CN108977543B

CN108977543B - 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂

Info

Publication number: CN108977543B
Application number: CN201810884870.8A
Authority: CN
Inventors: 王美丛; 刘晶; 秦楠
Original assignee: Shanghai Realbio Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Realbio Technology Co ltd
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: WO2020029567A1; CN108977543A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于联合检测SDC2和SFRP2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂。本发明以粪便为检测样本，使用SDC2基因和SFRP2基因联合作为生物标志物，检测SDC2基因和SFRP2基因的甲基化水平。结果表明，SDC2和SFRP2基因在粪便中检出的甲基化水平与结直肠癌发病保持了极高的关联度，肠癌检测灵敏度为94.74%，特异性为96.67%。本发明的检测方法准确快速、简单，可实现无创性结直肠癌筛查和早期诊断。

Description

一种基于联合检测SDC2和SFRP2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于联合检测SDC2和SFRP2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂。

背景技术

结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，通过人群早期筛查和诊断结直肠癌是疾病防治的关键。目前临床上结直肠癌筛查主要通过便隐血实验和肠镜检查两种技术进行检测。便隐血实验是检测大便中的血红蛋白，若多次、持续地阳性反应表示消化道出血，应做进一步检查以警惕肠道肿瘤的发生。该技术虽方便无创，但易受饮食等影响，进而影响检测结果的准确性。此外，肠镜检查是目前最有效可靠的诊断方法，绝大多数早期肠癌患者可由内镜检查发现并确诊。但该诊断方法费时费力，检查费用高，且具有侵入性，人群肠镜顺应性低，较难大规模推广。因此亟需发掘新的准确性高、无创、简单的筛查方法及方式。

发明内容

为解决现有结直肠癌诊断技术所存在的具有侵入性、费时费力、准确性低等问题，本发明提供一种无创的基于联合检测SDC2基因和SFRP2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂及方法，以实现准确、简单地诊断早期结直肠癌。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面，提供了SDC2基因和SFRP2基因联合用于制备或筛选结直肠癌检测试剂的用途。

所述检测试剂可用于检测结直肠癌。

在一种实施方式中，SDC2基因和SFRP2基因联合作为生物标志物。

在一种实施方式中，所述结直肠癌检测试剂用于结直肠癌的早期诊断。

需要说明的是，所述结直肠癌检测试剂并不限定为必须为液体形式。

在一种实施方式中，所述结直肠癌检测试剂包括特异性识别SDC2基因的试剂和特异性识别SFRP2基因的试剂。

在一种实施方式中，特异性识别SDC2基因的试剂包括SDC2基因检测引物及探针。所述SDC2基因检测引物可特异性扩增SDC2基因启动子区CpG岛。

在一种实施方式中，所述SDC2基因检测引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

在一种实施方式中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

在一种实施方式中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一种实施方式中，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为MGB。

在一种实施方式中，特异性识别SFRP2基因的试剂包括SFRP2基因检测引物及探针。所述SFRP2基因检测引物可特异性扩增SFRP2基因启动子区CpG岛。

在一种实施方式中，所述SFRP2基因检测引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5。

在一种实施方式中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第二方面，提供特异性识别SDC2基因的试剂和特异性识别SFRP2基因的试剂联合用于制备结直肠癌检测试剂盒的用途。

所述检测试剂盒可用于检测结直肠癌。

在一种实施方式中，所述结直肠癌检测试剂盒用于结直肠癌的早期诊断。

需要说明的是，所述特异性识别SDC2基因的试剂和特异性识别SFRP2基因的试剂并不限定为必须为液体形式。

本发明的第三方面，提供一种结直肠癌检测试剂盒，至少包括特异性识别SDC2基因的试剂和特异性识别SFRP2基因的试剂。

所述检测试剂盒可用于检测结直肠癌。

在一种实施方式中，所述的试剂盒中还包括对照，所述对照为β-actin检测引物及探针。

在一种实施方式中，所述β-actin检测引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一种实施方式中，所述探针中标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

在一种实施方式中，所述探针5’端标记的荧光报告基团为VIC荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为MGB。

