CN113981046A - 一种基于定量pcr技术dna甲基化检测方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于定量PCR技术DNA甲基化检测方法及其试剂盒，本发明属于生物技术领域。基于定量PCR技术实现对DNA甲基化的检测，本发明通过利用PCR通过碱基掺入制备不同程度的甲基化DNA片段，然后对其进行定量PCR检测，建立△Ct与DNA甲基化程度之间的对应关系。因此，所述试剂盒通过检测靶基因的△Ct评估靶基因的DNA甲基化程度。本发明为检测DNA表观遗传学修饰差异建立的新的更加便捷的检测方法。经肺癌与结直肠癌血液样本实验验证，所述方法操作简便、检测时间短，并且结果准确可靠，适用于所有类型的甲基化DNA片段的检测，具有极高的应用价值。

Description

一种基于定量PCR技术DNA甲基化检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于定量PCR技术DNA甲基化检测方法及其试剂盒。
背景技术
DNA甲基化成为分子生物学研究重要内容，也是疾病检测的新宠。表观遗传学研究发现，DNA表观修饰在基因调控过程中具有重要的作用，而基因调控很大程度上是由基因表观修饰引起的，其中DNA甲基化是表观修饰研究的热点。很长时间以来，基因异常主要集中于对其结构改变的研究，但基因的结构性改变理论上位于基因表观调控异常之后，其发生的位点与出现的频率具有很大的不确定性，更多的是散发性。另外如基因结构异常DNA的占比很低，针对其检测则变得非常困难。研究表明，相对DNA结构的改变，在基因异常检测中，基因表观修饰改变的范围与占比更大，而且发生的更早，对其检测可极大提高评判的敏感性，目前基因的甲基化由于可操作性强，已成为表观遗传学检测的亮点，已用于分子生物学研究的各个方面。所以研发出高效敏感的DNA甲基化检测新方法，无疑将极大促进表观遗传学与分子生物学研究的进步。
目前常用的DNA甲基化检测方法包括：高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MS-PCR)、甲基化芯片、全基因组DNA甲基化测序、甲基化敏感的限制性内切酶处理联合qPCR分析等。目前，DNA甲基化的检测尽管有不同的方法，绝大多数都是基于亚硫酸盐处理，然后联合下游的检测方法进行的。例如，甲基化特异性的PCR(MSP)、高分辨率溶解曲线法和二代测序法等。其原理是用亚硫酸钠处理将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，进而通过测序或者甲基化特异的PCR进行检测，由于亚硫酸钠所致的转化率差异较大，存在转化不充分现象，致使后续的检测结果变异较大，造成结果的不准确；高分辨率熔解曲线法是在PCR扩增完成后，通过观察溶解曲线的变化来判断DNA是否发生甲基化，因亚硫酸钠处理导致基因结构出现的不同异质性，对结果的判断影响较大，所以该方法分析相对复杂；高通量测序检测方法，首先需要对检测的DNA建库，不仅对DNA的量有要求，而且在建库过程中还会造成部分信息的流失，其它还包括涉及到的成本太高、周期长等因素；甲基化敏感的限制性内切酶处理联合qPCR分析，受到甲基化敏感的限制性内切酶作用位点的限制，即如果检测区域不含有该位点则不能检测。因此，建立高特异性及高灵敏度的DNA甲基化检测方法成为突破甲基化检测瓶颈的迫切需要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于定量PCR技术DNA甲基化检测方法及其试剂盒，具有简单、快速且结果准确可靠的特点。
本发明提供了一种基于定量PCR技术检测DNA甲基化的试剂盒，包括以下组分：
Taq酶预混液体系(Taq酶、缓冲液、dNTP)、靶基因定量PCR检测用引物和探针和用于绘制参考曲线所用的试剂。
优选的，所述用于绘制参考曲线的试剂包括含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP试剂和普通PCR扩增用试剂。
优选的，所述含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP试剂包括等摩尔浓度的dATP、dTTP、dGTP和试剂A；
所述试剂A为5'-m-dCTP和/或dCTP。
优选的，所述试剂A中，5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比包括1:0、1：(1～30)和0:1。
优选的，所述靶基因包括以下一种或几种基因：
APC、SHOX2、Apobec3B、P53、AID、HOXD12、Alu、SDC2、WDR17和ADHFE1。
本发明提供了所述试剂盒在非疾病诊断目的的检测DNA甲基化中的应用。
本发明提供了一种非疾病诊断目的的检测DNA甲基化的方法，包括以下步骤：
1)用所述试剂盒中引物和探针配制定量PCR检测的反应体系，分别经过较高温变性扩增和较低温变性扩增，分别得到较高温变性条件下扩增的CtX1-HT和较低温变性条件下扩增的CtX-LH；
2)将步骤1)中CtX-LH和CtX-HT带入公式I中，得到靶基因的△Ctx；
△Ctx＝CtX-LH–CtX-HT 公式I
其中，CtX-LH表示X基因在较低温变性条件下扩增的Ct值；CtX-HT表示X基因在较高温变性条件下扩增的Ct值，X表示一种靶基因；
3)采用所述试剂盒中用于绘制参考曲线的试剂对靶基因进行不同甲基化DNA程度的片段扩增，所得PCR产物按照步骤1)和步骤2)的方法操作，获得不同甲基化DNA片段的△Ctx'，得到不同比例甲基化胞嘧啶与ΔCtx'之间的线性关系，绘制参考曲线；
4)将步骤2)中靶基因的ΔCtx与步骤3)中参考曲线中ΔCtx'进行比较，得到靶基因中甲基化胞嘧啶的比例，从而判断靶基因的DNA甲基化程度。
优选的，较高温变性扩增的反应条件如下：预变性95℃5min；94℃5s，60～62℃15s，72℃30s，45个循环；
较低温变性扩增的反应条件如下：85～88℃15s，60～62℃15s，72℃30s，18个循环；94℃5s，60～62℃15s，72℃30s，27个循环。
本发明提供了所述试剂盒或所述方法在区分两个研究群体之间的DNA甲基化变化中的应用。
优选的，所述靶基因包括两种以上靶基因时，区分两个研究群体之间的DNA甲基化变化的方法，包括以下步骤：
