CN116162707A - 检测cyth2基因或/和six3基因中的目标区域的甲基化水平的试剂的新应用 - Google Patents

检测cyth2基因或/和six3基因中的目标区域的甲基化水平的试剂的新应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种CYTH2基因或/和SIX3基因中的目标区域的甲基化水平的试剂的应用；以GRCh38.p14为参考，CYTH2基因中的目标区域为Chr19:48480348‑48480989或者其部分区域，SIX3基因中的目标区域为Chr2:44944407‑44944700或者其部分区域。本申请通过检测目标区域的甲基化的发生能够对子宫内膜癌及癌前病变进行诊断，具有较高的灵敏度和特异性，检出率高。并且，本申请适用于子宫内膜脱落细胞、血浆等的检测，创伤小，操作简便，能够快速、简单地进行测试，且使用样本量少。

Description

检测CYTH2基因或/和SIX3基因中的目标区域的甲基化水平的 试剂的新应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种CYTH2基因或/和SIX3基因中的目标区域的甲基化水平的试剂的新应用。
背景技术
子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮源性恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性。子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一。子宫内膜癌发病与生活方式密切相关，发病率在各地区有差异。
一般认为，子宫内膜癌根据发病机制和生物学行为特点可分为雌激素依赖型(I型)和非雌激素依赖型(II型)。雌激素依赖型子宫内膜癌绝大部分为子宫内膜样癌，少部分为黏液腺癌；大部分雌激素依赖型子宫内膜癌预后良好。非雌激素依赖型子宫内膜癌包括浆液性癌、透明细胞癌等，大多预后较差。
子宫内膜癌的检查方法包括超声、磁共振，以及宫腔镜加诊断性刮宫等。通过超声检查能够观察宫腔内的情况，是否存在子宫内膜异常增厚、宫腔内异常回声团等，初步进行判断。通过磁共振检查可以观察子宫内膜的情况，癌灶组织是否侵及深肌层等，并且也可以观察到盆腔淋巴结的情况，是否存在可疑的淋巴结增大，来判断是否有可能存在远处转移。通过宫腔镜，可以直视宫腔内的情况，观察子宫内膜是否存在异常影像，但宫腔镜检查费用高昂，且单独运用参考价值大于诊断价值。超声与核磁共振等影像学检查仅能说明患者罹患疾病的程度，对于病变的具体类型的判断有限。诊断性刮宫检查是将子宫内膜刮出之后送病理检查，通过病理学检查可以明确是否存在子宫内膜癌。目前子宫内膜癌临床诊断主要依靠诊断性刮宫，但取样过程中患者较痛苦，且取样有创伤，可能导致患者子宫穿孔、大出血、刮宫不全损伤及宫腔粘连、感染等。
整体上，子宫内膜癌诊断的金标准为子宫外转移灶或手术切除组织标本病理学检查，目前的诊断方法均为侵入式的检查，会对病人造成一定的损伤，并且检测低效，较适用于病情发展较长已具备手术指征或已发生远端转移的患者，而早期子宫内膜癌难以用上述方法筛查或诊断。鉴于传统的子宫内膜癌检查方法具有侵入性及低效性，所以现急需一种更加方便、微创/无创、高效的检查方法来筛查子宫内膜癌。
发明内容
本申请实施例的目的之一包括将检测CYTH2基因或/和SIX3基因中的目标区域的甲基化水平的试剂用于制备子宫内膜癌或者其癌前病变诊断产品，以将子宫内膜癌或其癌前病变与子宫良性病变患者以及健康人有效区分，实现子宫内膜癌的简单、高效、微创/无创诊断。
在本申请的第一方面，提供一种用于子宫内膜癌或其癌前病变诊断的DNA甲基化水平检测试剂，包括检测CYTH2基因中的目标区域或/和SIX3基因中的目标区域的甲基化水平的试剂，
所述CYTH2基因中的目标区域为区域I或者区域I的部分区域，
所述SIX3基因中的目标区域为区域II或者区域II的部分区域，
以GRCh38.p14为参考，所述区域I为Chr19:48480348-48480989，或/和，所述区域II为Chr2:44944407-44944700。
在本申请的一些实施例中，所述区域I的部分区域选自如下定义的区域1至区域5中的一个或者多个：
区域1为Chr19:48480348-48480514，正链，
区域2为Chr19:48480762-48480910，正链，
区域3为Chr19:48480812-48480989，负链，
区域4为Chr19:48480601-48480784，负链，和
区域5为Chr19:48480399-48480586，负链。
可选地，所述区域II的部分区域选自如下定义的区域6和区域7中的一个或者多个：
区域6为Chr2:44944407-44944671，正链，和，
区域7为Chr2:44944523-44944700，负链。
在本申请的一些实施例中，所述检测试剂包括检测所述目标区域的引物对以及检测探针。
在本申请的一些实施例中，所述检测试剂选自如下引物对及检测探针组合中的一个或者多个：
(1)检测所述区域1的引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，以及检测探针如SEQ ID No.3所示；
(2)检测所述区域2的引物对如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，以及检测探针如SEQ ID No.6所示；
(3)检测所述区域3的引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，以及检测探针如SEQ ID No.9所示；
(4)检测所述区域4的引物对如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，以及检测探针如SEQ ID No.12所示；
