CN109082470A - 微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组及其检测方法 - Google Patents

微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组及其检测方法 Download PDF

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CN109082470A CN201811041738.7A CN201811041738A CN109082470A CN 109082470 A CN109082470 A CN 109082470A CN 201811041738 A CN201811041738 A CN 201811041738A CN 109082470 A CN109082470 A CN 109082470A
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王明
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Shanghai Saian Biological Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
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Abstract

本发明涉及一种微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,包括以下步骤:分别对肿瘤患者的癌变组织样本和正常组织对照品进行DNA片段化处理,末端补齐加A尾,进行接头连接;设计用于目的区域捕获的引物和探针以及用于扩增的引物,探针是分别针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针,采用探针和引物进行目的区域捕获后扩增得到文库;测序得到癌变组织样本和正常组织对照品的五个微卫星位点的重复序列长度分布数据,对比两者数据,判断微卫星位点的稳定性。本发明还涉及一种微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组。本发明的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法可以减少测序深度对结果判定的影响,简单易行,准确度高,灵敏度高,成本低。

Description

微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种微卫星不稳定性水平评估的二代测序方法及其所用的引物和探针,属于生物技术领域。
背景技术
微卫星是指基因组上短的重复的DNA序列,这些重复序列包括单核苷酸重复、二核苷酸重复和多核苷酸重复序列。这些重复区域在DNA复制的过程中易引起碱基对的错配,从而导致重复区域长度的变化。不过,正常人体内存在健全的错配修复(MMR)系统可修复错配引起的后果。
微卫星不稳定性(MSI)指的是DNA重复区域长度的变化,这种变化是由于MMR蛋白功能的缺失导致的,并且这种现象在结直肠癌患者中的发生概率高达20%。MSI可进一步分为高不稳定性(MSI-H)与低不稳定性(MSI-L),检测的微卫星位点中有大于等于30%的位点表现出不稳定性定义为高不稳定性,有小于30%的位点表现出不稳定性定义为低不稳定性。
表现出MSI-H的结直肠癌患者提示为存在MMR缺陷,MSI-H肿瘤患者对化疗药5-氟脲嘧啶不敏感,需选择其他化疗方案。此外,近期研究表明,MSI-H患者在接受PD-1/PD-L1抗体时比MSI-L与MSS患者具有更好的临床反应。因此,MSI水平检测也可用于免疫检查点抑制剂类药物的辅助疗效的预测。对结直肠癌患者MSI水平进行高效准确的检测成为一种需求。
传统的MSI水平检测方法主要有:免疫组化方法,微卫星位点PCR法与Sanger测序法。传统的检测方法,不同程度的表现出一定的局限性。免疫组化方法操作复杂,特异性低;微卫星位点PCR法对通量低;直接测序法周期长、成本高且准确度低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以减少测序深度对结果判定的影响,简单易行,准确度高,灵敏度高,成本低的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,以及使用该方法的引物探针组。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组,包括探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5、引物FP-1和引物UP-2;所述探针MSI-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述探针MSI-2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述探针MSI-3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述探针MSI-4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,所述探针MSI-5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述引物FP-1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,所述引物UP-2的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。
上述探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5和引物FP-1用于目的区域捕获;所述引物FP-1和引物UP-2用于扩增。
