减少痛苦，减轻经济负担。
卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其起病隐匿，恶性程度高，5年生存率仅有20％-36％。卵巢上皮性癌是最常见的卵巢恶性肿瘤的病理类型，约占卵巢恶性肿瘤的80％。目前常用的诊断卵巢癌的方法包括肿瘤标志物检查、影像学检查以及组织病理学检查等。血清糖类抗原125(CA-125)、人附睾蛋白4(HE-4)等是辅助诊断卵巢上皮性癌的常用标志物，但是其检测早期卵巢癌的灵敏性较低，且特异性差。同样，影像学检测对于早期卵巢癌以及卵巢未发生明显形态学改变的病变敏感性较低。组织病理学检查是诊断卵巢癌的金标准，但是卵巢深居盆腔，需要穿刺或腹腔镜手术才可以进行病理组织取样。
近年来，宫颈癌的发病形势十分严峻，且发病出现低龄化的现象。目前已经确认持续的高危型HPV感染是宫颈上皮内瘤样病变的必要条件，但是，80％的妇女感染HPV为一过性，因此对于HPV阳性感染者进行宫颈癌前病变或宫颈癌诊断具有十分重要的意义。
随着人口平均寿命的增加和生活习惯的改变，子宫内膜癌的发病率近20年呈持续上升和年轻化趋势。目前，尚没有推荐的用于子宫内膜癌的常规筛查方法，在血液学方面，也没有特异敏感的血清标志物用于定期监测。
因此，采用良好的血清学标志物来筛查或诊断以上妇科恶性肿瘤，对于妇科恶性肿瘤的早发现、早治疗具有重大意义。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请实施例的目的之一包括将检测分子标记物甲基化水平的试剂用于妇科恶性肿瘤诊断产品的制备，采用该诊断产品能够实现妇科恶性肿瘤的无创及早期诊断。
在本申请的第一方面，提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断产品中的应用；
所述目标区域为如下定义的区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7和区域8的组合：
以GRCh38.p14为参考，
区域1为Chr1:110068235-110068349正链，
区域2为Chr3:147396065-147396198正链，
区域3为Chr6:28259254-28259365正链，
区域4为Chr6:50724522-50724658正链，
区域5为Chr6:100447207-100447333正链，
区域6为Chr7:8442522-8442428负链，
区域7为Chr13:112067432-112067313负链，
区域8为Chr20:21713905-21714021正链；
所述妇科恶性肿瘤为卵巢癌、子宫颈癌或者子宫内膜癌。
在本申请的一些实施方式中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在本申请的一些实施方式中，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，或者还包括检测所述目标区域的检测探针。
在本申请的一些实施方式中，所述试剂包括具备如下技术特征中的一个或者多个的检测所述目标区域的甲基化水平的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针：
检测所述区域1的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
检测所述区域2的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
检测所述区域3的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；
检测所述区域4的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
检测所述区域5的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
检测所述区域6的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；
检测所述区域7的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；和，
检测所述区域8的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示。
在本申请的一些实施方式中，所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针；所述内参基因包含ACTB基因。
在本申请的一些实施方式中，检测所述ACTB基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
在本申请的一些实施方式中，检测的样本包括细胞样本、组织样本或者尿液样本。
在本申请的第二方面，提供一种妇科恶性肿瘤诊断试剂盒，包括本申请第一方面中所定义的试剂。
在本申请的一些实施方式中，所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂和DNA提取试剂中的一种或者多种。
在本申请的一些实施方式中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请的发明人发现了与妇科恶性肿瘤(卵巢癌、子宫颈癌或者子宫内膜癌)相关的一组标志物，采用检测该组标志物的DNA的甲基化水平的试剂，能够实现妇科恶性肿瘤的无创及早期诊断，且具有检测灵敏度高、特异性高以及便捷的特点。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本申请所使用的术语“和/或”、“或/和”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A和/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，B，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。“以上”包括本数，比如“两种以上”包括两种、三种或更多种。