(5)检测所述区域5的引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，以及检测探针如SEQ ID No.15所示；
(6)检测所述区域6的引物对如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示，以及检测探针如SEQ ID No.18所示；和，
(7)检测所述区域7的引物对如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，以及检测探针如SEQ ID No.21所示。
在本申请的第二方面，提供一种子宫内膜癌或其癌前病变诊断用试剂盒，包括在第一方面中所述的检测试剂。
在本申请的一些实施例中，所述试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂和DNA提取试剂中的一种或者多种。
在本申请的一些实施例中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种；
在本申请的一些实施例中，所述试剂盒还包括获取离体生物样本的取样装置。
在本申请的第三方面，提供在第一方面中所述的检测试剂或第二方面中所述的试剂盒在制备子宫内膜癌或其癌前病变诊断产品中的应用。
在本申请的一些实施例中，所述检测试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率熔解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在本申请的一些实施例中，所述诊断产品用于检测离体生物样本，所述离体生物样本包括细胞样本、组织样本或者血液样本。
在本申请的一些实施例中，所述癌前病变包括非典型性子宫内膜增生。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请以CYTH2基因和/或SIX3基因作为生物标志物，通过检测其中的Chr19:48480348-48480989bp及Chr2:44944407-44944700bp中区域的甲基化的发生能够对子宫内膜癌及癌前病变进行诊断，具有较高的灵敏度和特异性，检出率高。并且，本申请适用于子宫内膜脱落细胞、血浆等样本类型的检测，创伤小，操作简便，能够快速、简单地进行测试，且使用样本量少。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本申请所使用的术语“和/或”、“或/和”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A和/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，B，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。“以上”包括本数，比如“两种以上”包括两种、三种或更多种。
本申请中，“至少一者”、“至少一种”是指可以是所列项目中的任一项，或者是其中任意两种以上的组合。
本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。可以理解，本文中被检测基因的目标区域是包括至少一个CpG二核苷酸(CG)的DNA序列。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，将一个甲基基团转移到胞嘧啶碱基的第5位碳原子上。异常的DNA甲基化通常发生在癌症的早期且稳定存在。DNA的异常甲基化通常导致抑癌基因失活和癌基因的激活。鉴于此，发生甲基化改变的基因可以作为诊断癌变或癌前病变的分子标记物，具有一定的诊断价值。在进行癌症阴、阳性的判定过程中，筛选到合适的分子标记物并对其进行甲基化检测是非常关键的。
CYTH2基因位于人类19号染色体上，具体位置为48469369-48482314bp，该基因编码的蛋白质是PSCD家族的一员。SIX3基因位于人类2号染色体上，具体位置为44941702-44946071bp，这种基因编码的蛋白在眼睛发育过程中起着重要作用。本文中提到的位点或区域的位置均是以GRCh38.p14为参考。
本申请发现，以CYTH2和SIX3基因作为生物标志物，通过检测Chr19:48480348-48480989bp和/或Chr2:44944407-44944700bp区域的甲基化的发生可以对子宫内膜癌及癌前病变进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效地提高子宫内膜癌及癌前病变的检出率。
本申请的第一方面
本申请提供一种用于子宫内膜癌或其癌前病变诊断的DNA甲基化水平检测试剂，包括检测CYTH2基因中的目标区域或/和SIX3基因中的目标区域的甲基化水平的试剂，
所述CYTH2基因中的目标区域为区域I或者区域I的部分区域，
所述SIX3基因中的目标区域为区域II或者区域II的部分区域，
以GRCh38.p14为参考，所述区域I为Chr19:48480348-48480989，或/和，所述区域II为Chr2:44944407-44944700。
在一些实施方式中，所述区域I的部分区域选自如下定义的区域1至区域5中的一个或者多个：
区域1为Chr19:48480348-48480514，正链，
区域2为Chr19:48480762-48480910，正链，
区域3为Chr19:48480812-48480989，负链，
区域4为Chr19:48480601-48480784，负链，和
区域5为Chr19:48480399-48480586，负链。
可选地，所述区域II的部分区域选自如下定义的区域6和区域7中的一个或者多个：
区域6为Chr2:44944407-44944671，正链，和，
区域7为Chr2:44944523-44944700，负链。