获得各靶基因的ΔCt后，将群体1样品和群体2样品对应的各靶基因的ΔCt进行统计学分析，得到靶基因联合检测的阈值和权重值公式II，其中权重值公式II是将各靶基因的ΔCt带入公式II中，计算得到各样品的多靶基因联合检测的权重值；
多靶基因联合检测的权重值＝a1×△Ctx1+a2×△Ctx2+......+an×△Ctxn 公式II
其中，a1、a2、an分别为各靶基因统计学分析时得到的对应系数；
两群体之间的定性判定：将群体1样品和群体2样品的权重值与对应样品的阈值比较，权重值低于阈值的样品为低甲基化样本，定义为阴性，权重值高于阈值的样品为高甲基化样本，定义为阳性，然后经统计学分析比较两群体之间差异；
两群体之间的差异性判定：计算各群体1样品的权重值的均值和群体2样品的权重值的均值，经T检验分析，当群体1样品的权重值的均值和群体2样品的权重值的均值呈显著性差异，表明两群体的DNA甲基化差异显著。
本发明提供了一种基于定量PCR技术检测DNA甲基化的试剂盒，包括以下组分：2×Premix Ex TaqTM、靶基因定量PCR检测用引物和探针和用于绘制参考曲线的试剂。所述试剂盒是基于定量PCR技术实现DNA甲基化的检测，本发明证实，利用PCR通过碱基掺入制备不同程度的甲基化DNA片段，然后对其进行定量PCR检测，建立△Ct与DNA甲基化程度之间的关系，即DNA甲基化程度越高，△Ct越大，因此，所述试剂盒通过检测靶基因的△Ct评估靶基因的DNA甲基化程度。所述方法操作简便、检测时间短，并且结果准确可靠，适用于所有类型的甲基化DNA片段的检测，具有极高的应用价值。
附图说明
图1为不同比例甲基化的DNA在低温变性条件下的解链差异；
图2为不同甲基化程度的SHOX2基因片段的△Ct变化曲线，其中横坐标为5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比，纵坐标为△Ct；
图3为SHOX2基因甲基化与检测值关系分析的拟合对数曲线；
图4为不同甲基化程度的P53基因片段的△Ct变化曲线，其中横坐标为5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比，纵坐标为△Ct；
图5为P53基因甲基化与检测值关系分析的拟合对数曲线；
图6为不同甲基化程度的APC基因片段的△Ct变化曲线，其中横坐标为5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比，纵坐标为△Ct；
图7为APC基因甲基化与检测值关系分析的拟合对数曲线；
图8为不同甲基化程度的Apobec3B基因片段的△Ct变化曲线，其中横坐标为5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比，纵坐标为△Ct；
图9为Apobec3B基因甲基化与检测值关系分析的拟合对数曲线；
图10为不同甲基化程度的AID基因片段的△Ct变化曲线，其中横坐标为5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比，纵坐标为△Ct；
图11为AID基因甲基化与检测值关系分析的拟合对数曲线；
图12为不同甲基化程度的HOXD12基因片段的△Ct变化曲线，其中横坐标为5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比，纵坐标为△Ct；
图13为HOXD12基因甲基化与检测值关系分析的拟合对数曲线；
图14为肺癌样本与正常人的检测结果分析，其中a:箱型图；b:ROC曲线分析；
图15为不同甲基化程度的SDC2基因片段的△Ct变化曲线，其中横坐标为5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比，纵坐标为△Ct；
图16为SDC2基因甲基化与检测值关系分析的拟合对数曲线；
图17为不同甲基化程度的WDR17基因片段的△Ct变化曲线，其中横坐标为5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比，纵坐标为△Ct；
图18为WDR17基因甲基化与检测值关系分析的拟合对数曲线；
图19为不同甲基化程度的ADHFE1基因片段的△Ct变化曲线，其中横坐标为5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比，纵坐标为△Ct；
图20为ADHFE1基因甲基化与检测值关系分析的拟合对数曲线；
图21为结直肠癌样本与正常人的检测结果分析，其中a:箱型图；b:ROC曲线分析。
具体实施方式
本发明提供了一种基于定量PCR技术检测DNA甲基化的试剂盒，包括以下组分：
Taq酶预混液体系、靶基因定量PCR检测用引物和探针和用于Taq酶活性质控的试剂。
本发明是基于定量PCR技术实现DNA甲基化的检测，检测机理见图1，利用甲基化对DNA理化性质的影响，将DNA甲基化的差异转化为PCR有效模板量的差异，通过定量PCR实现对其检测。
本发明所述试剂盒对待检测的对象没有特殊限制，适用于不同甲基化程度的基因片段。在本发明实施例中，分别采用APC、SHOX2、Apobec3B、P53验证方法的可行性，以APC为例加以说明。所述APC基因的验证方法，优选如下，配制含有不同比例的胞嘧啶的dNTP试剂，然后验证引物的特异性，采用普通PCR的方法扩增靶基因，得到唯一特异性条带表明引物特异性高，以靶基因为模板进行PCR扩增，在此过程中实现甲基化胞嘧啶的掺入，然后以制备的含不同比例甲基化胞嘧啶的DNA，再在较高温度和较低温度条件下进行qPCR检测，将得到的两个Ct值，作差得到ΔCt值。证实：ΔCt值只与DNA的甲基化程度有关，而与DNA的浓度无关，而且ΔCt值与DNA甲基化程度成正相关。将不同甲基化比例的DNA片段与其对应的无甲基化DNA片段进行比较，发现不同基因甲基化检测出极限值不同，这样该方法可定量评价各靶基因的DNA甲基化程度。所述靶基因的不同甲基化程度采用含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP试剂实现。所述含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP试剂优选包括等摩尔浓度的dATP、dTTP、dGTP和试剂A。dATP、dTTP、dGTP和试剂A的浓度独立优选为2.5mM。