上述各探针在反应体系中的最终浓度均为200nM,各引物在反应体系中的最终浓度为400nM。
本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是:一种微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,不用于疾病的诊断和治疗,包括以下步骤:
A.分别对肿瘤患者的癌变组织样本和正常组织对照品进行DNA片段化处理,末端补齐加A尾,进行接头连接;
B.设计用于目的区域捕获的引物和探针以及用于扩增的引物,所述探针是分别针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针,采用所述探针和引物进行目的区域捕获后扩增得到文库;
C.测序得到癌变组织样本和正常组织对照品的五个微卫星位点的重复序列长度分布数据,对比两者数据判断微卫星位点的稳定性。
上述步骤C中,将微卫星位点的重复序列长度分布数据绘制成MSI分析结果图,对比两者的MSI分析结果图,判断微卫星位点的稳定性;图中的横坐标为重复序列的长度,图中的纵坐标为重复序列各长度的reads总数与覆盖该位点reads总数的比值,通过比较图中的重复序列长度分布图形从而对比两者数据。
对比两者的MSI分析结果图,若两图中主峰的横坐标差值大于等于1bp,或者量两图中主峰的横坐标±3bp内,存在2个或2个以上纵坐标差值大于等于0.1的峰,或者两图中主峰的横坐标±3bp外,存在纵坐标差值大于等于0.3的峰,则判断该微卫星位点为不稳定;反之,则判断该微卫星位点为稳定。
上述单向DNA延伸探针包括5’端的illumina文库的通用接头序列和3’端的特异性互补序列,所述二代测序特异性互补序列能与相应微卫星位点上游或下游50bp长度内的基因组序列特异性互补的。
上述特异性互补序列的长度为25bp至45bp。
上述针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针分别是探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4和探针MSI-5,所述探针MSI-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述探针MSI-2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述探针MSI-3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述探针MSI-4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,所述探针MSI-5的核苷酸序列如SEQID No.5所示。
上述用于目的区域捕获的引物是引物FP-1,用于扩增的引物是引物FP-1和引物UP-2,所述引物FP-1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,所述引物UP-2的核苷酸序列如SEQID No.7所示。
本发明具有积极的效果:
(1)本发明的检测方法从人类hg19参考基因组选取的五个微卫星位点用于MSI水平的检测,五个微卫星位点均为单核苷酸重复的位点,采用患者的癌变组织和正常组织可对患者的MSI水平进行评估,属于首创,经验证对结直肠癌患者化疗方案具有指导作用。
(3)本发明的检测方法采用单向DNA延伸探针进行目的区域捕获,相较于传统的多重PCR捕获方法,增大了片段化样本DNA的利用率,相较于传统的RNA探针杂交捕获方法,降低了建库成本。探针的3’端的特异性互补序列延伸起点距离目的微卫星位点的长度小于50bp,距离微卫星位点较近,提高了捕获效率,保证了探针捕获的高效性。探针的5’端采用illumina文库的通用接头序列,这样设计极大的简化了检测步骤。
(4)本发明的检测方法建库步骤为样本DNA片段化、连接接头、靶向区域捕获与通用扩增,均为常用NGS建库步骤,试剂要求较低。
(5)本发明的检测方法将测序所得数据,绘制成分析结果图,横坐标为重复序列的长度,纵坐标为重复序列各长度的reads总数与覆盖该位点reads总数的比值,这大大减少了测序深度对结果判定的影响。
附图说明
图1是直肠癌肿瘤组织MSI-1位点的MSI分析结果图;
图2是直肠癌癌旁组织切片MSI-1位点的MSI分析结果图;
图3是直肠癌肿瘤组织MSI-2位点的MSI分析结果图;
图4是直肠癌癌旁组织切片MSI-2位点的MSI分析结果图;
图5是直肠癌肿瘤组织MSI-3位点的MSI分析结果图;
图6是直肠癌癌旁组织切片MSI-3位点的MSI分析结果图;
图7是直肠癌肿瘤组织MSI-4位点的MSI分析结果图;
图8是直肠癌癌旁组织切片MSI-4位点的MSI分析结果图;
图9是直肠癌肿瘤组织MSI-5位点的MSI分析结果图;
图10是直肠癌癌旁组织切片MSI-5位点的MSI分析结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述,有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中,若非特意表明,所用的试剂均为分析纯,所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件,或按照制造商所建议的条件。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
主要试剂:
所有试剂购买自正规厂家,文库构建试剂包括:Fragmentation Enzyme Mix(QIAgen)、Fragmentation Buffer(QIAgen)、DNAligase Ligation Buffer(QIAgen)、ligation solution(QIAgen)、5XPCR buffer(QIAgen)、TEPCR buffer(QIAgen)、HotstarTaq DNA polymerase(QIAgen)、QIAseq 96-Index I set(QIAgen,内含IL-N7adapter)、AmPure XP Reagent磁珠(Beckman)、3S Spin Agarose Gel DNAPurification Kit(上海博彩生物科技有限公司)等。上机模板准备和上机过程中用到的试剂和耗材与Miniseq(illumina)二代测序平台相配套。本方法实验前需要新鲜配制的试剂:80%乙醇(100%乙醇与无核酸酶水按4:1比例配制)。
主要仪器:
PCR仪(厂家:EXcell Bio)、Ion Torrent PGM测序仪、3.0荧光定量仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、灭菌锅、磁力架、移液枪、PCR仪、震荡仪等。
实施例
本实施例的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,检测样本可以为能提取核酸的任意形式的样品,包括但不限于:全血、血清、血浆和组织样品;组织样品包括但不限于:石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片。
1.样本抽提。
采用试剂盒(AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取一名结直肠癌患者的肿瘤组织切片与癌旁组织切片,具体的操作参见试剂盒产品说明书。
2.样本DNA浓度测定。
采用3.0对抽提后的DNA浓度测定,具体步骤如下:
1)向样本管加入1ul Qubit dsDNA HS Reagent和199ul Qubit dsDNA HSbuffer,漩涡混匀4s;
2)向已添加工作液的样品管内吸弃1μl工作液,加入1μl的DNA样本,漩涡混匀4s,每管的最终体积是200μl;
3)所有管在室温避光孵育2分钟;
4)在3.0主屏上点击“DNA”键,然后选择dsDNA High Sensitivity分析模式;
5)把样本管放入3.0中,盖上盖子,点击read;
6)选择Calculate Initial初始浓度,然后选择Volume of Sample Used:1μl,此时显示的结果为样本初始浓度,单位ng/μl;
7)读取下一个样本:取出Qubit3.0荧光光度计中样本。
3.文库构建。
1)DNA模板片段化。
此反应步骤对DNA样本进行片段化、补齐和加A尾。
其体积为20μl的反应体系配比如下:20ng的DNA,2.5μl的Fragmentation buffer,ddH2O补足20μl。整个加样过程在冰上进行,最后加入5μl片段化酶,共25μl。
在PCR仪上温度为4℃,反应1min,温度为32℃,反应14min,温度为65℃,反应30min,温度为4℃,反应10min。
2)接头连接。
接头连接反应的体系如表1所示。
表1连接反应的反应体系表
吹打混匀,在PCR仪上温度为20℃,反应15min,温度为4℃,反应10min。
3)连接产物纯化。
具体步骤如下:
a.将50μl的连接产物转移到1.5ml的EP管中,向EP管中加入90μl的AmPure XPReagent磁珠,吹打混匀,静置5min。
b.将EP管至于磁力架上,至磁珠分离,弃溶液。
c.200μl的浓度为80%的乙醇水溶液清洗2遍,晾干。
d.52μl的dH2O洗脱磁珠,至于磁力架,待磁珠分离。
e.转移50μl的DNA溶液至于一新EP管,加入50μl磁珠,静置5min。
f.置于磁力架,待磁珠分离,用200μl的80%浓度为80%的乙醇水溶液洗涤2次,晾干。
g.用12μl的dH2O洗脱磁珠,转移9.4μl的溶液置于一新的PCR管中,用于接下来的实验。取1μl定量。
4)目的区域捕获。
从人类hg19版本参考基因组,选择5个微卫星(MSI)位点,这5个MSI位点均为单核苷酸重复位点,5个MSI位点的具体信息如表2所示。
表2 MSI位点信息表
针对各微卫星位点分别设计相应的单向DNA延伸探针,延伸探针的5’端为illumina文库的通用接头序列,3’端为能与相应微卫星位点上游或下游50bp长度内的基因组序列特异性互补的特异性互补序列。
针对各微卫星位点的单向DNA延伸探针混合在一起组成探针混合液,探针混合液中包括分别检测MSI-1、MSI-2、MSI-3、MSI-4和MSI-5这5个位点微卫星不稳定性的探针。另外,根据各探针的通用接头序列设计引物FP-1和引物UP-2。各引物和探针的核苷酸序列如表3所示。
表3引物探针序列表
用设计好的探针混合液和引物FP-1进行捕获延伸,目的区域捕获的体系如表4所示。
表4目的区域捕获的反应体系表
目的区域捕获的反应条件如表5所示。
表5目的区域捕获的反应条件表
5)磁珠纯化捕获后产物。
具体步骤如下:
a.将20μl的捕获产物转移到1.5ml的EP管中,加入80μl dH2O调整到100μl,向EP管中加入100μl的QIAseq Beads,吹打混匀,静置5min。
b.将EP管至于磁力架上,至磁珠分离,弃溶液。
c.200μl的浓度为80%的乙醇水溶液清洗2遍,晾干。
d.16μl的dH2O洗脱磁珠,至于磁力架,待磁珠分离。
e.转移13.4μl DNA溶液至于一新EP管,用于接下来的实验。
6)通用扩增。
用设计好的引物FP-1和引物UP-2进行通用扩增,通用扩增的反应体系如表6所示。
表6通用扩增的反应体系表
将该配好的体系加入96孔的预制反应板中1个反应板中,吹打5至6次混匀,短暂离心。
通用扩增的反应条件如表7所示。
表7通用扩增的反应条件表
7)文库质控及切胶回收。
具体步骤如下:
a.电泳:各取文库9μl放入新的EP管中再加入0.5μl的10×loading buffer,吹打混匀,使用1%琼脂糖胶,100v,30min;
b.切胶:电泳完的琼脂糖胶,用一新手术刀片割取300bp至500bp的文库片段;
c.胶回收:参照3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit使用说明书。
8)上机测序。
将回收后的文库,参照illumina Miniseq的上机步骤进行上机测序。