在一些实施方式中，所述试剂同时检测CYTH2基因中的目标区域和SIX3基因中的目标区域的甲基化水平。可以理解，可以同时检测CYTH2基因中任一个或多个区域与SIX3基因中任一个或多个区域的组合。例如，同时检测CYTH2基因中任一个区域与SIX3基因中任一个或两个区域；或者同时检测CYTH2基因中两个或更多个区域与SIX3基因中任一个或两个区域。在一些具体示例中，试剂检测区域1和区域6的组合、区域1和区域7的组合、区域2和区域6的组合、区域2和区域7的组合、区域3和区域6的组合、区域3和区域7的组合、区域4和区域6的组合、区域4和区域7的组合、区域5和区域6的组合、区域5和区域7的组合；在另一些示例中，试剂还可以检测区域1至5中任意两个区域与区域6或区域7的组合，或者试剂还可以检测区域1至5中任意一个区域与区域6和区域7的组合。目标区域的选择和组合方式不限于上述列举。
在一些实施方式中，所述试剂包括检测所述目标区域的引物对以及检测探针。
在一些实施方式中，所述检测试剂选自如下引物对及检测探针组合中的一个或者多个：
(1)检测所述区域1的检测引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，以及检测探针如SEQ ID No.3所示；
(2)检测所述区域2的检测引物对如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，以及检测探针如SEQ ID No.6所示；
(3)检测所述区域3的检测引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，以及检测探针如SEQ ID No.9所示；
(4)检测所述区域4的检测引物对如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，以及检测探针如SEQ IDNo.12所示；
(5)检测所述区域5的检测引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，以及检测探针如SEQ IDNo.15所示；
(6)检测所述区域6的检测引物对如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示，以及检测探针如SEQ IDNo.18所示；和，
(7)检测所述区域7的检测引物对如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，以及检测探针如SEQ IDNo.21所示。
在一些实施方式中，上述检测探针为荧光探针。作为示例，上述检测探针包括淬灭基团和荧光基团。所述荧光基团例如FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE、Quasar 705等。所述淬灭基团例如MGB、BHQ1、BHQ2及BHQ3等。当包括多个不同的检测探针时，每个荧光探针含有不同的荧光基团。在一些实施方式中，检测试剂包括至少一个检测CYTH2基因目标区域的第一检测探针和至少一个检测SIX3基因中目标区域的第二检测探针，第一检测探针和第二检测探针采用不同的荧光基团，以实现两个基因荧光信号的分别检测。
本申请的第二方面
本申请提供一种子宫内膜癌或其癌前病变诊断用试剂盒，包括第一方面中所述的试剂。在一些实施方式中，所述试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂和DNA提取试剂中的一种或者多种。其中，将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂可以是亚硫酸氢盐试剂，例如可以是：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，或其任意组合。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括扩增试剂，可用于实现PCR反应，该扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。该扩增试剂可与第一方面中的引物对和探针共同形成PCR扩增反应体系，在预定PCR反应体系下实现实时荧光定量PCR反应。扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶可以是商品化的，Mg2+可以是氯化镁。本领域可以理解，对该扩增试剂的具体成分没有特别的限定，能够实现PCR反应的进行即可。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照和/或参比基因。当包括参比基因时，试剂盒还包括检测参比基因相关的引物对和检测探针。可以理解，参比基因的检测探针具有和目标区域的检测探针不同的荧光基团和淬灭基团。
本申请的第三方面
本申请提供第一方面中所述的检测试剂或第二方面中所述的试剂盒在制备子宫内膜癌或者其癌前病变诊断产品中的应用。
可通过各种评估检测DNA甲基化水平的方法实现该应用，只要可以得到样本中目标区域的甲基化水平即可。评估检测DNA甲基化水平的方法包括但不限于甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率熔解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在一些实施例中，所述诊断产品包括上述检测试剂，或包括上述试剂盒。该诊断产品用于检测离体生物样本，所述离体生物样本包括细胞样本、组织样本或者血液样本。细胞样本可以是子宫颈脱落细胞、子宫内膜脱落细胞等。组织样本可以是子宫内膜组织或手术切除的病变组织。血液样本可以是全血样本或经分离的血浆样本。相应地，诊断产品当中可提供帮助获取上述样本的取样装置，可以是本领域已知的具备相应功能的各类医疗器械。