所述试剂A为5'-m-dCTP和/或dCTP。所述试剂A中，5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比优选包括1:0、1：(1～30)和0:1，其中1：(1～30)表示1:1、1:2、1:3......1:29和1:30中多组的比值。不同种类的靶基因，在绘制参考曲线时所需要设置的胞嘧啶的比例是不同的。所述APC的定量PCR检测用引物序列，如SEQ ID NO:1所示的上游引物序列，如SEQ ID NO:2所示的下游引物序列，所述APC的定量PCR检测用探针为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的序列；所述SHOX2的定量PCR检测用引物序列如SEQ ID NO:4所示的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示的下游引物序列，所述SHOX2的定量PCR检测用探针序列如SEQ ID NO:6所示的序列；所述Apobec3B的定量PCR检测用引物序列如SEQ ID NO:7所示的上游引物序列，如SEQ ID NO:8所示的下游引物序列，所述Apobec3B的定量PCR检测用探针序列如SEQ ID NO:9所示的序列；所述P53的定量PCR检测用引物序列如SEQ ID NO:10，所示的上游引物序列如SEQ ID NO:11所示的下游引物序列，所述P53的定量PCR检测用探针序列如SEQ ID NO:12所示的序列。
在本发明中，所述试剂盒还包括对肿瘤样品进行DNA甲基化检测。在本发明实施例中，针对肺癌样品进行DNA甲基化检测时，AID、HOXD12和Alu作为靶基因检测。在此过程中，首先利用引物设计软件对靶基因进行引物设计，随后将不同的候选引物分别对模板DNA进行靶基因扩增，评估候选引物的特异性，选出扩增特异条带的引物作为定量PCR的引物。所述AID的定量PCR检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的上游引物序列，如SEQID NO:14所示的下游引物序列，所述AID的定量PCR检测用探针序列如SEQ ID NO:15所示的序列。所述AID进行甲基化DNA检测时，绘制参考曲线需配制试剂A包括1:0、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6和0:1。所述HOXD12的定量PCR检测用引物序列如SEQ ID NO:16所示的上游引物序列如SEQ ID NO:17所示的下游引物序列，所述HOXD12的定量PCR检测用探针序列如SEQID NO:18所示的序列。所述HOXD12进行甲基化DNA检测时，绘制参考曲线需配制试剂A包括1:0、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：8、1：10、1：20和0:1。所述Alu的定量PCR检测用引物包括核苷酸序列，如SEQ ID NO:19所示的上游引物序列，如SEQ ID NO:20所示的下游引物序列，所述Alu的定量PCR检测用探针序列，如SEQ ID NO:21所示的序列。
在本发明中，针对结直肠癌样品进行DNA甲基化检测时，SDC2、WDR17和ADHFE1作为靶基因检测。所述SDC2的定量PCR检测用引物序列如SEQ ID NO:22所示的上游引物序列，如SEQ ID NO:23所示的下游引物序列，所述SDC2的定量PCR检测用探针序列如SEQ ID NO:24所示的序列。所述SDC2进行甲基化DNA检测时，绘制参考曲线需配制试剂A包括1:0、1：1、1：2、1：4、1：6、1：8、1：10和0:1。所述WDR17的定量PCR检测用引物序列，如SEQ ID NO:25所示的上游引物序列，如SEQ ID NO:26所示的下游引物序列，所述WDR17的定量PCR检测用探针序列如SEQ ID NO:27所示的序列。所述WDR17进行甲基化DNA检测时，绘制参考曲线需配制试剂A包括1:0、1：1、1：2、1：4、1：6、1：8、1：10、1：20、1：30和0:1。所述ADHFE1的定量PCR检测用引物序列，如SEQ ID NO:28所示的上游引物序列，如SEQ ID NO:29所示的下游引物序列，所述ADHFE1的定量PCR检测用探针序列如SEQ ID NO:30所示的序列。所述ADHFE1进行甲基化DNA检测时，绘制参考曲线需配制试剂A包括1:0、1：1、1：2、1：4、1：6、1：8、1：10和0:1。所述Alu的定量PCR检测用引物序列如SEQ ID NO:31所示的上游引物序列如SEQ ID NO:32所示的下游引物序列，所述Alu的定量PCR检测用探针为核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示的序列。
本发明提供了所述试剂盒在非疾病诊断目的的检测DNA甲基化中的应用。
本发明提供了一种非疾病诊断目的的检测DNA甲基化的方法，包括以下步骤：
1)用所述试剂盒中引物和探针配制定量PCR检测的反应体系，分别经过较高温变性扩增和较低温变性扩增，分别得到较高温变性条件下扩增的CtX-HT和较低温变性条件下扩增的CtX-LH；
2)将步骤1)中CtX-LH和CtX-HT带入公式I中，得到靶基因的△Ctx；
△Ctx＝CtX-LH–CtX-HT公式I
其中，CtX-LH表示X基因在较低变性条件下扩增的Ct值；CtX-HT表示X基因在较高温变性条件下扩增的Ct值，X表示一种靶基因；
本发明用所述试剂盒中引物和探针配制定量PCR检测的反应体系，分别经过较高温变性扩增和较低温变性扩增，分别得到较高温变性条件下扩增的CtX-HT和较低温变性条件下扩增的CtX-LH。
在本发明中，定量PCR检测的反应体系如下：
Figure BDA0003339920530000051
在本发明中，较高温变性扩增的反应条件优选如下：预变性95℃5min；94℃5s，60℃15s，72℃30s，45个循环。较低温变性扩增的反应条件优选如下：85℃15s，60℃15s，72℃30s，18个循环；94℃5s，60℃15s，72℃30s，27个循环。可根据扩增片段的长度以及CG含量做适当的调整。
得到CtX-LH和CtX-HT，本发明将CtX-LH和CtX-HT带入公式I中，得到靶基因的△Ctx；
