CN107955835A - 一种检测brca1/2基因突变的引物池及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测BRCA1/2基因突变的引物组及方法。所述引物组包括三个引物池，共有97对引物，其上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～194所示。首先提取待测样本DNA，利用上述三个引物池进行多重PCR扩增，然后将三个引物池扩增所得目的片段合在一起，构建文库；最后文库测序并通过生物信息分析，获得样本BRCA1/2基因突变情况。该方法具有高通量、高准确性、高灵敏度、高自动化程度、样本需求量少、低成本、快速、可检测多种突变类型、可同时检测多位点突变等优点，可应用于肿瘤高风险筛查、用药指导以及预后等，在国内BRCA1/2基因突变检测及致病性分析评估方面具有重要的意义，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因分析技术领域。更具体地，涉及一种基于半导体测序技术的BRCA1/2基因突变的检测引物池、检测方法及试剂盒。
背景技术
BRCA1/2基因是一类肿瘤抑制基因，参与细胞同源重组修复(HRR)过程，能确保细胞的遗传物质(DNA)的稳定性，防止细胞变异。携带BRCA1或BRCA2的有害突变的人群罹患卵巢癌和乳腺癌的风险将显著增高，并且还存在一定的家族遗传性。同时，有害的BRCA1/2突变还可能增加患胰腺癌，胃癌，胆囊和胆管细胞癌，黑色素瘤、男性乳腺癌等其它风险。
另外，研究发现BRCA1/2突变患者的5年生存率显著高于未突变者，对于铂类、脂质体阿霉素的敏感性也优于未突变者。BRCA1/2突变的患者(如卵巢癌、乳腺癌)给予PARPi，可显著抑制、杀死肿瘤细胞，延长患者的无进展生存。奥拉帕利是全球第一个针对BRCA1/2突变的PARPi，2014年，EMA批准奥拉帕利用于铂类敏感复发的BRCA突变卵巢癌，美国FDA批准了奥拉帕利可用于既往三线及以上铂类化疗的BRCA突变卵巢癌患者。因此卵巢癌患者的BRCA突变检测，能更好的评估患者预后、优化治疗方案、评价其亲属卵巢癌发病风险。
BRCA1基因定位于人类染色体17q21，于1994年由Miki等克隆成功。BRCA1具有24个外显子，1号外显子不参与蛋白质的编码，4号外显子编码Alu重复序列，其中22个外显子编码一个具有1863个氨基酸的蛋白质，分子量为180000～220000D。BRCA2基因定位于人类染色体13q12-13，于1995年由Wooste克隆成功，它具有27个外显子，编码区长度为11.2kb，大约为BRCA1基因的2倍，编码一个具有3418个氨基酸的蛋白质。BRCA1/2基因发现已有20多年，针对不同人群的BRCA突变情况，已有较多报道，其中在卵巢癌家族史人群，BRCA胚系突变的发生率大致在12％～80％，而在散发的卵巢癌患者，BRCA胚系突变发生率为5％～29％，但研究数据的人群都是以高加索人种为主，仅有少量研究涉及到亚裔人群。此外，BRCA基因序列较大，整个BRCA基因的编码区突变都有可能造成BRCA基因的功能异常，而且目前的数据发现BRCA突变缺乏明确的突变热点，因此BRCA检测需要通过整个编码区的测序，通过比对目前大样本的数据库分析来确认，目前使用的数据库都是欧美人群的BRCA突变数据，缺乏中国人群特有的BRCA突变数据，因此中国人群的BRCA突变确认存在障碍。到目前为止，尚没有针对中国人群的BRCA突变率及突变特点的大样本研究。因此，针对中国人群的BRCA胚系突变情况的研究显得尤为迫切。
目前常用的BRCA1/2突变检测方法有：变性高效液相色谱分析技术(denaturinghigh performance liquid chromatography，DHPLC)、单链构象多态性检测(single-strand conformation polymorphism，SSCP)、多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification，MLPA)、蛋白质截断测试(proteintruncation test，PTT)、高分辨率溶解曲线(high resolution melting，HRM)、一代测序(Sanger sequencing)以及高通量测序(NGS)等。DHPLC与HRM方法虽然检测准确性、敏感性以及特异性高，快速高效无毒，但是不能准确检测出具体突变类型。SSCP与PTT的优点在于快速且价格便宜，缺点是检测灵敏度低。MLPA法虽然高效、特异，但只能用于检测已知突变，比较适用于对已知“founder mutation”的人群进行筛查。一代测序虽然可以较为全面检测BRCA1/2突变，但其成本高，且不能检测大片段缺失重排，需联合MLPA使用。然而BRCA1/2基因较为庞大，突变分布于整个编码区，多为点突变或小的插入与缺失，且无热点突变，需要通过全基因扫描才能确定每个个体的突变情况。而高通量测序具有高通量、高准确性、高灵敏度、高自动化程度、低运行成本以及可检测多种突变类型等优点，因此在检测BRCA1/2突变中具有巨大的潜力和广阔的前景。
目前欧美很多国家已经制定了适合BRCA1/2基因突变检测的人群标准。通过对这部分高危人群进行遗传咨询和遗传检测，可对突变携带者给予早期筛查与预防干预，对突变患者进行个体化治疗。但是，不同人群的外显率及突变频率均不相同，因此中国人群的BRCA1/2突变致病性确认仍存在障碍。然而在中国，目前尚未建立规范的遗传咨询机构，仅有的一些小规模或针对部分外显子的研究，BRCA1/2突变数据库数据根本不足以支持遗传风险评估。如果直接使用欧美人群的数据来解读中国人群的BRCA1/2突变是不准确的，且将可能会造成误诊。因此，建立中国人群的BRCA1/2突变数据库和标准品以规范BRCA1/2突变检测在临床的应用，具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有中国人群的BRCA1/2基因突变检测及致病性分析评估技术的缺陷和不足，提供一种BRCA1/2基因突变的高通量检测方法，基因检测区域包括BRCA1/2外显子及可变剪切区域。具体是以多重PCR技术为基础结合高通量测序平台对BRCA1/2基因功能区突变进行检测的方法。该方法是采用灵敏度高、样本需求量少、可同时检测多位点突变的高通量测序技术，通过设计多重PCR引物并建库，建立的一种高准确性，高通量，低成本，快速的BRCA1/2基因突变检测方法。
本发明的目的是提供一种检测BRCA1/2基因突变的引物组。
本发明另一目的是提供一种BRCA1/2基因突变的检测方法。
本发明的再一目的是提供一种检测BRCA1/2基因突变的试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种检测BRCA1/2基因突变的引物组，即BRCA1/2基因及其可变剪切区特异性扩增引物，包括三个引物池，引物池1包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQID NO.1～84所示；引物池2包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.85～168所示；引物池3包括13对引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.169～194所示。
上述引物组在检测BRCA1/2基因突变方面的应用，在制备BRCA1/2基因突变检测试剂盒方面的应用，以及在构建包含BRCA1/2基因及可变剪切区的文库方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种BRCA1/2基因突变的检测方法，包括如下步骤：
S1.分别用权利要求1所述三个引物池进行多重PCR扩增BRCA1/2外显子及可变剪切区；
S2.将三个引物池扩增所得目的片段合在一起，并进行文库构建；
S3.基于构建的文库，通过半导体测序法获取BRCA1/2基因信息，并通过生物信息分析，获得样本BRCA1/2基因突变情况。
其中，所述的多重PCR是指：针对BRCA1/2外显子及可变剪切区的特异性扩增引物共97对，分成三个引物池，每个引物池包含的特异性引物见表1；以对样本提取获取的基因组DNA作为模板进行扩增。
优选地，所述多重PCR扩增反应的循环数是18个循环。
三个引物池是在设计了合适的BRCA1/2基因及其可变剪切区特异性扩增引物对的基础上，进一步根据引物之间的干扰和扩增均一性分成三个引物池。
本发明的方法根据文库序列与标准参考序列进行比对来判定是否有突变发生。本方法选用的BRCA1/2基因外显子及可变剪切区的序列是存在于人体细胞中的遗传物质，在人群中存在遗传异质性，不同种族突变位点、频率及外显性都不同。因此，需要建立高效、准确的BRCA1/2基因突变检测方法，依据本方法可以检测BIC数据库中三千多种点突变以及未知的点突变。
具体地，本发明所述BRCA1/2基因突变的检测方法，包括如下步骤：
(1)样本DNA提取：对静脉血进行DNA提取得到待测样本DNA；
(2)目的片段扩增：以待测样本DNA为模板，分别利用权利要求1所述三个引物池进行多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；
(3)消化引物序列：将步骤(2)中三个引物池扩增所得目的基因DNA片段合在一起，然后与引物消化液混合反应，得到去除已知扩增引物的平末端目的基因DNA片段；
(4)接头连接：将步骤(3)得到的平末端目的基因DNA片段与连接缓冲液、P1接头、特异性接头1-16、DNA连接酶和无核酸酶水混合后进行连接反应，得到加接头的DNA片段，即接头DNA片段；
(5)纯化连接产物及文库扩增：用磁珠对步骤(4)得到的接头DNA片段进行纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化后的接头DNA片段；然后加入文库扩增引物及文库扩增反应液对纯化后的接头DNA片段进行PCR扩增，最后用磁珠对扩增的产物进行纯化，去除多余的大片段和小片段，得到最终的文库；
(6)文库质检(检测文库浓度)：将步骤(5)得到的文库测出浓度，建议将其稀释到200pmol/L，最后采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度，作为测序文库；
(7)模板制备和富集：将步骤(6)得到的测序文库进行乳液PCR扩增，再通过磁珠进行富集纯化，得到上机模板；
(8)上机测序：将步骤(7)得到的上机模板进行上机测序；
(9)数据分析：通过对数据的分析，与参考序列比对获取BRCA1/2突变信息。
其中，优选地，步骤(1)所述DNA提取所用试剂为Omega公司的OMEGAE.Z.N.A.TMBlood DNA Kit。
步骤(2)所述PCR反应分成三个扩增反应，每个引物池对应一个扩增，每个反应所需gDNA量均为10ng，根据DNA浓度，计算DNA体积。
优选地，步骤(2)所述PCR反应体系如下：
优选地，步骤(2)所述PCR反应条件如下：
优选地，步骤(3)所述引物消化液为引物清除试剂FuPa Reagent。
优选地，步骤(3)中，与引物消化液混合反应的反应条件如下：
另外，步骤(4)所述P1接头和特异性接头1-16的序列如实施例1中所示。
优选地，步骤(4)所述连接反应的反应体系如下：
优选地，步骤(4)中所述反应条件如下：
优选地，步骤(5)中所述的磁珠为XP Reagent。
步骤(5)中所述文库扩增反应液为文库扩增酶PlatiumTM PCR SuperMix HighFidelity。
优选地，步骤(5)中所述PCR扩增的反应体系如下：
优选地，步骤(5)中所述PCR扩增的反应条件如下：