基于本发明所述试剂盒是采用甲基化定量PCR技术来进行检测的，所以，试剂盒中还可以包括其他一些甲基化定量PCR所需要的常规试剂，例如DNA提取试剂、亚硫酸盐、去离子水、Taq mix buffer等中的一种或多种。由于此类甲基化定量PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

进行甲基化定量PCR时的qMSP体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的通用qMSP反应液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可以含有Taq mixbuffer、去离子水。加入本发明的引物及探针、亚硫酸盐转化后的待检样本DNA即可获得qMSP体系。

本发明的第四方面，提供前述结直肠癌检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本基因组DNA；

(2)将待测样本基因组DNA进行亚硫酸盐转化；

(3)采用前述结直肠癌检测试剂盒中的试剂对亚硫酸盐转化后的待测样本基因组DNA进行甲基化定量PCR检测；

(4)对检测结果进行分析。

在本发明的第五方面，提供了一种诊断结直肠癌的方法，包括检测样本中SDC2基因和SFRP2基因的甲基化水平。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明所提供的诊断方法以粪便作为检测样本，样品易获得，取样过程方便简单，不会对病人造成任何痛苦和影响。相较于血液，测试者可在家中取样，无需前往医院，且无需特定的邮寄方式(血液需离心为血浆后冰上邮寄)，省时省力。

(2)甲基化异常是肿瘤发生过程中的早期事件，本发明利用甲基化检测的方法可以实现早期结直肠癌的诊断筛查，有效降低结直肠癌的发生率和病死率。

(3)本发明采用联合检测SDC2和SFRP2基因甲基化的方法，避免了单基因甲基化检测所存在的灵敏度和特异性低的问题，肠癌检测灵敏度为94.74％，特异性为96.67％，提高了整体的检测灵敏度和特异性。

(4)本发明采用荧光定量PCR进行甲基化DNA检测，设计了特异性的引物和探针，并选用β-actin作为内参基因，保证了检测的特异性和高灵敏度，且无需在PCR后进行电泳、杂交等操作，减少了污染，进一步提高了检测准确性。

附图说明

图1：为实施例1中的内参基因ACTB检测的荧光定量扩增曲线。

图2：为实施例1中的SDC2基因甲基化水平的荧光定量扩增曲线。

图3：为实施例1中的SFRP2基因甲基化水平的荧光定量扩增曲线。

图4：为实施例2中的SFRP2基因检测结直肠癌的ROC曲线。

图5：为实施例2中的SDC2基因检测结直肠癌的ROC曲线。

图6：为实施例2中的SFRP2及SDC2基因联合检测结直肠癌的ROC曲线。

具体实施方式

近年来研究表明DNA甲基化是结直肠癌发生发展中的一个早期事件，因此特异基因的甲基化可作为肿瘤早期诊断的分子标记。甲基化基因对结直肠癌诊断的敏感性和特异性均明显优于传统筛查指标如血癌胚抗原和粪便潜血等。而且研究发现相比较于单个基因甲基化检测，多基因联合可覆盖多种肿瘤形成的分子途径，进一步有效提高检测敏感性。

本发明首次将SDC2基因及SFRP2基因联合作为生物标志物用于制备或筛选结直肠癌早期诊断试剂。所述结直肠癌早期诊断试剂可以通过甲基化特异性定量PCR进行联合检测粪便中SDC2和SFRP2基因甲基化水平，达到无创、灵敏、简单、快速地筛查诊断结直肠癌及癌前病变的目的。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECμLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECμLARBIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODSIN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，SanDiego，1999；和METHODS IN MOLECμLAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1.试剂盒的制备及使用