△Ctx＝CtX-LH–CtX-HT公式I
其中，CtX-LH表示X基因在低温变性条件下扩增的Ct值；CtX-HT表示X基因在高温变性条件下扩增的Ct值，X表示一种靶基因。
本发明采用所述试剂盒中用于绘制参考曲线的试剂绘制参考曲线，得到含不同比例胞嘧啶甲基化DNA与ΔCtx之间的线性关系，得到参考曲线。
在本发明中，所述绘制参考曲线的方法同上，在此不做赘述。
得到参考曲线后，本发明将靶基因的ΔCtx与参考曲线中ΔCtx'进行比较，得到靶基因中甲基化胞嘧啶的比例，从而判断靶基因的DNA甲基化程度。
本发明提供了所述试剂盒或上述检测DNA甲基化的方法在区分两个研究群体之间的DNA甲基化变化中的应用。
在本发明中，所述靶基因优选包括两种或两种以上时，区分两个研究群体之间的DNA甲基化变化的方法，包括以下步骤：
获得各靶基因的ΔCt后，将群体1样品和群体2样品对应的各靶基因的ΔCt进行回归分析，得到靶基因联合检测的阈值和权重值计算公式II，将各靶基因的ΔCt带入公式II中，计算得到各样品的权重值；
靶基因的权重值＝a1×△Ctx1+a2×△Ctx2+......+an×△Ctxn公式II
其中，a1、a2、an分别为各靶基因回归分析时得到的对应系数；x1、x2、xn分别为不同的靶基因。
两群体之间的定性判定：将群体1样品和群体2样品的权重值与对应样品的阈值比较，权重值低于阈值的样品为低甲基化样本，定义为阴性，权重值高于阈值的样品为高甲基化样本，定义为阳性，然后经统计学分析比较两群体之间差异；
两群体之间的差异性判定：计算各群体1样品的权重值的均值和群体2样品的权重值的均值，经T检验分析，当群体1样品的权重值的均值和群体2样品的权重值的均值呈显著性差异，表明两群体的DNA甲基化差异显著。
在本发明实施例中，两群体包括正常血浆样品和癌症(病理检测结果判定)血浆样品两群体。
获得各靶基因的ΔCt后，将正常血浆样品和癌症血浆样品对应的各靶基因的ΔCt进行回归分析，得到靶基因联合检测的权重值计算公式II，将各靶基因的ΔCt带入公式II中，计算得到各癌症样品的权重值；
靶基因的权重值＝a1×△Ctx1+a2×△Ctx2+......+an*△Ctxn公式II
其中，a1、a2、an分别为各靶基因回归分析时得到的对应系数；
以正常血浆样品和癌症(病理结果明确)血浆样品的为标准，将根据各样品的权重值与阈值比较，权重值低于阈值的癌症样品为假阴性，权重值高于阈值的正常样品为假阳性；
计算各癌症血浆样品的权重值的均值和正常血浆样品的权重值的均值，经T检验分析，当癌症血浆样品的权重值的均值和正常血浆样品的权重值的均值呈显著性差异，表明所述方法适用于对癌症患者的鉴别。所述阈值的计算方法优选由统计学分析计算得出。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于定量PCR技术DNA甲基化检测方法及其试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
甲基化检测方法的建立方法
本实施例研究发现，相对于非甲基化DNA，甲基化DNA的理化性质有着显著的改变，基于该现象，探索出一种新型的甲基化检测方法。其基本原理是在一定的条件下DNA甲基化的差异转化为PCR有效模板量的差异，随后通过定量PCR完成检测。在建模过程中，利用PCR通过碱基掺入制备不同程度的甲基化DNA片段，然后对其进行甲基化差异的检测，建立检测数值与甲基化程度之间的对应关系，具体方法如下：
1)实验材料
试剂：Taq酶预混液体系(2×Premix Ex TaqTM)及TaqTM试剂购自TaKaRa Bio Inc；5'-m-dCTP购自于美国New EnglandBiolabs公司；T/A载体购自于天根生化科技(北京)有限公司购自于NEB公司；引物及探针购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
靶基因：在对新的检测方法的探索中，选择了实验室已有的不同基因的启动子区域(APC、Apobec3B、SHOX2)、P53外显子区域(外显子4区域)片段。
2)甲基化DNA片段的制备(PCR掺入法)：在甲基化DNA片段的制备过程中，将甲基化胞嘧啶与胞嘧啶按照不同比例配制(无甲基化、全甲基化以及不同程度的甲基化)，在此过程中，首先将5'-mdCTP(5'-甲基化胞嘧啶)和dCTP按照不同比例混合，再分别加入dATP、TTP和dGTP，进行PCR扩增，以验证各引物的扩增特异性。这样就完成了对不同甲基化DNA片段的制备。
3)PCR反应：包括反应混合物的组成及反应条件。
(1)不同比例DNA甲基化模板的制备
含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP的配制(见表1)：将5'-m-dCTP：dCTP分别摩尔浓度配制为1:0、1：(1～30)和0:1的比例，然后进一步与等比例的dATP、dTTP、dGTP进行混合，完成含有不同比例的甲基化胞嘧啶的dNTP(每种碱基浓度为2.5mM)的制备，引物序列见表3。
表1含有5′-m-dCTP的PCR反应混合物(20μL反应体系)
组分 体积(μL)
含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP 2
上游引物 0.5
下游引物 0.5
DNA模板(靶基因) 2
10xBuffer 2
rTaq酶 0.5
ddH<sub>2</sub>O 12.5
PCR反应条件(20μL反应体系)：预变性95℃5min，随后进入3步骤扩增程序：94℃5s，60℃15秒，72℃30s，45个循环。
(2)甲基化DNA片段的检测
反应混合物的配制见表2。
表2qPCR反应体系
Figure BDA0003339920530000071
表3引物与探针序列
Figure BDA0003339920530000072
注：APC(启动子)靶区扩增片段长度为148bp；SHOX2(启动子)靶区扩增片段长度为174bp；Apobec3B(启动子)靶区扩增片段肠道为135bp；P53(外显子4)靶区扩增片段长度为180bp。
PCR仪器：宏石SLAN 96P。
反应条件：
(1)高温变性(HT)：4基因(APC/Apobec3B//P53/SHOX2)：预变性95℃5min，随后进入3步骤扩增程序：94℃5s，60℃15秒，72℃30s，45个循环。