优选地，步骤(6)中所用到的试剂为英潍捷基(上海)贸易有限公司Qubit dsDNAHS Assay Kit及北京普凯瑞生物科技公司的KAPA SYBR FAST Universal 2X qPCR MasterMix试剂。
优选地，步骤(7)中所用到的仪器为：Ion OneTouchTM 2和Ion OneTouchTM ES。
优选地，步骤(8)中所用到的仪器为：PGM、Proton或DA8600。
本发明在上述设计的BRCA1/2基因突变检测引物池和构建的检测方法的基础上，还提供了一种检测BRCA1/2基因突变的试剂盒，该试剂盒包含所述检测BRCA1/2基因突变的引物组，即三个引物池。
优选地，所述试剂盒还包含PCR反应液、DNA连接酶、引物消化液、连接缓冲液、P1接头序列、特异性接头1-16序列、文库扩增反应液、文库扩增引物、磁珠、75％乙醇和/或无核酸酶水。
另外，一种包含BRCA1/2基因及可变剪切区的文库也在本发明的保护范围之内，该文库由上述检测方法中的步骤(1)～(5)或步骤(1)～(6)所述方法制备得到。
该文库在检测BRCA1/2基因突变方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明的BRCA1/2基因突变检测引物组以及构建的完善的BRCA1/2基因突变检测方法，具有高通量、高准确性、高灵敏度、高自动化程度、样本需求量少、低运行成本、快速、可检测多种突变类型、可同时检测多位点突变等优点，可应用于肿瘤高风险筛查、用药指导以及预后等，具有广阔的应用前景。
本发明的引物组及检测方法针对的是BRCA1/2基因外显子及可变剪切区域，BRCA1/2基因检测存在其挑战性，由于BRCA1/2基因长度长、突变种类多、覆盖基因全外显子及内含子拼接区，检测范围广，且存在未知与低频突变、大的基因重排，更重要的是与中国人群密切相关的突变位点尚未明确。本方法的建立可以全面检测BRCA1/2基因突变，便于下一步中国人群BRCA1/2基因突变数据库的建立，填补国内数据不足的空白，在国内BRCA1/2基因突变检测及致病性分析评估方面具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明基于半导体测序平台检测BRCA1/2基因突变的方法流程图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明所用试剂均可由市场购得：其中，5×Ion AmpliseqTM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion AmpliseqTM Primer Pool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，IonP1Adapter和Ion XpressTM Barcode X(Life公司)，Switch Solution(Life公司)，DNALigase(Life公司)，XP Reagent(Beckman公司)，PlatiumTM PCRSuperMix High Fidelity(Life公司)，Library Amplification Primer Mix(Life公司)。
实施例1基于半导体测序平台的BRCA1/2基因突变检测方法在阴性、阳性样本中的应用
1、实验材料
本实施例采用以下试剂：Omega公司的OMEGA E.Z.N.A.TM Blood DNA Kit，5×IonAmpliseqTM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion AmpliseqTM Primer Pool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，Ion P1Adapter和Ion XpressTM Barcode X(Life公司)，SwitchSolution(Life公司)，DNA Ligase(Life公司)，XP Reagent(Beckman公司)，PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity(Life公司)，Library AmplificationPrimer Mix(Life公司)，Nuclease-Free Water，无水乙醇、Low TE(Life公司)。
本方法实验前需要新鲜配置一种试剂：75％乙醇。
本实验需要用到的仪器和设备：离心机、磁力架、移液器、PCR仪、振荡器、荧光计Qubit 3.0。
2、BRCA1/2基因突变的检测方法
方法流程如图1所示，具体主要步骤如下：
(1)待测样本gDNA提取：
本实施例中，gDNA样本来自EDTA抗凝全血。采用OMEGA E.Z.N.A.TM Blood DNA Kit提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作步骤提取。
(2)目的片段扩增：
以待测样本gDNA为模板，分别利用表1所示的三个引物池进行多重PCR反应，得到目的基因DNA片段。采用dsDNA HS Assay Kit试剂盒进行gDNA浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。所述PCR反应分成三个管进行扩增反应，每个引物池对应一个扩增，每个反应所需gDNA量均为10ng，根据gDNA浓度，计算gDNA体积。
具体地，所述PCR反应体系如下：
所述PCR反应条件如下：
表1特异性扩增引物序列及其属反应池列表
(3)消化引物序列(引物清除)：
将步骤(2)中得到的三管目的基因DNA片段合在一管，然后加入2μL引物清除试剂FuPa Reagent，涡旋混匀反应，瞬时离心，得到去除已知扩增引物的平末端目的基因DNA片段；
所述反应的反应条件如下：
(4)接头连接：
将步骤(3)得到的平末端目的基因DNA片段与连接缓冲液、P1接头、特异性接头1-16、DNA连接酶和无核酸酶水混合后进行连接反应，得到加接头的DNA片段，即接头DNA片段；
具体地，首先将P1接头和特异性接头1-16稀释按照如下比例混合形成接头混合液：
然后，所述连接反应的反应体系如下：
所述反应条件如下：
另外，所述P1接头的序列：
5'—CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT–3'
3'—TTGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5'
另外，所述特异性接头是由如下正反两个序列组成，其中“NNNNNNNNNN”代表标签序列：
5'—CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT–3'
3'—CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'
具体5'到3'的标签序列如下表2所示(3'到5'的与之互补)：
表2
即具体地，所述特异性接头1-16的序列如表3所示。
表3
连接反应后，P1接头序列被连接在DNA片段的一端，特异性接头序列被连接在另一端。
(5)纯化连接产物及文库扩增纯化：
用XP Reagent磁珠对步骤(4)得到的接头DNA片段进行纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化后的接头DNA片段；具体方法为：1)将PCR产物转移至1.5ml EP管内，加入45μLXP Reagent，吹打混匀；2)室温孵育5min；3)将样本放置磁力架上，静置3mn至管内溶液澄清，小心吸取上清液并弃去；4)加入300μL新鲜配制的75％乙醇，转动EP管清洗磁珠，弃去乙醇；5)重复步骤4)一次；6)室温晾干磁珠，不要过度干燥。
然后纯化后晾干的磁珠中，加入2μL文库扩增引物Library AmplificationPrimer Mix(上游引物序列：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'，下游引物序列：5'-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3')及50μL文库扩增反应液(即文库扩增酶PlatiumTM PCRSuperMix High Fidelity)，重悬磁珠，转移至PCR管中，涡旋混匀，进行PCR扩增。
所述PCR扩增的反应体系如下：
所述PCR扩增的反应条件如下：
扩增的产物即为文库，最后用磁珠对文库进行纯化，去除多余的大片段和小片段，得到最终的文库。具体是采用XP Reagent磁珠纯化产物：1)每管加入30μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟；2)将EP管置于磁力架上，吸附5min至溶液变澄清之后，将上清液转移到另一标记的EP管中，注意不要吸到磁珠；3)每管加入40μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟；4)将EP管置于磁力架上，吸附3分钟至溶液变澄清之后，吸去溶液，注意不要吸到磁珠；5)吸取300μL 75％的乙醇于EP管，轻轻旋动EP管清洗磁珠。液澄清后吸去溶液，注意不要吸到磁珠；6)重复上一步；7)取下EP管，低速离心10秒。将EP管置于磁力架上，用移液枪吸去残留溶液，注意管壁上不能有残留。将EP管盖打开，室温静置5分钟，晾干磁珠；8)吸取50μL洗脱液(Low TE)于EP管内，涡旋混匀，离心5秒，室温放置5分钟；9)将EP管置于磁力架上，静置3分钟至溶液澄清后，小心转移液体到新的EP管中，并标记文库名称。
(6)检测文库浓度：
将步骤(5)得到的文库采用dsDNA HS Assay Kit试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。
文库建议根据下列公式稀释到200pmol/L：
稀释后使用荧光定量PCR仪定量，等质量混合后上机测序。
所用到的试剂为英潍捷基(上海)贸易有限公司Qubit dsDNA HS Assay Kit及北京普凯瑞生物科技公司的KAPA SYBR FAST Universal 2X qPCR Master Mix试剂。
(7)进行模板制备和富集：
将步骤(6)得到的测序文库进行乳液PCR扩增，再通过磁珠进行富集纯化，得到上机模板；所用到的仪器为：Ion OneTouchTM 2和Ion OneTouchTM ES。
(8)上机高通量测序：将步骤(7)得到的上机模板采用Ion Proton、Ion PGM或DA8600测序平台进行高通量测序。
(9)数据分析：通过对数据的分析，与参考序列(人类基因BRCA1/2基因标准序列)比对获取BRCA1/2基因突变信息。
3、数据分析结果
BC1为BRCA1/2基因突变阴性样本，BC2为BRCA1基因突变阳性样本，BC3为BRCA2突变阳性样本，具体结果见表4。
表4 BRCA1/2基因突变结果
通过对测序结果进行分析，所有样本的覆盖度均达到或超过85％，均一性平均达到90％，每次测序反应样本的数据量分布均匀。
序列表
<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司
<120> 一种检测BRCA1/2基因突变的引物池及检测方法
<160> 228
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对1上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 1
ccaaatttat ctccagaaat cttgcaca 28
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对1下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 2
