CN107988372A - 一种检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包含针对PIK3CA、KRAS、BRAF基因突变位点的特异性引物、通用性引物、PCR混合试剂、阳性对照及磁珠。所述方法包括：提取待测样本的基因组DNA，特异性引物与目标模板DNA序列结合、通用引物扩增待测样本目标区域，磁珠纯化文库，对得到的文库进行高通量测序并分析突变情况。本发明的方法及试剂盒能够同时检测多个易感基因，简化实验步骤的同时提高检测灵敏度，适合对结直肠癌进行早期筛查和术后诊断，为个体化用药提供指导。

Description

一种检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术中的基因突变检测领域，更具体涉及一种检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒及其检测方法。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是结肠癌和直肠癌的总称，也称为大肠癌，指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的癌变。结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率居全球恶性肿瘤第三位，且呈逐年上升的趋势。结直肠癌早期症状如大便次数增多、大便有粘液和脓血，易误诊为痢疾、肠炎或痔疮等疾病，误诊率高达30％。

据统计，无侵袭转移的结直肠患者的5年生存率可高达90％，有局部转移者的5年生存率有68％，而带有远处转移者的5年生存率则仅有11％。因此早期发现是改善结直肠癌预后的关键。目前主要的结直肠癌筛查手段均有不同程度的缺陷：(1)常规血检类，特异性敏感性不强，对身体有创伤性；(2)影像学类，如结肠镜检查、软式乙状结肠镜、CT结肠成像、结肠钡剂灌肠等，此类方法具有的侵入性、易产生并发症等缺陷限制了其在普查筛选中的应用；(3)粪便潜血检测类，如粪便隐血试验、粪便免疫化学试验等，方便无创但特异性敏感性不强，且不同方法学的检测结果一致性较差；(4)肿瘤标记物检测类，阳性率低，同样缺乏特异性。

近年来基因检测技术高速发展，对结直肠癌易感基因及突变位点进行检测，得到其具体的基因序列信息，对于实现结直肠癌的早期诊断、风险评估及指导结直肠癌病人临床用药具有重要的参考价值。美国《国家综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》(2014年，第2版)指出，所有转移性结直肠癌患者都应进行肿瘤KRAS基因突变检测，对于KRAS野生型的患者应进行BRAF基因突变检测；携带KRAS突变基因的患者不能使用西妥昔单抗或帕尼单抗。

目前常用的基因突变检测方法主要是直接测序法与ARMS-PCR法。ARMS法可同时检测肿瘤组织中多种已知的常见突变，具有灵敏度高(可测出低至1％水平的突变)，操作简单，检测快速等优点；然而对于取样方便的血液样本如循环肿瘤细胞，肿瘤DNA含量过低，ARMS-PCR法不足以对其进行检测，同时该类试剂盒检测成本过高限制了在临床上的推广及应用。直接测序法是基因突变及多样性检测的金标准，具有技术成熟、结果准确和全面等优点，相比ARMS法检测费用低廉并且还能测出未知突变；而目前直接测序法主要的不足在于操作复杂，且检测灵敏度过低，只有突变达到大于10％甚至20％才能被可靠检出，不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。

新一代高通量测序(NGS)技术具有很高的敏感性和特异性，随着该技术的成熟及测序成本的持续降低，使用NGS技术进行结直肠癌易感基因突变检测具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明目的之一在于提供检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒，该试剂盒特异性强且灵敏度高；本发明的目的之二在于提供检测结直肠癌易感基因突变方法，该方法操作简单、检测周期短。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1.提供一组检测结直肠癌易感基因突变的引物，所述的通用引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