在临床应用中，可先获取来源于受试者的离体生物样本，并进行目标DNA提取、亚硫酸氢盐转化、纯化，得到经亚硫酸氢盐转化后的DNA，然后用本申请提供的试剂或试剂盒检测该DNA中目标区域的甲基化水平，进而判断该生物样本中目标区域的DNA片段是否发生甲基化异常的变化。其中，目标DNA提取、亚硫酸氢盐转化、纯化均可采用本领域已知的方法或商品化试剂盒予以实现。对于是否发生甲基化异常变化的判断，通常是指与健康个体相比，是否发生甲基化水平升高或者甲基化水平降低。在本申请中，目标区域在患病个体中可能呈现高甲基化。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
本实施例提供用于子宫内膜癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合1，核苷酸组合1包括SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合1可检测CYTH2基因上Chr19:48480348-48480514bp区域正链(区域1)的甲基化。
区域1正链碱基序列如下(5’-3’)：
CGCGAGTTGTAGTCCCTCCTGCCCGCTGTGTTCGCTTTTGAGCTCTCCGATGGGATGCGGCGCTTCGGAATTTCGGGCTTTGATCCCTGTCCCGCCCTTGGCCACAGGCACCTGCCGGCCTGAAGGCCCCCGCGGTGGGGGTACCCTGCGCCCCTCCGCGGGAAGG(SEQ ID NO.22)
SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr19:48480348、Chr19:48480350、Chr19:48480371、Chr19:48480395、Chr19:48480405、Chr19:48480408、Chr19:48480413、Chr19:48480496、Chr19:48480504、Chr19:48480506位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例2
本实施例提供用于子宫内膜癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合2，核苷酸组合2包括SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合2可检测CYTH2基因上Chr19:48480762-48480910bp区域正链(区域2)的甲基化。
区域2正链碱基序列如下(5’-3’)：
CGGAGTCATCGACCCAAGAAGGTCGTGGGAGATGAGGTCCCAGGGTAAACAGCGGGTCCCGCCACTATGTCACCCTTTCCTGCCGCCTCCCCGGATGAACTGCATGCAGGGCGGCCGGCTCCGTGGCAGGCAGAGGCAGGAAGAGGCGC(SEQ ID NO.23)
SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr19:48480762、Chr19:48480771、Chr19:48480785、Chr19:48480814、Chr19:48480821、Chr19:48480908、Chr19:48480910位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例3
本实施例提供用于子宫内膜癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合3，核苷酸组合3包括SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合3可检测CYTH2基因上Chr19:48480812-48480989bp区域负链(区域3)的甲基化。
区域3负链碱基序列如下(5’-3’)：
CGGCCCAGGCCCCACGCGACCGGCCGCCTGCCTCTGCCCTCCCCTCCCGCCGCACTCCCCTCTTCGCCACCAGCGGGCTCCGCGCCTCTTCCTGCCTCTGCCTGCCACGGAGCCGGCCGCCCTGCATGCAGTTCATCCGGGGAGGCGGCAGGAAAGGGTGACATAGTGGCGGGACCCG(SEQ ID NO.24)
GSEQ ID NO.7-9所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr19:48480813、Chr19:48480820、Chr19:48480907、Chr19:48480909、Chr19:48480916、Chr19:48480925、Chr19:48480969、Chr19:48480973、Chr19:48480975、Chr19:48480989位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例4
本实施例提供用于子宫内膜癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合4，核苷酸组合4包括SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合4可检测CYTH2基因上Chr19:48480601-48480784bp区域负链(区域4)的甲基化。
区域4负链碱基序列如下(5’-3’)：
CGACCTTCTTGGGTCGATGACTCCGTTTCCCTGGCACCTGTGGGAAAGAGAAGTGGGGAATTCTATTTTCTCATTTGGAACTCCATTTCCCACCAGCCCCCGGGGCCGCGGCGGTCAAAGCCTCCTCTACCCTCCACAAAAGTACGGGATCTGACTAAGAAAAAGAAGACAAACGCCGCCACGG(SEQ ID NO.25)
SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr19:48480603、Chr19:48480608、Chr19:48480611、Chr19:48480673、Chr19:48480676、Chr19:48480678、Chr19:48480684、Chr19:48480761、Chr19:48480770、Chr19:48480784位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例5
本实施例提供用于子宫内膜癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合5，核苷酸组合5包括SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合5可检测CYTH2基因上Chr19:48480399-48480586bp区域负链(区域5)的甲基化。
区域5负链碱基序列如下(5’-3’)：
GCGACGCCCGGAAAAACCTCGGGTCTGGGTCACCGTGGCTTTGGCGCCGCACAGCCTGCCGATAACTGTAGTCCACCTTCCCGCGGAGGGGCGCAGGGTACCCCCACCGCGGGGGCCTTCAGGCCGGCAG GTGCCTGTGGCCAAGGGCGGGACAGGGATCAAAGCCCGAAATTCCGAAGCGCCGCATC(SEQ IDNO.26)
SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr19:48480404、Chr19:48480407、Chr19:48480412、Chr19:48480420、Chr19:48480495、Chr19:48480503、Chr19:48480505、Chr19:48480567、Chr19:48480578、Chr19:48480582、Chr19:48480585位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例6
本实施例提供用于子宫内膜癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合6，核苷酸组合6包括SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合6可检测SIX3基因上Chr2:44944407-44944671bp区域正链(区域6)的甲基化。
区域6正链碱基序列如下(5’-3’)：
CTCCCCAAGCGGCCGGGCTCGGGTTCTGCCTCTCCTCCGAGGCCAGCCTCTATCTGAGAAGACTTGGGATGCTCCCGAAAGCGGAATGGGGAGCGGCGGCGCGGGGGAGCCGGGTGGCGGGCCTCTGTGTCAGGGCGGGCGCGGATCTCTTTCTCCCGCAGGCTCCAGCACCAGGCCATTGGACCGAGCGGCATGCGCTCGC(SEQ ID NO.27)
SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr2:44944416、Chr2:44944420、Chr2:44944426、Chr2:44944482、Chr2:44944488、Chr2:44944500、Chr2:44944591、Chr2:44944595、Chr2:44944602、Chr2:44944606位置上胞嘧啶的甲基化。
实施例7
本实施例提供用于子宫内膜癌及癌前病变诊断或辅助诊断的试剂盒，其包括核苷酸组合7，核苷酸组合7包括SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸，具体序列见表1。该核苷酸组合7可检测SIX3基因上Chr2:44944523-44944700bp区域负链(区域7)的甲基化。
区域7负链碱基序列如下(5’-3’)：
GCGCGCTCCGTCAGGCTGGACACGCTGGTGGTCGGGCTGGCCGCCGTGGACGGCGACTCTGCC GAGCCGTGCGTGGGGCAGCCGGGCTCGGCCAGCGAGCGCATGCCGCTCGGTCCAATGGCCTGGTGCT GGAGCCTGCGGGAGAAAGAGATCCGCGCCCGCCCTGACACAGAGGCCC(SEQ ID NO.28)
SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr2:44944523、Chr2:44944541、Chr2:44944545、Chr2:44944547、Chr2:44944594、Chr2:44944601、Chr2:44944605、Chr2:44944612、Chr2:44944618、Chr2:44944678、Chr2:44944692、Chr2:44944697、Chr2:44944699位置上胞嘧啶的甲基化。
表1、各目的基因区域的引物对和探针序列
Figure BDA0004022585720000071
Figure BDA0004022585720000081
实施例8
利用甲基化荧光定量PCR法分析基于目标区域的甲基化水平诊断子宫内膜癌组织样本的性能。
发明人发现，通过检测子宫内膜癌患者的肿瘤组织样本，选自Chr19:48480348-48480989bp任一区域及Chr2:44944407-44944700bp的任一区域的组合物的甲基化水平，可以有效区分子宫内膜癌样本和健康组织样本，具体的检测过程如下所示。
1.组织样本的收集
共收集了40例经病理检测确诊为子宫内膜癌患者的癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本40例，以及非典型性子宫内膜增生患者病理组织样本55例。所有的组织样本为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有组织样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者签署了知情同意书，所有组织样本采用匿名化处理。