ttaaggtcta tccaaaactt tattgccagt 30
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对2上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 3
agaactaatt aactgttcag cccagtt 27
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对2下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 4
cctaaacaat catgtataca gatgatgcct 30
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对3上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 5
agagaagcaa aatccactac taatgcc 27
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对3下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 6
atggagattc cataaactaa caagcactt 29
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对4上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 7
tagcttatct gtggtatctg gtagca 26
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对4下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 8
gctttttgaa gcctttaagg atttttcttg 30
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对5上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 9
aatttgtcca gatttctgct aacagtact 29
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物对5下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 10
gtggtggctc agctacttga g 21
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对6上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 11
agtttattca ctgtgttgat tgacctttc 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对6下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 12
cacatatagg accaggttta gagactttc 29
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对7上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 13
tcagcaaact gaaaaacctc ttcttaca 28
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物对7下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 14
tcttctacca ggctcttagc caa 23
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对8上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 15
cagatattag ccatctgtaa tgtagttggt 30
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对8下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 16
catttgcctg tgattattca aggct 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对9上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 17
cccagaagct gattctctgt catg 24
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对9下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 18
tctgacattt tgtatgattc tttgcctcta 30
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对10上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 19
tccagactct gaagaacttt tctcaga 27
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对10下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 20
ttgacctaga gtcattttta tatgctgctt 30
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对11上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 21
agcttgtgtt gaaattgtaa ataccttgg 29
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对11下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 22
ctcagaagtg gtctttaaga tagtcatctg 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对12上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 23
aagctgtgaa actgtttagt gatattgaga 30
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对12下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 24
atcagtaaat agcaagtccg tttcatctt 29
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对13上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 25
agggaaacac tcagattaaa gaagatttgt 30
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对13下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 26
caactgggac actttctttc agtattttg 29
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对14上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 27
cctttttgat gaaaaagagc aaggtact 28
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对14下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 28
ggctgaattt tcaatgactg aataaggg 28
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对15上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 29
atgacaaaaa tcatctctcc gaaaaacaag 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对15下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 30
ggtggcccta cctcaaaatt attactatta 30
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对16上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 31
acataaggtt tttgctgaca ttcagagt 28
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对16下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 32
ggaaaagact tgcttggtac tatcttctat 30
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对17上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 33
tcttcactat tcacctacgt ctagaca 27
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对17下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 34
cacaggaaca tcagaaaaag tttcagtttt 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对18上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 35
gttgttgaat tcagtatcat cctatgtggt 30
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对18下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 36
cagactacac agaaacctta accatactg 29