本发明的试剂盒中，包括SDC2基因检测引物及探针、SFRP2基因检测引物及探针，其核苷酸序列如下表1-1所示：

表1-1

所述试剂盒中还可以包括对照，所述对照为β-actin检测引物及探针，其核苷酸序列如下表1-2所示：

表1-2

实验过程：

一、粪便样本的DNA提取

具体的提取方法可包括如下步骤：按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒标准操作流程：向样本中加入1ml InhibitEX Buffer，涡旋1min至样本充分均质，16000g离心1min；取25μl蛋白酶K至新的离心管，并吸取600μl前一步上清至蛋白酶K管，加入600μlBuffer AL并涡旋15s，置于70℃孵育10min；加入600μl乙醇，并涡旋混匀，分三次QIAampspin column，每次在16000g离心1min；小心向柱上加入500μl Buffer AW1，在16000g离心1min，除去收集管内液体；向柱上加入500μl Buffer AW2，在16000g离心3min，除去收集管内液体；继续在16000g离心3min，将QIAamp spin column移至新的1.5ml离心管，加入200μlBuffer ATE，室温放置1min，并在16000g离心1min，获得DNA，用于后续操作。

此处说明的是：粪便中人源DNA的提取采用商业化试剂盒QIAamp Fast DNA StoolMini Kit，货号51604。由此，可确保从粪便样本中获得高产量的DNA，且能够高效去除粪便样本中的PCR抑制剂，适用于下游的检测。

二、亚硫酸盐转化

将上述提取获得的DNA，进行亚硫酸盐转化，获得亚硫酸盐转化后的DNA。

具体的亚硫酸盐转化方法可包括如下步骤：

Zymo Research试剂盒转化流程：上述提取好的20μl DNA样本中加入130μl CTConversion Reagent(现配现用)，涡旋混匀后按照(98℃，10min；64℃，2.5h)的条件进行转化反应；吸附柱中加入600μl M-Binding Buffer，然后再将转化的样本加入体系中，颠倒数次混匀，10000rpm离心30s，吸除下层溶液；向吸附柱中加入100μl M-Wash Buffer，10000rpm离心1min，吸除下层溶液；向吸附柱中200μl M-Desulphonation Buffer，室温放置20min，然后10000rpm离心1min，吸除下层溶液；向吸附柱内加入200μl M-Wash Buffer，10000rpm离心1min，吸除下层溶液；重复上述步骤；将吸附柱转移到新的收集管，加15μl M-Elution Buffer，室温放置5min后，在10000rpm离心1min。获得亚硫酸盐转化后的DNA，用于后续检测。

此处说明的是，根据“亚硫酸氢盐能够将所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变”的原理，对由粪便中提取的宿主DNA进行甲基化处理。所述的DNA甲基化处理采用的商业化试剂盒为ZYMO Research公司生产的EZ DNA MethylationKit，货号D5005。由此，以进一步降低甲基化转化过程中宿主DNA的损失率，提高低拷贝宿主DNA甲基化的检测灵敏度。

三、qMSP检测

利用上述试剂盒中的引物及探针(表1-1及表1-2)对上述亚硫酸盐转化后的DNA进行甲基化定量PCR。

本实施例中，对于同一样本的SDC2基因、SFRP2基因、β-actin分开进行检测，也就是不进行多重检测。

具体地，以SDC2基因检测来说，可先配置用于检测SDC2基因的PCR探针引物预混液，所述PCR探针引物预混液包括：0.1μM SDC2基因检测探针、0.3μM SDC2基因正向引物、0.3μM SDC2基因反向引物，去离子水补足至2μl。

检测SDC2基因的qMSP体系如表1-3所示：

表1-3

以SFRP2基因检测来说，可先配置用于检测SFRP2基因的PCR探针引物预混液，所述PCR探针引物预混液包括：0.1μM SFRP2基因检测探针、0.3μM SFRP2基因正向引物、0.3μMSFRP2基因反向引物，去离子水补足至2μl。

检测SFRP2基因的qMSP体系如表1-4所示：

表1-4

以β-actin检测来说，可先配置用于检测β-actin的PCR探针引物预混液，所述PCR探针引物预混液包括：0.1μMβ-actin检测探针、0.3μMβ-actin正向引物、0.3μMβ-actin反向引物，去离子水补足至2μl。