2.样本DNA的提取
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的转化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤如下所示：加入40μL提取的DNA溶液到200μL PCR管，加入110μL转化混合液，混匀后置于PCR仪中，设置程序为：95℃10min，64℃90min，4℃1h。
4.样本DNA的纯化
1)将转化产物转入2mL离心管，加入600μL结合液及10μL磁珠，混匀静置结合15min，期间每3min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。
2)加入600μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。
3)加入800μL脱硫剂，涡旋混匀20s分散磁珠，室温静置15min脱硫，期间每5min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态。
4)加入800μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。
5)重复步骤4)一次。
6)短暂离心将液体收集至管底，将离心管置于磁力架上，小心吸尽上清；开盖于25℃放置约5min至磁珠表面无光泽。
7)加入30μL洗脱液TE，涡旋使磁珠充分悬浮于洗脱液中，56℃孵育10min，期间每3min涡旋混匀一次促进核酸充分洗脱。
8)短暂离心，将离心管置于磁力架上静置2min，转移DNA溶液至新的离心管中。
5.甲基化荧光定量PCR反应
为了保证荧光定量PCR反应的扩增效率位于95％-105％之间，且没有非特异性扩增和引物二聚体出现，分别以亚硫酸氢盐转化后Chr19:48480348-48480989bp及Chr2:44944407-44944700bp的序列为模板，设计多对用于甲基化荧光定量PCR反应的引物对。然后对所述引物对进行验证，使用SYBR Green PCR体系扩增目的片段，通过溶解曲线和标准曲线分析，筛选到满足上述要求的5对用于扩增Chr19:48480348-48480989bp和2对用于扩增Chr2:44944407-44944700bp的部分区域的引物对，并针对每对引物设计对应的Taqman检测探针，用于Taqman PCR反应体系。各个引物对和探针所检测的目标区域及检测各目标区域的引物对和检测探针如表1所示。目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM或ROX，3’端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。
阴性对照和阳性对照：在进行PCR反应检测组织样本的过程中，阴性对照和阳性对照也应同时进行检测，阴性对照管的DNA模板为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板的制备方法为：将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒；将目标区域进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。若只检测单一区域的甲基化水平，阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含检测区域的人工合成质粒，二者1:1混合而成；若按照表3检测组合物的甲基化水平，则阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含一个目的区域的人工合成质粒和103拷贝/微升的含另一个目的区域的人工合成质粒，三者1:1:1混合而成。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照各基因的Ct值应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
PCR反应体系如表2所示。PCR反应程序如表3所示。
表2、PCR反应体系
组分 规格 体积(μL)
Platinum II PCR缓冲液 5× 5
dNTPs 各2.5mM 3
CYTH2区域上游引物 10μM 0.5
CYTH2区域下游引物 10μM 0.5
CYTH2区域探针 10μM 0.5
SIX3区域上游引物 10μM 0.5
SIX3区域下游引物 10μM 0.5
SIX3区域探针 10μM 0.5
ACTB上游引物 10μM 0.5
ACTB下游引物 10μM 0.5
ACTB探针 10μM 0.5
PlatinumTMII Taq Hot-Start DNA Polymerase / 0.5
待测样本DNA / 5
超纯水 / 补至25
表3、PCR反应程序
Figure BDA0004022585720000091
6.PCR结果分析
根据各个目的区域检测的Ct值来判断待测组织样本的甲基化水平。对于组织样本，在扩增某一区域的Ct值≤38的条件下，则认为该组织样本中此区域为甲基化阳性，在扩增某一区域的Ct值＞38的条件下，则认为该组织样本中此区域为甲基化阴性。在检测单一区域的过程中，在待测组织样本在该区域为甲基化阳性的条件下，该组织样本为癌症阳性样本，在待测组织样本在该区域为甲基化阴性的条件下，该组织样本为癌症阴性样本。在检测区域组合的过程中，在待测组织样本在区域组合中至少一个区域为甲基化阳性的条件下，该组织样本为癌症阳性样本，仅在待测组织样本在构成区域组合的多个区域都为甲基化阴性，该组织样本为癌症阴性样本。
利用甲基化荧光定量PCR检测的方法，通过检测区域1-区域7的甲基化水平来诊断子宫内膜癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性如表4所示；通过检测区域1-5分别与区域6-7任一区域的组合的甲基化水平来诊断子宫内膜癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性如表5所示。