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对19上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 37
cacattatta cagtggatgg agaagacat 29
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对19下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 38
tgttgctatt ctttgtctaa caccaaaaa 29
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对20上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 39
aaacaaattt tccagcgctt ctga 24
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对20下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 40
gcaaacgatg attatgttgt taactggatt 30
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物对21上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 41
cctcacagta ccttcctatg gca 23
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对21下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 42
aaagactctg catttttgct gttaattttt 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对22上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 43
tagaaaggaa aattccaatt cgaaagtcct 30
<210> 44
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对22下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 44
ccagaattga cagcttcaac agaaag 26
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对23上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 45
acaatactta tttatgtggt tgggatggaa 30
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物对23下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 46
gcctggcctg aatgccttaa ata 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物对24上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 47
gtagccagga cagtagaagg act 23
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对24下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 48
aggaccctgg agtcgattga tt 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对25上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 49
acccatccct tacagatgga gt 22
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对25下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 50
gaccattgtc ctttggagca ga 22
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对26上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 51
gcaataaaag tgtataaatg cctgtatgca 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对26下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 52
aaaccaattt gtgtatcata gattgatgct 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对27上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 53
acgacatttg acagagaatg atactctaac 30
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对27下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 54
ctaaaggaga gagcagcttt cactaa 26
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对28上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 55
atgttggagc taggtcctta ctct 24
<210> 56
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对28下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 56
actaggtgat ttcaattcct gtgctaaa 28
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对29上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 57
ccaatacatc agctactttg gcatttg 27
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对29下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 58
aaggctgaat tctgtaataa aagcaaacag 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对30上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 59
aattaaagac cttttggtaa ctcagactca 30
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对30下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 60
tgttttcagc ctctgattct gtcac 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对31上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 61
agtagtgcag atacccaaaa agtgg 25
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对31下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 62
ctgcacaaaa actttaactg tctgaagaat 30
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对32上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 63
gatagattta tcgcttctgt gacagaca 28
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对32下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 64
caatggtgcc aattaaaaag agtagttcag 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对33上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 65
gaagaagaaa acaaatggtt ttaccaagga 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对33下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 66
acatagggtt tctcttggtt tctttgatta 30
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对34上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 67
ggaggaacat gtttcaagtt taagaagc 28
<210> 68
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对34下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 68
ggaaacaaaa tgttctgcta gcttgtttt 29
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对35上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 69
gtaaccctga gccaaatgtg tatg 24
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对35下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 70
ccaaaattga atgctatgct tagattaggg 30
<210> 71
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对36上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 71
cctcaaagtt ttcctctagc agatttttc 29