(2)低温变性*(LT)：4基因(APC/Apobec3B/P53/SHOX2)：85℃15s，60℃15秒，72℃30s，18个循环，随后进入以下循环程序：94℃5s，60℃15秒，72℃30s，27个循环。
可以根据扩增片段的长度以及CG含量做适当的调整。
(3)△Ct的计算
PCR结果中的数据导出后，按照下述公式I进行计算，得到相应的值。
△Ctx＝CtX-LH–CtX-HT 公式I
其中，CtX-LH表示X基因在低温变性条件下扩增的Ct值；CtX-HT表示X基因在高温变性条件下扩增的Ct值。
4)实验结果
(1)ΔCt与模板浓度无关：将制备的不同甲基化DNA片段进行梯度稀释，作为模板分别在两种温度条件下进行定量PCR分析，其中CtX-HT定义为Ct1，CtX-LH定义为Ct2，Ct2和Ct1两者的差值定义为ΔCt。
以下为不同靶基因启动子片段的检测结果如下：
SHOX2基因片段的检测结果见表4。
表4不同浓度与不同甲基化比例(摩尔浓度)SHOX2基因片段的检测分析
Figure BDA0003339920530000081
结果显示，不同模板浓度下Ct值(Ct1和Ct2)虽然出现相应的改变，但ΔCt值几乎完全一样，而不同甲基化的ΔCt值则显著不同，表明ΔCt值只与DNA的甲基化程度有关，而与DNA的浓度无关，而且ΔCt值与DNA甲基化程度成正相关。
(2)ΔCt与模板的甲基化程度呈正相关
按照前述的甲基化检测方法，对不同甲基化程度的不同DNA片段进行检测，比较ΔCt值的差异，结果如表5～表8和图2～图9所示。
表5SHOX2基因片段不同程度甲基化的检测
5'-m-dCTP:dCTP 1:1 1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 0:1
Ct2 20.31 17.36 15.79 15.47 15.59 14.12 14.16
Ct1 15.09 14.9 14.73 14.99 15.08 14.06 14.12
ΔCt 5.22 2.46 1.06 0.48 0.51 0.06 0.04
表6P53基因片段不同程度甲基化的检测
5'-m-dCTP:dCTP 1:0 1:1 1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 1:20 1:30 0:1
Ct2 24.43 22.28 21.17 19.89 19.47 18.51 18.09 17.00 16.94 16.71
Ct1 18.75 16.74 16.33 16.33 16.10 16.14 15.91 15.29 15.70 15.35
ΔCt 5.68 5.54 4.84 3.56 3.37 2.37 2.18 1.71 1.24 1.36
表7APC基因片段不同程度甲基化的检测
Figure BDA0003339920530000082
Figure BDA0003339920530000091
表8Apobec3B基因片段不同程度甲基化的检测
5'-m-dCTP:dCTP 1:1 1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 1:20 1:30 0:1
Ct2 26.03 24.34 22.72 21.76 22.62 20.71 19.73 19.68 18.85
Ct1 20.35 18.97 18.41 18.06 19.18 17.28 17.10 17.21 17.04
△Ct 5.68 5.37 4.31 3.7 3.44 3.43 2.63 2.47 1.81
以上结果显示，该方法对以上四种不同DNA甲基化片段均显示出显著性的差异，推断该检测方法适用于所有甲基化DNA片段的检测。不同甲基化比例的DNA片段与其对应的无甲基化DNA片段比较显示，不同基因甲基化片段检测出极限值不同。
实施例2
肺癌cf/ctDNA甲基化检测方法
1)肺癌靶基因鉴定：
HOXD12基因：通过TCGA数据库分析，发现HOXD12基因甲基化在正常组织与肺癌组织中的差异最大，随机森林统计学分析模型分析显示，其对肺癌鉴别贡献度最大。HOXD12为同源盒基因家族成员中的一种，该家族基因在形态形成过程中起着重要的调控作用。目前研究显示该家族不同成员在肿瘤发生发展中具有重要的作用。
胞嘧啶脱氨酶基因(AID)：研究显示胞嘧啶脱氨酶通过对胞嘧啶的脱氨作用导致其变为尿嘧啶，该基因的异常表达可导致DNA出现各种突变，是基因组变异的重要因素，研究显示，AID在多种肿瘤中均为异常高表达，细胞实验显示，该基因过表达可显著提高基因组突变频率，转基因动物显示过表达AID可产生时间依赖的异型增生进而形成肿瘤。该基因与肺癌的关系目前已有大量的报道，但主要是集中于对其表达差异的研究，而对其甲基化差异的研究则鲜有报道。
Alu基因片段(高度重复序列)：是人基因组中的拷贝数最高的序列，由于肿瘤与正常人的代谢不同，导致基因组总量在外周血中正常人与肿瘤患者中具有很大的差异，这样在对正常人与肺癌患者的ctDNA总浓度的比较中，可以将Alu基因拷贝数作为基因组总量的代理，对其进行定量检测。
2)实验材料与方法
样本来源：正常组样本：来自于北京交通大学校医院查体人员；肺癌组样本：来自于解放军总医院第一医学中心肿瘤中心实验室。我们随机选取正常人样本42份，肺癌样本53份。
引物与探针的设计：采用引物软件Primer 5对AID与HOXD12基因启动子区域进行设计，并参考CG岛数量、扩增片段长度等参数；对Alu基因中的保守区序列进行设计。
表9靶基因引物与探针序列
Figure BDA0003339920530000092
注：靶基因扩增靶区PCR片段长度：AID(启动子区域)：145bp；HOXD12(启动子区域)：155bp；Alu(基因体)：111bp。
引物与探针合成：生工生物工程(上海)股份有限公司提供。
血浆游离DNA的提取试剂盒：美基生物公司的游离DNA检测试剂盒。
靶基因拷贝数的鉴定：用Alu引物对提取的DNA样本进行扩增与定量分析，找出高特异的靶区。在此过程中，发现无论正常人还是肺癌患者的Ct值均不超过20，这样为保持单位一致，我们将Alu的Ct值被20所减，得到其对应的ΔCt值：ΔCt＝20-Ct。
PCR仪：宏石SLAN 96P。