9)数据分析。
对测序得到的数据分别统计5个微卫星位点的重复序列长度分布,得到各微卫星位点的MSI分析结果图,图中的横坐标定义为重复序列的长度,图中的纵坐标为重复序列各长度的reads总数与覆盖该位点reads总数的比值。对比检测样本和对照品的MSI分析结果图,若两图存在下列情况之任一则可判断为微卫星不稳定性位点:1.主峰的横坐标差值大于等于1bp;2.主峰的横坐标±3bp内,存在2个或2个以上纵坐标差值大于等于0.1的峰;3.主峰的横坐标±3bp外,存在纵坐标差值大于等于0.3的峰。反之,若两者的重复序列长度分布(即两者的MSI分析结果图)基本一致,则判断该微卫星位点为稳定。
根据行业惯用标准,检测的微卫星位点中有大于等于30%的位点表现出不稳定性定义为高不稳定性,有小于30%的位点表现出不稳定性定义为低不稳定性,从而得到微卫星的不稳定性状态。
本实施例的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法将直肠癌患者的肿瘤组织作为检测样本,将直肠癌患者的癌旁组织作为对照品,根据测序得到的数据,分别统计各微卫星位点的重复序列长度分布,对比肿瘤组织和癌旁组织的MSI分析结果图,如图1至图10所示。判断结果为:MSI-1位点为不稳定,MSI-2位点为不稳定,MSI-3位点为稳定,MSI-4位点为不稳定,MSI-5位点为稳定,有60%的位点表现出不稳定性,所以该患者定义为微卫星高不稳定性(MSI-H)。
序列表
<110> 上海赛安生物医药科技股份有限公司
<120> 微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组及其检测方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 1
gacagaatgt acagtattgc gttttgaccc tttgagagcc aactttagtt tattcatctt 60
ga 62
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 2
gacagaatgt acagtattgc gttttgagac aatcgaggaa tgaggacaat tttgacaact 60
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 3
gacagaatgt acagtattgc gttttggctt cgaggcctca tacctttgag actac 55
<210> 4
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 4
gacagaatgt acagtattgc gttttgtgga cttcttagaa gaaagacagc agataaacat 60
aaggt 65
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 5
gacagaatgt acagtattgc gttttgtgcc ctgatgtcag ttatagattc cacagtct 58
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 7
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 7
taatgatacg gcgaccaccg agatctacac ctctctattc gtcggcagcg tcagatgtgt 60
ataagagaca gaatgtacag tattgcgttt tg 92

Claims (10)

1.一种微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组,其特征在于:包括探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5、引物FP-1和引物UP-2;所述探针MSI-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述探针MSI-2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述探针MSI-3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述探针MSI-4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,所述探针MSI-5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,所述引物FP-1的核苷酸序列如SEQID No.6所示,所述引物UP-2的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
2.根据权利要求1所述的微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组,其特征在于:所述探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4、探针MSI-5和引物FP-1用于目的区域捕获;所述引物FP-1和引物UP-2用于扩增。
3.根据权利要求1所述的微卫星不稳定性状态的二代测序引物探针组,其特征在于:各探针在反应体系中的最终浓度均为200nM,各引物在反应体系中的最终浓度为400nM。
4.一种微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,不用于疾病的诊断和治疗,其特征在于,包括以下步骤:
A. 分别对肿瘤患者的癌变组织样本和正常组织对照品进行DNA片段化处理,末端补齐加A尾,进行接头连接;
B. 设计用于目的区域捕获的引物和探针以及用于扩增的引物,所述探针是分别针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针,采用所述探针和引物进行目的区域捕获后扩增得到文库;