本申请中，“至少一者”、“至少一种”是指可以是所列项目中的任一项，或者是其中任意两种以上的组合。
本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。可以理解，本文中被检测基因的目标区域是包括至少一个CpG二核苷酸(CG)的DNA序列。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，将一个甲基基团转移到胞嘧啶碱基的第5位碳原子上。肿瘤抑制基因启动子区域DNA的甲基化是癌变过程中的重要事件，异常的DNA甲基化通常发生在癌症的早期且稳定存在。DNA的异常甲基化通常导致抑癌基因失活和癌基因的激活。鉴于此，发生甲基化改变的基因可以作为诊断癌变或癌前病变的分子标记物，具有一定的诊断价值。在进行癌症阴、阳性的判定过程中，筛选到合适的分子标记物并对其进行甲基化检测是非常关键的。
本申请的第一方面
本申请提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断产品中的应用；
所述目标区域为如下定义的区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7和区域8的组合：
以GRCh38.p14为参考，
区域1为Chr1:110068235-110068349正链，
区域2为Chr3:147396065-147396198正链，
区域3为Chr6:28259254-28259365正链，
区域4为Chr6:50724522-50724658正链，
区域5为Chr6:100447207-100447333正链，
区域6为Chr7:8442522-8442428负链，
区域7为Chr13:112067432-112067313负链，
区域8为Chr20:21713905-21714021正链；
所述妇科恶性肿瘤为卵巢癌、子宫颈癌或者子宫内膜癌。
本申请中的诊断产品能够检测妇科恶性肿瘤病变的各个阶段，例如子宫颈上皮内瘤变2级、子宫颈上皮内瘤变3级等。
可选地，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
可选地，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，或者还包括检测所述目标区域的检测探针。
可选地，所述试剂包括具备如下技术特征中的一个或者多个的检测所述目标区域的甲基化水平的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针：
检测所述区域1的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
检测所述区域2的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
检测所述区域3的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；
检测所述区域4的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
检测所述区域5的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
检测所述区域6的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；
检测所述区域7的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；和，
检测所述区域8的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示。
采用如上定义的试剂进行检测的过程中，检测不同区域的检测引物对及其对应的检测探针可以分别置于单一反应体系中对某一目标区域进行检测，也可以将检测多个区域的检测引物对及其对应的检测探针同时置于一个反应体系中对多个目标区域进行检测，例如同时检测2个、3个或多个目标区域。
可选地，所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针；所述内参基因包含ACTB基因。
可选地，检测所述ACTB基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.41和SEQ IDNO.42所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
可选地，检测的样本包括细胞样本、组织样本或者尿液样本。
本申请的第二方面
本申请提供一种妇科恶性肿瘤诊断试剂盒，包括本申请第一方面中所定义的试剂。
可选地，所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂和DNA提取试剂中的一种或者多种。
可选地，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
本实施例涉及甲基化特异性荧光定量法(qMSP)检测组织样本中目标区域的甲基化水平。