用于扩增PIK3CA基因突变位点的特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示；

用于扩增BRAF基因突变位点的特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示；

用于扩增KRAS基因突变位点的特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示。

2.提供一种结直肠癌易感基因突变位点检测试剂盒，主要成分如下：

3.提供一种结直肠癌易感基因突变位点检测的多重PCR体系：

4.提供一种结直肠癌易感基因突变位点检测方法，包括以下步骤：

A.抽提待测样品基因组DNA。

B.多重PCR法扩增待测样本基因组DNA的目标区域：

1)准备无菌、无核酸酶的200μL PCR管，置于冰上。

2)配制多重PCR体系，轻轻吹打混匀，离心后将管子置于冰上。3)将管子置于PCR仪中，按以下程序运行：

C.使用磁珠纯化文库。

D.对得到的文库质检后进行高通量测序并分析结直肠癌易感基因突变情况。

本发明基于高通量测序平台，使用多重PCR技术，可以快速、准确的实现多个结直肠癌易感基因突变的检测。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)将PIK3CA、KRAS、BRAF三个靶基因结合在一起进行结直肠癌诊断，可以极大的提高检测灵敏度；(2)使用全新方法设计引物，在大幅降低引物二聚体形成的同时，扩增子中容纳更长的真实序列，从根本上提高了引物特异性，提高扩增效率；(3)提供一种新型的数字条码索引技术MolecularTag，可将最原始的DNA分子被唯一性的捕获并标识，确保了低频变异筛选的准确性；(4)操作简单快速，5分钟人工操作，即可一步完成结直肠癌易感基因的靶向文库制备工作，节约成本，临床应用范围广。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为靶向文库制备示意图。

图2为Molecular Tag数字条码索引技术示意图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明发明内容，但不应理解为对该发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

通过检测已知突变类型及频率的标准品验证本试剂盒及方法的可靠性。

A.FFPE DNA提取

使用提取试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen，货号56404)对石蜡卷(Horizon，货号HD200)进行FFPE DNA提取，操作如提取试剂盒说明书所述。所得产物使用荧光定量仪及相应定量试剂(Invitrogen)进行定量，计算所提取的FFPEDNA浓度为20ng/μL。

B.多重PCR法扩增待测样本基因组的目标区域。

1).准备无菌、无核酸酶的200μL PCR管，置于冰上；按下表配制PCR反应体系，小心避免交叉污染。

其中引物基本信息如下所示，N表示A、C、G或T：

2).轻轻吹打混匀，离心，将管子置于冰上。

3).将管子置于PCR仪中，按以下反应程序运行：

C.使用磁珠纯化文库

1).向PCR产物中补加Nuclease-free水至50μL后转移至一个新的无核酸酶的离心管，加入50μL经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；

2).室温孵育5min后，将离心管置于磁力架上5min，小心吸弃上清；

3).保持离心管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，放置30s，吸弃上清，重复乙醇清洗步骤1次；

4).两次乙醇清洗后，室温放置5min，确保乙醇完全去除(注：为防止吸弃beads，在第一次弃乙醇时，可调整移液枪到95μL，富余5μL，第二次正常加入乙醇以及弃去乙醇，最后用小枪头，吸弃残余的5μL乙醇)；

5).将离心管从磁力架取下并加入50μL 10mMTris-HCL(pH 8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清至一个新的无核酸酶管，勿扰动磁珠。

6).转移上清至一个新的无核酸酶管并加入50μL经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；

7).重复第2-4步。用15μL 10mMTris-HCl(pH 8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清到新的200μL PCR管中。

8).特异性纯化后的文库使用Agilent2100仪器进行定量和质检，并对所得高通量文库进行Illumina X10平台150bp双端测序，数据量要求2G碱基对。

D.结果分析

1).数据分析

将测序下机后的数据进行数据质量分析，并去除无效数据，按照分子标签的唯一组合对有效数据进行归类，得到一系列具有唯一分子标签的数据子集reads。比对人类基因组(hg19)，使子集reads对应到相应的基因组位置，通过软件比对，当子集reads在同一位置都展示相同突变类型时，认为此突变是真实的。从而去除建库和测序过程中引入的背景噪音。

2).结果对比

Horizon公司的HD200FFPE DNA通过严格的细胞系构建和Bio-rad数字PCR(ddPCR)验证，提供的突变信息如下表所示。需要注意：Horizon厂家提供的突变频率在理论突变频率的±10％都属于合理范围。