PCR反应条件：(1)高温变性(HT)：3个基因片段(AID/HOXD12/Alu)：预变性95℃5min，随后进入3步骤扩增程序：94℃5s，60℃15秒，72℃30，45个循环。(2)低温变性(LT)：2个基因片段(AID/HOXD12):85℃15s，60℃15秒，72℃30s，18个循环，随后进入以下循环程序：94℃5s，60℃15秒，72℃30s，27个循环。
3)根据不同基因的不同比例甲基化检测结果建立靶基因甲基化靶区参考曲线，其中不同基因的不同比例甲基化检测结果见表10～11和图10～图13所示。
表10AID基因不同比例甲基化检测数据
5'-m-dCTP:dCTP 1:0 1:1 1:2 1:4 1:6 0:1
Ct2 22.54 22.71 20.16 20.94 23.26 23.11
Ct1 19.26 20.88 19.51 20.71 23.11 23.05
ΔCt 3.28 1.83 0.65 0.23 0.15 0.06
表11HOXD12基因不同比例甲基化检测数据
5'-m-dCTP:dCTP 1:0 1:1 1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 1:20 0:1
Ct2 22.87 25.1 20.58 20.05 19.21 18.67 18.1 16.34 17.1
Ct1 16 20.12 16.84 17.2 17.34 17.54 16.8 15.58 16.51
ΔCt 6.87 4.98 3.74 2.85 1.87 1.13 1.3 0.76 0.59
4)两群体差异性的定性判定(靶基因联合与权重值分析)
将AID和HOXD12靶基因在两种条件下的Ct值相减，得到ΔCt值(Ct2-Ct1)。其中Alu的ΔCt值为定值20减去其检测的Ct值。将正常人与肺癌患者的三基因ΔCt值进行统计学分析，得出三个基因(AID,HOXD12,Alu)联合检测的权重值公式以及阈值，并通过ROC曲线分析检测的敏感性与特异性。样本的权重值计算公式如下：
权重值＝1.325×ΔCtAID+2.084×ΔCtHOXD12+2.152×ΔCtAlu
阈值＝12.468。
正常人与肺癌患者样本检测数据见附表20(表格字体灰色表示假阳性)和表21(表格字体灰色表示假阴性)。以正常人与肺癌患者样本检测数据与阈值比较，得到肺癌与正常人样本基于阈值的评判结果(见表12)。对评估结果进行T检测分析，结果见表13。
表12肺癌与正常人样本基于阈值的评判结果
Figure BDA0003339920530000101
表13肺癌与正常人样本的T检验分析
Figure BDA0003339920530000111
统计结果表明，正常人与肺癌患者的权重值的均值呈显著性差异(P值＝0.000)，这表明靶基因DNA甲基化在肺癌样本与正常人样本中具有显著性差异。
敏感性分析：肺癌患者共51人，其中假阴性有6人。
敏感性＝(51-6)/51＝88.23％
特异性分析：正常人共44人，其中假阳性有6人。
特异性＝(44-6)/44＝86.36％
符合率＝[(51-6)+(44-6)]/(51+44)＝87.3％。
进一步经过对敏感性与特异性组合分析(ROC曲线)，其曲线下面积(AUC)占比为0.96，表明该检测技术的敏感性与特异性均较高。权重值在正常与肺癌组中的分布图，以及对敏感性与特异性分析的ROC曲线如图14。
实施例3
直肠癌cf/ctDNA甲基化检测
1)结直肠癌靶基因鉴定：
通过TCGA数据库分析，发现SDC2/WDR17/ADHFE1三基因甲基化在正常组织与结直肠癌组织中的差异最大，随后经随机森林统计学模型分析显示，三基因甲基化对结直肠癌的鉴别贡献很大。随后按照前述方法对三基因启动子区域的甲基化进行检测。另外，选择Alu基因片段作为外周血游离DNA总量的代理，对其进行定量检测。
表14靶基因引物与探针序列
Figure BDA0003339920530000112
注：靶基因扩增靶区PCR片段长度：WDR17(启动子区域)：124bp；SDC2(启动子区域)：107bp；ADHFE1(启动子区域):157bp；Alu(基因体)：111bp。
2)材料与方法：
样本来源：正常组样本来自于北京交通大学校医院查体人员；结直肠癌组样本来自于解放军总医院第一医学中心肿瘤中心实验室。随机选取正常人样本54份，结直肠癌样本55份。
引物设计：采用引物软件Primer 5对SDC2/WDR17/ADHFE1基因启动子区域进行设计，并参考CG岛数量、扩增片段长度等参数；对Alu基因中的保守区序列进行设计。
引物与探针合成：生工生物工程(上海)股份有限公司提供。
血浆游离DNA的提取试剂盒：美基生物公司的游离DNA检测试剂盒。
靶基因拷贝数的鉴定：用Alu引物对提取的DNA样本进行扩增与定量分析，找出高特异的靶区。在此过程中，我们发现无论正常人还是结直肠癌患者的Ct值均不超过20，这样为保持单位一致，我们将Alu的Ct值被20所减，得到其对应的ΔCt值：ΔCt＝20-Ct。
PCR仪：宏石SLAN 96P
PCR反应条件：(1)高温变性(HT)：4个基因片段(SDC2/WDR17/ADHFE1/Alu)：预变性95℃5min，随后进入3步骤扩增程序：94℃5s，62℃15s，72℃30s，45个循环。(2)低温变性(LT)：WDR17/ADHFE1基因片段：86℃15s，62℃15s，72℃30s，16个循环，随后进入以下循环程序：94℃5s，60℃15s，72℃30s，29个循环。SDC2基因片段：88℃15s，62℃15s，72℃30s，16个循环，随后进入以下循环程序：94℃5s，60℃15s，72℃30s，29个循环。
3)根据各靶基因不同比例甲基化检测结果构建靶基因甲基化靶区参考曲线，其中各靶基因不同比例甲基化检测结果见表15～表17和图15～图20所示。
表15SDC2基因不同比例甲基化检测数据
5'-m-dCTP:dCTP 1:0 1:1 1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 0:1
Ct2 21.72 17.39 16.25 13.55 13.11 13.36 12.05 11.75
Ct1 14.19 11.47 12.02 11.15 11.25 11.86 11.65 11.31
ΔCt 7.53 5.92 4.23 2.40 1.86 1.50 0.40 0.44
表16WDR17基因不同比例甲基化检测数据