检测β-actin的qMSP体系如表1-5所示：

表1-5

各基因检测时，qMSP程序如表1-6所示：

表1-6

三种基因ACTB、SDC2、SFRP2荧光定量扩增曲线分别如图1、图2和图3所示，扩增效果良好，可用于后续实验。

实施例2.试剂盒检测肠癌患者样本

一、粪便样本的DNA提取

临床收集38例肠镜及病理检查确诊为肠癌的患者的粪便样本，30例肠镜检查确诊为正常的患者的粪便样本。对所得粪便样本进行DNA提取。

具体的提取方法可包括如下步骤：按照QIAamp Fast DNAStool Mini Kit试剂盒标准操作流程：向样本中加入1ml InhibitEX Buffer，涡旋1min至样本充分均质，16000g离心1min；取25μl蛋白酶K至新的离心管，并吸取600μl前一步上清至蛋白酶K管，加入600μlBuffer AL并涡旋15s，置于70℃孵育10min；加入600μl乙醇，并涡旋混匀，分三次QIAampspin column，每次在16000g离心1min；小心向柱上加入500μl Buffer AW1，在16000g离心1min，除去收集管内液体；向柱上加入500μl Buffer AW2，在16000g离心3min，除去收集管内液体；继续在16000g离心3min，将QIAamp spin column移至新的1.5ml离心管，加入200μlBuffer ATE，室温放置1min，并在16000g离心1min，获得DNA，用于后续操作。

二、亚硫酸盐转化

具体的亚硫酸盐转化方法可包括如下步骤：

三、qMSP检测

采用实施例1中的试剂盒对上述亚硫酸盐转化后的DNA进行甲基化定量PCR。

检测结果判定标准为：

首先要保证样本符合要求：内参基因符合要求(内参≤35)，且其中一个或两个目的基因满足扩增曲线正常呈指数增长且ΔCt≤12时；然后将两个基因SDC2基因、SFRP2基因分别赋予不同的权重，通过逻辑运算公式，进行结果判定，其中，a，b和c通过临床测试数据分布测定。

逻辑运算公式为：

Score＝e^p/(1+e^p)

p＝aΔCt(SFRP2)+bΔCt(SDC2)+c

继而可得到该样本的风险分值Score值，阈值设定为0.6944，大于等于阈值分值时即计为阳性；Score值小于阈值时则计为阴性。

检测SDC2基因的qMSP体系如表2-1所示：

表2-1

检测SFRP2基因的qMSP体系如表2-2所示：

表2-2

检测β-actin的qMSP体系如表2-3所示：

表2-3

各基因检测时，qMSP程序如表2-4所示：

表2-4

分别利用SFRP2、SDC2单独作为生物标志物，以及利用SDC2&SFRP2两种基因联合作为生物标志物，对共68例样本进行诊断和分析。

检测结果分别如图4、图5及图6所示，SFRP2单独作为生物标志物时，其检测结直肠癌的灵敏度为86.84％，特异性为93.33％，受试者曲线下面积为0.963；SDC2单独作为生物标志物时，其检测结直肠癌的灵敏度为86.84％，特异性为86.67％，受试者曲线下面积为0.955；SDC2&SFRP2两种基因联合作为生物标志物时，其检测结直肠癌的灵敏度为94.74％，特异性为96.67％，受试者曲线下面积为0.980。

注：

灵敏度(真阳性率，sensitivity)＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％。

指正确判断病人的程度，即实际有病而被正确诊断的百分比。

特异性(真阴性率，specificity)＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。

指正确判断非病人的程度，即实际无病而被正确诊断为无病的百分比。

由上述结果可得：利用SDC2及SFRP2两种基因联合作为生物标志物进行联合检测可以明显提高早期肠癌的检出率。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海锐翌生物科技有限公司

<120> 一种基于联合检测SDC2和SFRP2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂

<130> 184525

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgcggtatt ttgtttcgga tt 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgctacttac aaccaaaaca aaacg 25

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtcgagcgt tgggta 16

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtatttagc gaagagagcg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaacccaaa caacaatacg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagttcgaat ttcggtcgtt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgatggagg aggtttagta a 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaataaaac ctactcctcc ct 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacccaacac acaataacaa acaca 25