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对36下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 72
ggtccttaaa gaaacaaagt ccaaaagt 28
<210> 73
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对37上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 73
cagcctattc tttttaggtg cttttgaat 29
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对37下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 74
actgagccac agataataca agagc 25
<210> 75
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对38上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 75
actttaacag gatttggaaa aacatcagg 29
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对38下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 76
ccactctcaa agggcttctg at 22
<210> 77
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对39上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 77
attctttgcc acgtatttct agcct 25
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对39下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 78
cactttcaga ggcttcagtt tcttttt 27
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物对40上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 79
tctcagccca gatgacttca aag 23
<210> 80
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对40下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 80
ccagacaaaa gagcttgggt atttatca 28
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对41上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 81
gctgcacact gactcacaca tt 22
<210> 82
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对41下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 82
gccaaatgaa cagacaagta aaagacat 28
<210> 83
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对42上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 83
caaccaaagt ctttgttcca cctttta 27
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对42下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 84
gggaaaacca tcaggacatt atttaacaac 30
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对43上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 85
aggagaaccc tcaatcaaaa gaaacttatt 30
<210> 86
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对43下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 86
tataaagagg tccttgatta ggcacagt 28
<210> 87
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物对44上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 87
tgatagattt aattacaagt cttcagaatg cca 33
<210> 88
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物对44下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 88
aatgaaataa aattacactc tgtcataaaa gcc 33
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物对45上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 89
gtgcctggcc tgatacaatt aac 23
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对45下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 90
ttcttcctct ctttcattgc gaaatatgta 30
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对46上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 91
aggtgagttt taattgtgta gaactgct 28
<210> 92
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对46下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 92
caatgtggtc tttgcagcta tttactt 27
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对47上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 93
tgcaagtttt tcaggtcata tgactga 27
<210> 94
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对47下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 94
tgcaaatgta agtggtgctt caaaag 26
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对48上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 95
gttctgggtc acaaatttgt ctgtc 25
<210> 96
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对48下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 96
acacaggttt gcctaaattc ctagtt 26
<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对49上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 97
gagaatttga caatagcgtt atacctttgc 30
<210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对49下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 98
gagatgacaa ttatcaacct catctgct 28
<210> 99
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物对50上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 99
agaaacattt aaatagcatt aagaacttgt agc 33
<210> 100
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对50下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 100
aggaaagaat ccaagtttgg tataccag 28
<210> 101
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对51上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 101
tgttggcatt ttaaacatca cttgatgat 29
<210> 102
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对51下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 102
tcacaaactt tggtgtatga aacaaactc 29
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对52上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 103
cttatcttta aatctccctt ctttgggtgt 30
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对52下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 104
agcatttcaa catactcctt cctgt 25
<210> 105