5'-m-dCTP:dCTP 1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 1:20 1:30 0:1
Ct2 30.05 25.68 25.25 25.21 26.92 19.66 19.38 22.32
Ct1 23.45 19.76 20.26 20.86 22.68 16.75 16.93 20.19
ΔCt 6.6 5.92 4.99 4.35 4.24 2.91 2.45 2.13
表17ADHFE1基因不同比例甲基化检测数据
5'-m-dCTP:dCTP 1:0 1:1 1:2 1:4 1:6 1:8 1:10 0:1
Ct2 22.84 20.72 18.56 17.46 17.79 17.19 17.14 16.52
Ct1 18.30 16.23 15.53 15.58 16.52 16.18 16.21 16.12
ΔCt 4.54 4.49 3.03 1.88 1.27 1.01 0.93 0.4
4)两群体差异性的判定(靶基因联合与权重值分析)
将靶基因在两种条件下的Ct值的相减，得到ΔCt值(Ct2-Ct1)。其中Alu的ΔCt值为定值20减去其检测的Ct值。将正常人与结直肠癌患者的四基因ΔCt值进行统计学分析，得出四个基因联合检测的权重值公式以及阈值，并通过ROC曲线分析检测的敏感性与特异性。样品的权重值计算公式III如下：
权重值＝3.35×ΔCtSDC2+0.99×ΔCtWDR17+0.933×ΔCtADHEF1+1.677×ΔCtAlu 公式III
阈值＝12.173。
结直肠癌患者检测结果见表22(灰度底纹表示假阴性)，正常人检测结果见表23(灰度底纹表示假阳性)。
表18两种样本(结直肠癌与正常人)基于阈值的评判结果
Figure BDA0003339920530000121
Figure BDA0003339920530000131
敏感性＝85.9％，特异性＝94.4％；符合率＝90.1％。
根据评断结果进行T检测分析，结果见表19。
表19检测结果的T检验分析
组别 例数 均值 标准差 均值的标准误
结直肠癌 57 16.6525 5.20192 0.68901
正常人 54 9.3080 2.35822 0.31513
统计结果表明，正常人与肺癌患者的权重值的均值呈显著性差异(P值＝0.000)，这表明靶基因DNA甲基化在肺癌样本与正常人样本中具有显著性差异。
进一步经过对敏感性与特异性组合分析(ROC曲线见图21)，其曲线下面积(AUC)占比为0.97，表明该检测技术的敏感性与特异性均较高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
表20正常人样本的检测数据
Figure BDA0003339920530000141
表21肺癌样本的检测数据
Figure BDA0003339920530000151
表22.结直肠癌患者检测数据
Figure BDA0003339920530000161
表23正常人检测数据
Figure BDA0003339920530000171
序列表
<110> 朱运峰
<120> 一种基于定量PCR技术DNA甲基化检测方法及其试剂盒
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcttgtgct aatccttctg c 21
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgcacagcc tgcctag 17
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgcggacct cccccgactc t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agttgcgagg ggaggtaat 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggaaatggg aactgatgc 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccctgccgga gcgcgcttgt tc 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccagagcca gagaaacatg aag 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcttacagc gtccttgcag ttg 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccggggcctc ccacaccaat g 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacttgtgcc ctgactttca ac 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcatgtgct gtgactgctt g 21
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agatggccat ggcgcggacg cggg 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgaagtgtc tactgttact gcc 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgtcatagg cagagtcaca ca 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctagctatgg agcatggact gggc 24
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagcctcgtc cttcgccat 19
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ataagaggac aggctcagac gat 23
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagcaccgcc tacatccccc cgacccg 27