本试剂盒内包括上表的部分位点，测序分析后的结果与horizon公司提供的突变信息对比结果如下表所示，本试剂盒所覆盖的5个位点与HorizonFFPE标准品DNA相对，突变频率都落在理论的合理范围。

实施例2

通过检测病人血浆中目标基因组DNA的突变类型及频率，与数字PCR(ddPCR)检测结果进行对比验证本试剂盒的可靠性。

A.病人血浆目标基因组DNA提取

使用提取试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen，货号55114)对5病人的血浆进行目标基因组DNA的提取，操作如提取试剂盒说明书所述。所得产物使用荧光定量仪及相应定量试剂(Invitrogen)进行定量，计算所提取的DNA浓度为15.0ng/μL。

B.多重PCR法扩增待测样本基因组的目标区域。

1).准备无菌、无核酸酶的200μL PCR管，置于冰上；按下表配制PCR反应体系，小心避免交叉污染。

其中引物基本信息如下所示，N表示A、C、G或T：

2).轻轻吹打混匀，离心，将管子置于冰上。

3).将管子置于PCR仪中，按以下反应程序运行：

C.使用磁珠纯化文库

1).向PCR产物中补加Nuclease-free水至50μL后转移至一个新的无核酸酶的离心管，加入50μL经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；

2).室温孵育5min后，将离心管置于磁力架上5min，小心吸弃上清；

3).保持离心管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，放置30s，吸弃上清，重复乙醇清洗步骤1次；

4).两次乙醇清洗后，室温放置5min，确保乙醇完全去除(注：为防止吸弃beads，在第一次弃乙醇时，可调整移液枪到95μL，富余5μL，第二次正常加入乙醇以及弃去乙醇，最后用小枪头，吸弃残余的5μL乙醇)；

5).将离心管从磁力架取下并加入50μL 10mMTris-HCL(pH 8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清至一个新的无核酸酶管，勿扰动磁珠。

6).转移上清至一个新的无核酸酶管并加入50μL经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；

7).重复第2-4步。用15μL 10mMTris-HCl(pH 8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清到新的200μL PCR管中。

8).特异性纯化后的文库使用Agilent2100仪器进行定量和质检，并对所得高通量文库进行illumina X10平台150bp双端测序，数据量要求2G碱基对。

D.结果分析

1).数据分析

将测序下机后的数据进行数据质量分析，并去除无效数据，按照分子标签的唯一组合对有效数据进行归类，得到一系列具有唯一分子标签的数据子集reads。比对人类基因组(hg19)，使子集reads对应到相应的基因组位置，通过软件比对，当子集reads在同一位置都展示相同突变类型时，认为此突变是真实的。从而去除建库和测序过程中引入的背景噪音。

2).结果对比

对病人ctDNA样本进行Bio-rad数字PCR验证，结果对比如下表所示，结果显示使用两个平台对同一病人ctDNA样本进行检测所得的突变频率具有极高的符合性。该结果可证明本试剂盒的性能的准确性及稳定性。

实施例3

通过检测病人FFPE样本DNA的突变类型及频率，与数字PCR(ddPCR)检测结果进行对比验证本试剂盒的可靠性。

A.病人FFPE样本DNA提取

使用提取试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen，货号56404)对5病人的FFPE组织样本进行提取，操作如提取试剂盒说明书所述。所得产物使用荧光定量仪及相应定量试剂(Invitrogen)进行定量，计算所提取的DNA浓度为24.0ng/μL。

B.多重PCR法扩增待测样本基因组的目标区域。

1).准备无菌、无核酸酶的200μL PCR管，置于冰上；按下表配制PCR反应体系，小心避免交叉污染。

其中引物基本信息如下所示，N表示A、C、G或T：

。

2).轻轻吹打混匀，离心，将管子置于冰上。

3).将管子置于PCR仪中，按以下反应程序运行：

C.使用磁珠纯化文库

1).向PCR产物中补加Nuclease-free水至50μL后转移至一个新的无核酸酶的离心管，加入50μL经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；

2).室温孵育5min后，将离心管置于磁力架上5min，小心吸弃上清；

3).保持离心管在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，放置30s，吸弃上清，重复乙醇清洗步骤1次；