表4、分别用区域1-区域7在组织样本中检测子宫内膜癌及癌前病变的灵敏度和特异性
Figure BDA0004022585720000101
表5、区域组合在组织样本中的甲基化状态及用其诊断的灵敏度和特异性
Figure BDA0004022585720000102
由表4可以看出，区域1-区域7任意区域用来检测子宫内膜癌的灵敏度、特异性均高于85％，最高可达90％以上，检测效果较好。由表5可以看出，在组织样本中，在改用检测区域1-5分别与区域6-7任一区域的组合的甲基化水平的条件下，其诊断子宫内膜癌癌组织样本的灵敏度相比单区域检测得到了显著提升，其中D、H组合方式灵敏度最高，对于癌组织的检测灵敏度达到97.5％，同时，对于癌前病变的灵敏度也能达到92.73％；此外，区域组合的特异性也能够达到90％。
实施例9
利用甲基化荧光定量PCR法分析区域组合诊断子宫内膜癌及癌前病变患者子宫内膜脱落细胞的性能。
通过检测子宫内膜癌及癌前病变患者的子宫内膜脱落细胞，选自Chr19:48480348-48480989bp任一区域及Chr2:44944407-44944700bp的任一区域的组合物的甲基化水平，可以有效区分子宫内膜癌及癌前病变患者和正常人，具体的检测过程如下所示。
1.子宫内膜脱落细胞样本的收集
共收集经病理检测确诊的子宫内膜癌患者的子宫内膜脱落细胞35例，非典型性子宫内膜增生患者子宫内膜脱落细胞55例，子宫肌瘤患者子宫内膜脱落细胞54例。所有细胞样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者签署了知情同意书，所有细胞样本采用匿名化处理。
2.样本DNA提取
利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210836号)进行脱落细胞样本DNA的提取，具体步骤如下所示。
1)裂解结合
准备洁净的5mL离心管，向其中加入100μL蛋白酶K。脱落细胞样本混匀后取2mL至准备好蛋白酶K的离心管中，依次加入2mL裂解结合液和20μL磁珠，上下颠倒混匀后，置于混匀仪上于25℃裂解30min，保持磁珠处于悬浮状态。
2)洗涤
将离心管置于磁力架上，吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。小心吸除废液，加入2mL洗涤液，涡旋混匀10次以上，使磁珠完全分散，再次吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。
3)漂洗
小心吸除废液，先加入500μL漂洗液将磁珠洗涤至底部后将磁珠悬浮液转移至新的2mL离心管中，再加入500μL漂洗液将5mL离心管管壁上残余的磁珠完全洗涤到底部，瞬时离心后转移全部磁珠悬浮液到2mL离心管中，涡旋混匀10次以上使磁珠完全分散，吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。重复漂洗一次。
4)洗脱
取下离心管短暂离心收集残余的液体，置于磁力架上吸磁完成后，用小枪头吸去残余的液体。将离心管开盖放置5min使磁珠表面无光泽。加入50μL洗脱液TE(Tris-EDTAbuffer solution，TE缓冲液)，轻轻震荡使磁珠分散，置于56℃洗脱10min，每隔3min取出轻轻震荡，使磁珠处于悬浮状态。
5)收集DNA溶液
取出离心管，离心收集管盖及管壁上的液体，置于磁力架上吸磁1min，小心吸取上清即得DNA溶液。
3.样本DNA转化、纯化方法同实施例8。
4.甲基化荧光定量PCR的检测方法同实施例8。
在本实施例中检测区域组合在该细胞样本中的甲基化水平。
5.甲基化荧光定量PCR结果分析
Ct值的读取、质量控制等同实施例8。
PCR结果分析和判读方法：对于脱落细胞样本，若待测样本在某一检测区域的Ct值≤38时，即认为该样本在此区域为甲基化阳性，若待测样本在某一检测区域的Ct值>38，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。在检测组合物时，若待测样本在组合物中至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本，仅当待测样本在构成组合物的两个区域都为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。
利用甲基化荧光定量PCR检测的方法，通过检测区域1-5分别与区域6-7任一区域的组合的甲基化水平来诊断子宫内膜脱落细胞的灵敏度和特异性如表6所示。
表6、区域组合在脱落细胞样本中的甲基化状态及用其诊断的灵敏度和特异性
Figure BDA0004022585720000111
由表6可以看出，利用甲基化荧光定量PCR的方法，采用子宫内膜脱落细胞，在同时检测区域1-5分别与区域6-7任一区域的组合的甲基化水平的条件下，对于子宫内膜癌仍能够保持良好的灵敏度和特异性，其中区域2、4分别与区域7组合时，灵敏度可达97.14％。同时，该组合在检测癌前病变时也展现出明显优势，对于非典型性子宫内膜增生的检测灵敏度最高可达89.09％。在非癌患者样本中该组合的特异性表现较好，D、H组合物的总特异性达到98.15％。综合来看，利用组合方式D、H的区域组合的甲基化水平进行检测，其诊断性能最佳。
实施例10
利用甲基化荧光定量PCR法分析区域组合诊断子宫内膜癌及癌前病变患者血浆样本的性能。
1.血浆样本的收集
共收集子宫内膜癌血浆样本30例，健康人血浆样本45例。所有样本由专业医务人员收集并经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.DNA模板的提取：
采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。
3.甲基化荧光定量PCR的检测方法同实施例8。