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对53上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 105
aaaaactcag tatcaacaac taccggta 28
<210> 106
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对53下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 106
gatcactagt tagctagcaa atttgcc 27
<210> 107
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对54上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 107
aatggtcaca gggttatttc agtgaa 26
<210> 108
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对54下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 108
gcattagtag tggattttgc ttctctgata 30
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对55上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 109
actgtgccca aacactacct tt 22
<210> 110
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对55下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 110
tgctttttgg atcattttca cactgtc 27
<210> 111
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对56上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 111
cttccaagga tgttctgtca aaccta 26
<210> 112
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对56下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 112
tcctttcatt agctacttgg aagacaaaat 30
<210> 113
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对57上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 113
gctacatatt gcagaagagt acatttgaag 30
<210> 114
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对57下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 114
tattggatgt acctctgcag aagtttc 27
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对58上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 115
tggcagtgat tcaagtaaaa atgatactgt 30
<210> 116
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对58下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 116
ttgagctttc gcaacttcca aaaa 24
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对59上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 117
atggacattc taagttatga ggaaacagac 30
<210> 118
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对59下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 118
tttgcccatt gatggctaaa actg 24
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对60上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 119
agcaaaaagt cctgcaactt gttac 25
<210> 120
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对60下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 120
gaatagctgt tagacatgct actgttact 29
<210> 121
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对61上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 121
cctgcaaaaa taaaaatgca gccattaaa 29
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对61下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 122
tccaatccag acatattttg gttatgttgt 30
<210> 123
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对62上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 123
tgcttcatta caaaacgcaa gacaag 26
<210> 124
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对62下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 124
ggtttctctt atcaacacga ggaagtattt 30
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对63上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 125
gcagagggaa ggctcagata ca 22
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对63下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 126
cttaacttgt ttacagcgat gccaa 25
<210> 127
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对64上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 127
ctctgagaaa gaatgaaatg gagttgga 28
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对64下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 128
agttcctgac acagcagaca tttaataaat 30
<210> 129
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对65上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 129
gcctcgcctc atgtggtttt at 22
<210> 130
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对65下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 130
aaatagttcc aggacacgtg tagaac 26
<210> 131
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对66上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 131
gagatgttgc cagaataaat gaaaatggt 29
<210> 132
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对66下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 132
tgccaaaaga cttctacaga gtgaac 26
<210> 133
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对67上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 133
cccatggaaa cagttcatgt attacttt 28
<210> 134
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对67下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 134
aaaaatgatg aagtgacagt tccagtagt 29
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对68上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 135
gtgcaggcct gcataattct tg 22
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对68下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 136
ctgctacaag ccttattaaa gggct 25
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物对69上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 137
cccatctgtt atgttggctc ctt 23
<210> 138
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对69下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 138