4).两次乙醇清洗后，室温放置5min，确保乙醇完全去除(注：为防止吸弃beads，在第一次弃乙醇时，可调整移液枪到95μL，富余5μL，第二次正常加入乙醇以及弃去乙醇，最后用小枪头，吸弃残余的5μL乙醇；)

5).将离心管从磁力架取下并加入50μL 10mMTris-HCL(pH 8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清至一个新的无核酸酶管，勿扰动磁珠。

6).转移上清至一个新的无核酸酶管并加入50μL经过充分混匀的beads(室温)，吹打混匀；

7).重复第2-4步。用15μL 10mMTris-HCl(pH 8.0)，轻轻吹打重悬磁珠。室温放置5min后将离心管置于磁力架上室温5min直到溶液澄清。转移上清到新的200μL PCR管中。

8).特异性纯化后的文库使用Agilent2100仪器进行定量和质检，并对所得高通量文库进行illumina X10平台150bp双端测序，数据量要求2G碱基对。

D.结果分析

1).数据分析

将测序下机后的数据进行数据质量分析，并去除无效数据，按照分子标签的唯一组合对有效数据进行归类，得到一系列具有唯一分子标签的数据子集reads。比对人类基因组(hg19)，使子集reads对应到相应的基因组位置，通过软件比对，当子集reads在同一位置都展示相同突变类型时，认为此突变是真实的。从而去除建库和测序过程中引入的背景噪音。

2).结果对比

对病人FFPE样本进行Bio-rad数字PCR验证，结果对比如下表所示，结果显示使用两个平台对同一病人样本进行检测所得的突变频率具有极高的符合性。该结果可证明本试剂盒的性能的准确性及稳定性。

序列表

<110> 杭州联川基因诊断技术有限公司

<120> 一种检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒及其检测方法

<141> 2018-01-03

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc agctgtaaca cgttcagagt tctacagtcc 60

ga 62

<210> 2

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagcagaag acggcatacg agatttcgaa cggtgactgg agttccttgg cacccgagaa 60

ttcca 65

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 62

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacgttcaga gttctacagt ccgacgatnn nnnnnnnnnn nnnnctgatg ggacccactc 60

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccttggcacc cgagaattcc annnnnnnnn nnnnnnncct cagatatatt tcttca 56

<210> 9

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacgttcaga gttctacagt ccgacgatnn nnnnnnnnnn nnnnccacaa aatgattctg 60

a 61

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccttggcacc cgagaattcc annnnnnnnn nnnnnnnaaa tgactgaata taaac 55

Claims (9)

1.一组检测结直肠癌易感基因突变的引物，其特征在于，包含通用性引物和特异性引物。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的通用性引物核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的特异性引物包括：

用于扩增PIK3CA基因突变位点的特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3～6所示；

用于扩增BRAF基因突变位点的特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；

用于扩增KRAS基因突变位点的特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的特异性引物可以被硫代修饰、2-氟代核糖核酸修饰、2'-O-甲基核糖核酸修饰、5-甲基脱氧胞嘧啶修饰、脱氧次黄嘌呤修饰、2-氨基嘌呤修饰、5-溴-脱氧尿嘧啶修饰、反向dT修饰、双脱氧胞苷修饰、间臂修饰、氨基修饰、巯基修饰、磷酸化修饰、生物素修饰、锁核苷酸修饰中的任意一种方式修饰，也可以是多种方式同时修饰。

5.一种检测结直肠癌易感基因突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-4中任一项所述的引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR混合反应液、纯化磁珠和阳性对照。

7.根据权利要求5-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR混合反应液包括DNA聚合酶、dNTPs和2×PCR缓冲液。

8.一种非疾病诊断目的的检测结直肠癌易感基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的基因组DNA，特异性引物与模板基因组DNA序列结合、通用引物扩增待测样本目标区域，磁珠纯化文库，对得到的文库进行高通量测序并分析结直肠癌易感基因的突变。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样品为组织切片、石蜡包埋组织和血浆中的一种或多种。