4.甲基化荧光定量PCR结果分析
Ct值的读取、质量控制等同实施例8。
PCR结果分析和判读方法：在待测血浆样本在某一检测区域的Ct值≤45的条件下，即认为该血浆样本在此区域为甲基化阳性，在待测血浆样本在某一检测区域的Ct值>45的条件下，则认为该血浆样本在此区域为甲基化阴性。在检测区域组合的过程中，在待测血浆样本在区域组合中至少一个区域为甲基化阳性的条件下，则认为该血浆样本为癌症阳性样本，仅当待测血浆样本在构成区域组合的多个区域都为甲基化阴性，则认为该血浆样本为癌症阴性样本。
利用甲基化荧光定量PCR检测的方法，通过检测区域1-5分别与区域6-7任一区域的组合物的甲基化水平来诊断血浆样本的灵敏度和特异性如表7所示。
表7、区域组合在血浆样本中的甲基化状态及用其诊断的灵敏度和特异性
Figure BDA0004022585720000121
从表7可以看出，这些组合对子宫内膜癌血浆样本和健康人血浆样本可以实现较好的区分，其各区域的检测灵敏度均在77.78％以上，其中，D、H组合值灵敏度明显高于其他区域，达到86.11％。而且，在血浆样本中，上述组合的特异性也较高，D组合的特异性达100％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于子宫内膜癌或其癌前病变诊断的DNA甲基化水平检测试剂，其特征在于，包括检测CYTH2基因中的目标区域或/和SIX3基因中的目标区域的甲基化水平的试剂，
所述CYTH2基因中的目标区域为区域I或者区域I的部分区域，
所述SIX3基因中的目标区域为区域II或者区域II的部分区域，
以GRCh38.p14为参考，所述区域I为Chr19:48480348-48480989，或/和，所述区域II为Chr2:44944407-44944700。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述区域I的部分区域选自如下定义的区域1至区域5中的一个或者多个：
区域1为Chr19:48480348-48480514，正链，
区域2为Chr19:48480762-48480910，正链，
区域3为Chr19:48480812-48480989，负链，
区域4为Chr19:48480601-48480784，负链，和
区域5为Chr19:48480399-48480586，负链；
可选地，所述区域II的部分区域选自如下定义的区域6和区域7中的一个或者多个：
区域6为Chr2:44944407-44944671，正链，和，
区域7为Chr2:44944523-44944700，负链。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括检测所述目标区域的引物对以及检测探针。
4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂选自如下引物对及检测探针组合中的一个或者多个：
(1)检测所述区域1的引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，以及检测探针如SEQID No.3所示；
(2)检测所述区域2的引物对如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，以及检测探针如SEQID No.6所示；
(3)检测所述区域3的引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，以及检测探针如SEQID No.9所示；
(4)检测所述区域4的引物对如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，以及检测探针如SEQ ID No.12所示；
(5)检测所述区域5的引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，以及检测探针如SEQ ID No.15所示；
(6)检测所述区域6的引物对如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示，以及检测探针如SEQ ID No.18所示；和，
(7)检测所述区域7的引物对如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，以及检测探针如SEQ ID No.21所示。
5.一种子宫内膜癌或其癌前病变诊断用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂和DNA提取试剂中的一种或者多种；
可选地，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种；
可选地，所述试剂盒还包括获取离体生物样本的取样装置。
7.权利要求1至4任一项所述的检测试剂或权利要求5至6任一项所述的试剂盒在制备子宫内膜癌或其癌前病变诊断产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述检测试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率熔解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述诊断产品用于检测离体生物样本，所述离体生物样本包括细胞样本、组织样本或者血液样本。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌前病变包括非典型性子宫内膜增生。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113557308A (zh) * 2019-01-24 2021-10-26 梅约医学教育与研究基金会 检测子宫内膜癌

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