Claims

1.特异性检测SDC2基因启动子甲基化水平和SFRP2基因启动子甲基化水平的试剂用于制备结直肠癌检测试剂的用途；

特异性识别SDC2基因启动子甲基化水平的试剂包括SDC2基因启动子甲基化检测引物及探针；

特异性识别SFRP2基因启动子甲基化水平的试剂包括SFRP2基因启动子甲基化检测引物及探针；

其中

(1)所述SDC2基因启动子甲基化检测引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2; (2) 所述特异性识别SDC2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示; (3) 所述SFRP2基因启动子甲基化检测引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO. 5; (4) 所述特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示；

包括以粪便作为检测样本；

其中，用于特异性识别SDC2基因启动子甲基化的PCR探针引物预混液包括：0.1μM的探针、0.3μM的正向引物和0.3μM的反向引物；用于特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的PCR探针引物预混液包括：0.1μM的探针、0.3μM的正向引物和0.3μM的反向引物；

SDC2基因启动子甲基化和SFRP2基因启动子甲基化联合作为生物标志物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取检测样本基因组DNA；

(2)将检测样本基因组DNA进行亚硫酸盐转化；

(3) 采用所述结直肠癌检测试剂对亚硫酸盐转化后的检测样本基因组DNA进行甲基化定量PCR检测；

(4) 对检测结果进行分析。

3.根据权利要求1 所述的用途，其特征在于，所述结直肠癌检测试剂用于结直肠癌的早期诊断。

4.特异性识别SDC2基因启动子甲基化的试剂和特异性识别SFRP2基因启动子甲基化水平的试剂用于制备结直肠癌检测试剂盒的用途；

特异性识别SDC2基因启动子甲基化的试剂包括SDC2基因启动子甲基化检测引物及探针；

特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的试剂包括SFRP2基因启动子甲基化检测引物及探针；

其中

(1)所述SDC2基因启动子甲基化检测引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2; (2) 所述特异性识别SDC2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示; (3) 所述SFRP2基因启动子甲基化检测引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO. 5; (4) 所述特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6 所示；

包括以粪便作为检测样本；

其中，用于特异性识别SDC2基因启动子甲基化的PCR探针引物预混液包括：0.1μM的探针、0.3μM的正向引物和0.3μM的反向引物；用于特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的PCR探针引物预混液包括：0.1μM的探针、0.3μM的正向引物和0.3μM的反向引物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，还包括以下特征: (1)所述SDC2基因启动子甲基化检测引物可特异性扩增SDC2基因启动子区CpG岛; (2) 所述SFRP2基因启动子甲基化检测引物可特异性扩增SFRP2基因启动子区CpG岛。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，还包括以下特征:

所述特异性识别SDC2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团;

所述特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，还包括以下特征:

所述特异性识别SDC2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针的5' 端标记有荧光报告基团，3' 端标记有荧光淬灭基团;

所述特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针的5' 端标记有荧光报告基团，3' 端标记有荧光淬灭基团。

8.一种结直肠癌检测试剂盒，由特异性识别SDC2基因启动子甲基化的试剂和特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的试剂组成；

特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的试剂包括SFRP2启动子甲基化基因检测引物及探针；

其中

(1)所述SDC2基因启动子甲基化检测引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2; (2) 所述特异性识别SDC2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示; (3) 所述SFRP2基因启动子甲基化检测引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO. 5; (4) 所述特异性识别SFRP2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述试剂盒以粪便作为检测样本；

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下特征:

(1)所述SDC2基因启动子甲基化检测引物可特异性扩增SDC2基因启动子区CpG 岛;(2) 所述SFRP2基因启动子甲基化检测引物可特异性扩增SFRP2基因启动子区CpG岛。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下特征：

所述特异性识别SDC2基因启动子甲基化的试剂中，所述探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下特征：

12.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括对照，所述对照为β-actin检测引物及探针。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下特征:

(1)所述β-actin检测引物包括正向引物和反向引物; (2) 所述探针中标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下特征:

(1)所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;

(2) 所述探针的5' 端标记有荧光报告基团，3' 端标记有荧光淬灭基团。