以GRCh38.p14为参考基因组，以Chr1:110068235-110068349区域正链DNA分子(SEQ ID NO.1)、Chr3:147396065-147396198区域正链DNA分子(SEQ ID NO.2)、Chr6:28259254-28259365区域正链DNA分子(SEQ ID NO.3)、Chr6:50724522-50724658区域(SEQID NO.4)、Chr6:100447207-100447333区域正链DNA分子(SEQ ID NO.5)、Chr7:8442522-8442428区域负链DNA分子(SEQ ID NO.6)、Chr13:112067432-112067313区域负链DNA分子(SEQ ID NO.7)和Chr20:21713905-21714021区域正链DNA分子(SEQ ID NO.8)为目标区域，设计各个目标区域对应的甲基化检测引物对和检测探针，通过甲基化特异性荧光定量PCR法检测各个目标区域的甲基化水平，并根据PCR结果来区分妇科恶性肿瘤患者和健康人。具体的步骤如下所示。
1.样本收集
收集经组织病理活检确诊为卵巢癌患者的癌组织样本和对应的正常癌旁组织样本各38例；收集经组织病理活检确诊为子宫内膜癌患者的癌组织样本和对应的正常癌旁组织样本各53例；收集经组织病理活检确诊为子宫内膜息肉患者的组织样本32例和对应的正常组织样本32例；收集经组织病理活检确诊为子宫颈癌的癌组织样本和对应的正常癌旁组织样本各59例；分别收集经组织病理活检确诊为子宫颈上皮内瘤变2级(CIN2)、子宫颈上皮内瘤变3级(CIN3)的组织样本及其对应的正常组织样本各31例和45例。以上所述的组织样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织。所有组织样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有组织样本均采用匿名化处理。
2.组织样本DNA的提取
采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本中的基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
3.组织样本DNA的转化和纯化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
4.甲基化特异性荧光定量PCR
分别以各个目标区域经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板，设计甲基化引物对和检测探针用以扩增相应的目标区域。各目标区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列如表1所示。用以扩增各个目标区域的甲基化引物对和检测探针的序列如表2所示，经验证，表2中所展示的甲基化检测引物对扩增目标区域的扩增效率均大于90％而小于110％，且无非特异性扩增。表2中的甲基化引物对和检测探针可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表3所示。
表1、各个目标区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列
Figure BDA0003915535200000051
/>
Figure BDA0003915535200000061
表2、甲基化检测引物对及其对应的检测探针的核苷酸序列
Figure BDA0003915535200000062
/>
Figure BDA0003915535200000071
表3、甲基化检测引物对及探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点
Figure BDA0003915535200000072
在确定甲基化特异性荧光定量PCR反应的检测引物对和检测探针后，按照表4的配方配置PCR反应体系，反应体系中用到的检测引物对和检测探针由上海生工生物合成，用到的模板为从各类组织样本中提取的且经亚硫酸氢盐转化的DNA，其它组分均购自Invitrogen(Cat:14966005)。对于每一个待测组织样本，都需要同时进行4管PCR反应，以便同时检测8个目标区域的甲基化水平，在每个PCR反应管中，除加入2个互不相同的目标区域的引物对和检测探针以外，还需加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针作为质控。甲基化特异性荧光定量PCR反应用到的检测探针均为TaqMan探针，目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM或ROX，3’端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。为了能够检测到每一个目标区域的荧光信号，在一个PCR反应管中，同时检测的两个互不相同的目标区域，其检测探针5’端所带的荧光报告基团是不同的，如检测一个目标区域的检测探针其5’端荧光报告基团为FAM时，则检测另一个目标区域的检测探针其5’端荧光报告基团为ROX，二者互不干扰。PCR反应体系配置结束后按照表5所示的反应程序在荧光定量PCR仪器上进行扩增。
表4、甲基化特异性荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0003915535200000081
表5、甲基化特异性荧光定量PCR反应程序
Figure BDA0003915535200000082
在对目标区域的甲基化水平进行荧光定量PCR检测的同时，还需要设置阴性对照管和阳性对照管。阴性对照管：按照表4的配方配置qMSP反应体系，模板为TE缓冲液。阳性对照管：按照表4的配方配置qMSP反应体系，但是模板为含ACTB(转化后序列)和目标区域的人工合成的质粒。阳性对照模板的制备方法：将ACTB基因经亚硫酸氢盐转化后的序列片段和SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.16所对应的序列片段分别克隆至pUC57上，形成人工合成质粒，将各个质粒均稀释到103拷贝/微升。如某两个目标区域的阳性对照模板为：103拷贝/微升的含转化后ACTB基因的质粒、103拷贝/微升的含一个目标区域转化后序列片段的质粒和103拷贝/微升的含另一个目标区域转化后序列片段的质粒1:1:1混合而成。