cacctccaag gtgtatgaag tatgtatttt 30
<210> 139
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对70上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 139
cccaagtcgt gtgtttacct atataaca 28
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对70下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 140
gcctttaacc acttctctgt attacatact 30
<210> 141
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对71上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 141
gtagctgtat acgtatggcg tttct 25
<210> 142
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对71下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 142
gaaagaggga tgagggaata cataaaagtt 30
<210> 143
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对72上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 143
ccctttcgtc tatttgtcag acgaa 25
<210> 144
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对72下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 144
gctatttcct tgatactgga ctgtcaaaat 30
<210> 145
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对73上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 145
gaacaggctt cacctaaaaa cgtaaaaa 28
<210> 146
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对73下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 146
agcataccaa gtctactgaa taaacacttt 30
<210> 147
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对74上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 147
tttttctcca tttccatttt cctttcct 28
<210> 148
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对74下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 148
catgacttgc agcttctctt tgatt 25
<210> 149
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对75上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 149
tcttttggaa agtaattcaa tagctgacga 30
<210> 150
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对75下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 150
tcttataaac tggaaaggtt aagcgtcaat 30
<210> 151
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对76上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 151
ccagacacca ccatggacat tc 22
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对76下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 152
aactttgtaa ttcaacattc atcgttgtgt 30
<210> 153
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对77上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 153
aaaatcaaag tgtttgttcc aatacagca 29
<210> 154
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对77下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 154
aagtatgatt tgtcctttca caattggtg 29
<210> 155
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对78上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 155
tgcagtcaag tcttccaatt cact 24
<210> 156
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对78下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 156
ggagagctta gcaggagtcc ta 22
<210> 157
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物对79上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 157
tccaggaaga ctttgtttat agacctca 28
<210> 158
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对79下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 158
ccactttttc ccatcaagtc atttgttaaa 30
<210> 159
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对80上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 159
tctttccttg attttcttcc ttttgttcac 30
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对80下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 160
tagcactcta gggaaggcaa aaac 24
<210> 161
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对81上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 161
gtggaaccaa atgatactga tccattagat 30
<210> 162
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对81下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 162
ccactgtttc ctcatttaat ggcttct 27
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对82上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 163
tcttcatctt ccttcctttt catgtcattt 30
<210> 164
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对82下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 164
agttcttttg gtcatcaatc tctttctcc 29
<210> 165
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对83上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 165
catttgttaa cttcagctct gggaaa 26
<210> 166
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对83下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 166
agcagtataa gcaatatgga actcgaatt 29
<210> 167
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对84上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 167
ccagaatagt atcaccatgt agcaaatga 29
<210> 168
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对84下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 168
ctaacacact gttcaactct gtgaaaatg 29
<210> 169
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物对85上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 169
attttgcatc ggcatgtttg aca 23
<210> 170
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对85下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 170
tatacaacag aatatacgat ggcctccata 30