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtggctcacg cctgtaatc 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttagtagaga cggggtttca 20
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttgggaggcc gaggcgggcg gat 23
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agggtcacga gccacttcc 19
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggagccacga tggaaggc 18
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cctctcgggc gctccaatca gcg 23
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcggcgtgta atcctgtagg 20
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccctcctgag cctgcttc 18
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgggctcccc tgggcgactg gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
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Claims (10)

1.一种基于定量PCR技术检测DNA甲基化的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：Taq酶预混液体系、靶基因定量PCR检测所用的引物和探针、用于绘制参考曲线所用的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于绘制参考曲线的试剂包括含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP试剂和普通PCR扩增用试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述含有不同比例甲基化胞嘧啶的dNTP试剂包括等摩尔浓度的dATP、dTTP、dGTP和试剂A；
所述试剂A为5'-m-dCTP和/或dCTP。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A中，5'-m-dCTP和dCTP的摩尔比包括1:0、1：(1～30)和0:1。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述靶基因包括但不限于以下一种或几种基因：
APC、SHOX2、Apobec3B、P53、AID、HOXD12、Alu、SDC2、WDR17和ADHFE1。
6.权利要求1～5任意一项所述试剂盒在非疾病诊断目的的检测DNA甲基化中的应用。
7.一种非疾病诊断目的的检测DNA甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求1所述试剂盒中引物和探针配制定量PCR检测的反应体系，分别经过较高温变性扩增和较低温变性扩增，分别得到较高温变性扩增的CtX-HT和较低温变性扩增的CtX-LH；
2)将步骤1)中CtX-LH和CtX-HT带入公式I中，得到靶基因的△Ctx；
△Ctx＝CtX-LH–CtX-HT 公式I
其中，CtX-LH表示X基因在低温变性条件下扩增的Ct值；CtX-HT表示X基因在高温变性条件下扩增的Ct值，X表示一种靶基因；
3)采用权利要求1所述试剂盒中用于绘制参考曲线的试剂对靶基因进行不同甲基化DNA程度的片段扩增，所得PCR产物按照步骤1)和步骤2)的方法操作，获得不同甲基化DNA片段的△Ctx'，得到不同比例甲基化胞嘧啶与ΔCtx'之间的线性关系，绘制参考曲线；
4)将步骤2)中靶基因的ΔCtx与步骤3)中参考曲线中ΔCtx'进行比较，得到靶基因中甲基化胞嘧啶的比例，从而判断靶基因的DNA甲基化程度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，较高温变性扩增的反应条件如下：预变性95℃5min；94℃5s，60～62℃15s，72℃30s，45个循环；
较低温变性扩增的反应条件如下：85～88℃15s，60～62℃15s，72℃30s，18个循环；94℃5s，60～62℃15s，72℃30s，27个循环。
9.权利要求1～5任意一项所述试剂盒或权利要求7或8所述方法在区分两个研究群体之间的DNA甲基化变化中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述靶基因包括两种以上靶基因时，区分两个研究群体之间的DNA甲基化变化的方法，包括以下步骤：
获得各靶基因的ΔCt后，将群体1样品和群体2样品对应的各靶基因的ΔCt进行统计学回归分析，得到靶基因联合检测的阈值和权重值公式II，其中权重值公式II是将各靶基因的ΔCt带入公式II中，计算得到各样品的多靶基因联合检测的权重值；
多靶基因联合检测的权重值＝a1×△Ctx1+a2×△Ctx2+......+an×△Ctxn 公式II
其中，a1、a2、an分别表示各靶基因统计学分析时得到的对应系数；
两群体之间的定性判定：将群体1样品和群体2样品的权重值与对应样品的阈值比较，权重值低于阈值的样品为低甲基化样本，定义为阴性，权重值高于阈值的样品为高甲基化样本，定义为阳性，然后经统计学分析比较两群体之间差异；
两群体之间的差异性判定：计算各群体1样品的权重值的均值和群体2样品的权重值的均值，经T检验分析，当群体1样品的权重值的均值和群体2样品的权重值的均值呈显著性差异，表明两群体的DNA甲基化差异显著。
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