本实施例的目标区域是区域1至区域8，即对于每一个样本都需要检测8个目标区域的甲基化水平。在实际操作中，由于常用的荧光定量PCR仪器是4通道的(即加上内参基因所带的荧光信号，还可以检测3个目标区域所带的荧光信号)，因此在一个PCR反应体系中难以同时检测8个区域。鉴于此，本实施例是在一个PCR体系中同时检测2个目标区域，这样可以避免加入过多的引物对和探针产生的非特异性扩增以及PCR抑制，而且荧光信号相对简单，信号值更加准确。本实施例中的8个目标区域的PCR体系的配置(即检测分组方式)为：区域1+区域2+ACTB；区域3+区域4+ACTB；区域5+区域6+ACTB；区域7+区域8+ACTB；对每一个样本，都要进行上述4组反应，才能够实现检测每个区域的甲基化水平的目的。当然，上述4种组合方式可以发生改变，但是只要检测了一个待测样本中8个目标区域的甲基化水平即可。Ct值读取：qPCR反应结束后，可手动调整基线，将基线荧光值标准差的10倍高度对应的荧光强度值设置为阈值，阈值线为穿过阈值的与X轴平行的直线，其必须位于指数扩增期内，阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。待检组织样本的内参基因的Ct值应≤33，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步组织样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
5.结果分析
对于待测的组织样本，若其在某一目标区域的Ct值≤38，即认为该组织样本在此区域为甲基化阳性，若待测组织样本在某一目标区域的Ct值>38，则认为该组织样本在此区域为甲基化阴性。
结果判读标准：对于某一待测组织样本，若至少一个目标区域为甲基化阳性，则该待测样本为妇科恶性肿瘤阳性样本，表明该样本至少患有三种妇科恶性肿瘤(卵巢癌、子宫颈癌和子宫内膜癌)中的一种；若待测组织样本中所有8个目标区域均为甲基化阴性，则该待测样本为正常样本，不患有所述三种妇科恶性肿瘤。根据判断标准，8个目标区域联合诊断组织样本的性能如表6所示，其中，灵敏度为病理结果为阳性的样本中qPCR法判定为阳性的比例。特异性为病理结果为阴性的样本中qPCR法判定为阴性的比例。
表6、8个目标区域联合检测三种妇科恶性肿瘤组织样本的性能
Figure BDA0003915535200000091
由表6可以看出，采用甲基化特异性荧光定量PCR的方法，通过检测每种组织样本中8个目标区域的甲基化水平进而来区分卵巢、子宫内膜和子宫颈组织正常样本和恶性病变样本的效果很好。具体地，8个目标区域联合检测卵巢癌组织样本的灵敏度高达86.84％，其检测卵巢正常组织的特异性为89.47％；8个目标区域联合检测子宫内膜癌组织样本的灵敏度为92.45％，其检测子宫内膜正常组织样本和子宫内膜息肉组织样本的特异性分别为91.76％和87.5％；8个目标区域联合检测子宫颈上皮内瘤变2级、子宫颈上皮内瘤变3级和子宫颈癌组织样本的灵敏度分别为：70.97％、84.44％和94.92％，其检测正常子宫颈组织样本的特异性为93.33％。综合来看，以所述8个目标区域为甲基化分子标志物，其对卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌前病变(CIN2和CIN3)和子宫颈癌组织样本的总体检出率为87.61％，其对卵巢正常组织、子宫内膜正常组织、子宫内膜良性病变(息肉)、子宫颈正常组织样本的检测的总体特异性为91.72％，如表7所示。
表7、8个目标区域检测妇科恶性肿瘤组织样本的综合性能
Figure BDA0003915535200000092
实施例2
本实施例涉及甲基化特异性荧光定量法(qMSP)检测血液样本中目标区域的甲基化水平。
1.样本收集
共收集经组织病理活检确诊为卵巢癌患者的血液样本56例，经组织病理活检确诊为子宫内膜癌患者的血液样本62例，经组织病理活检确诊为子宫上皮内瘤变2级患者的血液样本35例，经组织病理活检确诊为子宫上皮内瘤变3级患者的血液样本35例，经组织病理活检确诊为子宫颈癌患者的血液样本84例，以及健康人血液样本200例。每份血液样本的体积大于等于10mL。所有血液样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有血液样本均采用匿名化处理。
2.血浆游离DNA提取
获得新鲜的血液样本后，马上进行离心，收集血浆层，使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(Cat:DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.亚硫酸氢盐的转化
将提取好的血浆cfDNA进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.甲基化特异性荧光定量PCR
以各个样本中提取的、且经亚硫酸氢盐转化和纯化的游离DNA为模板，使用表2中提供的检测引物对和探针，按照表4的配方配制PCR反应体系，最后按照表5的程序进行PCR扩增，注意设置内参基因、阳性对照管和阴性对照管。PCR反应接收后的Ct值读取、质量控制、以及具体的实验步骤参考实施例1。
5.结果分析
对于待测的血浆样本，若其在某一目标区域的Ct值≤45，即认为该样本在此区域为甲基化阳性，若待测样本在某一目标区域的Ct值>45，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。