C. 测序得到癌变组织样本和正常组织对照品的五个微卫星位点的重复序列长度分布数据,对比两者数据,判断微卫星位点的稳定性。
5.根据权利要求4所述的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,其特征在于:所述步骤C中,将微卫星位点的重复序列长度分布数据绘制成MSI分析结果图,对比两者的MSI分析结果图,判断微卫星位点的稳定性;图中的横坐标为重复序列的长度,图中的纵坐标为重复序列各长度的reads总数与覆盖该位点reads总数的比值,通过比较图中的重复序列长度分布图形从而对比两者数据。
6.根据权利要求5所述的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,其特征在于:对比两者的MSI分析结果图,若两图中主峰的横坐标差值大于等于1bp,或者量两图中主峰的横坐标±3bp内,存在2个或2个以上纵坐标差值大于等于0.1的峰,或者两图中主峰的横坐标±3bp外,存在纵坐标差值大于等于0.3的峰,则判断该微卫星位点为不稳定;反之,则判断该微卫星位点为稳定。
7.根据权利要求4所述的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,其特征在于:所述单向DNA延伸探针包括5’端的illumina文库的通用接头序列和3’端的特异性互补序列,所述二代测序特异性互补序列能与相应微卫星位点上游或下游50bp长度内的基因组序列特异性互补的。
8.根据权利要求7所述的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,其特征在于:所述特异性互补序列的长度为25bp至45bp。
9.根据权利要求4所述的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,其特征在于:针对五个微卫星位点的单向DNA延伸探针分别是探针MSI-1、探针MSI-2、探针MSI-3、探针MSI-4和探针MSI-5,所述探针MSI-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述探针MSI-2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述探针MSI-3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述探针MSI-4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,所述探针MSI-5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
10.据权利要求4所述的微卫星不稳定性状态的二代测序检测方法,其特征在于:用于目的区域捕获的引物是引物FP-1,用于扩增的引物是引物FP-1和引物UP-2,所述引物FP-1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示,所述引物UP-2的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109830265A (zh) * 2019-01-18 2019-05-31 臻悦生物科技江苏有限公司 检测msi的试剂盒、参考数据库、其制备方法及应用
CN109949862A (zh) * 2019-03-13 2019-06-28 拓普基因科技(广州)有限责任公司 一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法
CN110556164A (zh) * 2019-09-09 2019-12-10 深圳裕策生物科技有限公司 用于目标区域捕获测序检测msi的方法、装置和存储介质
CN113373231A (zh) * 2021-06-23 2021-09-10 广州市金域转化医学研究院有限公司 泛癌种多基因msi位点靶向检测探针、试剂盒及应用
CN114085912A (zh) * 2022-01-20 2022-02-25 元码基因科技(北京)股份有限公司 用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组、系统、检测方法及其应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109830265A (zh) * 2019-01-18 2019-05-31 臻悦生物科技江苏有限公司 检测msi的试剂盒、参考数据库、其制备方法及应用
CN109830265B (zh) * 2019-01-18 2022-11-25 臻悦生物科技江苏有限公司 检测msi的试剂盒、参考数据库、其构建方法及应用
CN109949862A (zh) * 2019-03-13 2019-06-28 拓普基因科技(广州)有限责任公司 一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法
CN110556164A (zh) * 2019-09-09 2019-12-10 深圳裕策生物科技有限公司 用于目标区域捕获测序检测msi的方法、装置和存储介质
CN113373231A (zh) * 2021-06-23 2021-09-10 广州市金域转化医学研究院有限公司 泛癌种多基因msi位点靶向检测探针、试剂盒及应用
CN114085912A (zh) * 2022-01-20 2022-02-25 元码基因科技(北京)股份有限公司 用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组、系统、检测方法及其应用

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