结果判读标准：对于某一待测样本，若至少一个目标区域为甲基化阳性，则该样本为妇科恶性肿瘤阳性样本，表明该样本至少患有三种妇科恶性肿瘤(卵巢癌、子宫颈癌和子宫内膜癌)中的一种；若所有8个目标区域均为甲基化阴性，则该样本为正常样本，不患有所述三种妇科恶性肿瘤。根据判断标准，8个目标区域联合诊断血浆样本的性能如表8所示，其中，灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例。特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表8、8个目标区域联合检测三种妇科恶性肿瘤血浆样本的性能
Figure BDA0003915535200000101
由表8可以看出，通过qMSP法检测每个样本中8个目标区域的甲基化水平进而来区分卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌前病变、子宫颈癌和健康人血浆样本的效果很好。具体地，8个目标区域联合检测卵巢癌血浆样本的灵敏度为82.14％；8个目标区域联合检测子宫内膜癌血浆样本的灵敏度为88.71％；另外，8个目标区域对子宫颈上皮内瘤变2级、子宫颈上皮内瘤变3级和子宫颈癌血浆样本的检出率分别为：68.57％、80.00％和89.29％。总体看来，卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌前病变(CIN2和CIN3)和子宫颈癌血浆样本的总数为272例，以所述8个目标区域为甲基化分子标志物，其对272例妇科癌前病变及癌变血浆样本的总体检出率为83.82％，其对200例健康人血浆样本的检测特异性为96.00％。综上，以所述8个目标区域为分子标志物，通过液体活检的方式，可以有效区分妇科恶性肿瘤患者和健康人，可用于妇科恶性肿瘤的筛查、辅助诊断等。
以上实施例涉及使用本技术方案中提供的甲基化检测引物对和检测探针，采用甲基化特异性荧光定量PCR的方法，通过检测受试者组织样本、血液样本中SEQ ID NO.1-8的甲基化水平，可以有效区分妇科恶性肿瘤(卵巢癌、子宫颈癌和子宫内膜癌)患者和健康人，8个标志物联合检测的灵敏度为83.82％，特异性为96％，有利于妇科恶性肿瘤的筛查和辅助诊断。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断产品中的应用；
所述目标区域为如下定义的区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7和区域8的组合：
以GRCh38.p14为参考，
区域1为Chr1:110068235-110068349正链，
区域2为Chr3:147396065-147396198正链，
区域3为Chr6:28259254-28259365正链，
区域4为Chr6:50724522-50724658正链，
区域5为Chr6:100447207-100447333正链，
区域6为Chr7:8442522-8442428负链，
区域7为Chr13:112067432-112067313负链，
区域8为Chr20:21713905-21714021正链；
所述妇科恶性肿瘤为卵巢癌、子宫颈癌或者子宫内膜癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，或者还包括检测所述目标区域的检测探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括具备如下技术特征中的一个或者多个的检测所述目标区域的甲基化水平的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针：
检测所述区域1的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
检测所述区域2的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
检测所述区域3的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；
检测所述区域4的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
检测所述区域5的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
检测所述区域6的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；
检测所述区域7的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；和，
检测所述区域8的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针；所述内参基因包含ACTB基因。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测所述ACTB基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示，对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
7.根据权利要求1、2、4至6中任一项所述的应用，其特征在于，检测的样本包括细胞样本、组织样本或者尿液样本。
8.一种妇科恶性肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至7任一项所定义的试剂。
9.根据权利要求8所述的妇科恶性肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂和DNA提取试剂中的一种或者多种。
10.根据权利要求9所述的妇科恶性肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
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