<210> 171
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对86上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 171
ggtgcatagt cattatcaat ttgtgaatca 30
<210> 172
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对86下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 172
acgggaagtg ttaacttctt aacgtt 26
<210> 173
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对87上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 173
gggatttgct ttgttttatt ttagtcctgt 30
<210> 174
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对87下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 174
tcacttaacg tttactgaat tgcctgt 27
<210> 175
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对88上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 175
gcagatgtcc cataaaactt tcagg 25
<210> 176
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物对88下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 176
ttaaatggct cttaagggca gttgt 25
<210> 177
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物对89上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 177
accatagggc tcataaaatt cacttcc 27
<210> 178
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对89下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 178
ttttccaggc atcatacatg ttagct 26
<210> 179
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对90上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 179
ccactatgcc tggcctgaaa taatac 26
<210> 180
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对90下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 180
cttgccaagg caagatctag gt 22
<210> 181
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对91上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 181
agcctaatct tactagacat gtcttttctt 30
<210> 182
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对91下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 182
gacgttgtca ttagttcttt ggtttgtat 29
<210> 183
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对92上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 183
ggtttatgtt cttgcagagg agaaca 26
<210> 184
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对92下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 184
ctgaggcttg ctcagtttct tttg 24
<210> 185
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物对93上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 185
catttaggtg ctgttttgtt tggaga 26
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对93下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 186
tgggaagtag cagcagaaat catc 24
<210> 187
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物对94上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 187
gtgtgagacc agtgggagta at 22
<210> 188
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对94下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 188
aggttttcta ctgttgctgc atct 24
<210> 189
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对95上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 189
agtctaattt aaggagacaa tgaaccacaa 30
<210> 190
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物对95下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 190
tgtcccaaag caaggaattt aatcatttt 29
<210> 191
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对96上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 191
cagttattca gtgacttgtt taaacagtgg 30
<210> 192
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对96下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 192
aacagcatac cacccatctg taag 24
<210> 193
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物对97上游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 193
tgatgtaggt ctccttttac gctttaattt 30
<210> 194
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物对97下游引物(人类BRCA1/2基因检测引物)
<400> 194
aggttctgat gactcacatg atgg 24
<210> 195
<211> 41
<212> DNA
<213> P1接头上游(P1接头)
<400> 195
ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagtcggtga t 41
<210> 196
<211> 43
<212> DNA
<213> P1接头下游(P1接头)
<400> 196
ttggtgatgc ggaggcgaaa ggagagatac ccgtcagcca cta 43
<210> 197
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头1正序列(特异性接头1)
<400> 197
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ctaaggtaac gat 43
<210> 198
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头1反序列(特异性接头1)
<400> 198
cgcacagagg ctgagtcgat tccattgcta 30
<210> 199
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头2正序列(特异性接头2)
<400> 199
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag taaggagaac gat 43
<210> 200
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头2反序列(特异性接头2)
<400> 200
cgcacagagg ctgagtcatt cctcttgcta 30
<210> 201
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头3正序列(特异性接头3)
<400> 201
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag aagaggattc gat 43
<210> 202
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头3反序列(特异性接头3)
<400> 202
cgcacagagg ctgagtcttc tcctaagcta 30
<210> 203
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头4正序列(特异性接头4)
<400> 203
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag taccaagatc gat 43
<210> 204
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头4反序列(特异性接头4)
<400> 204
cgcacagagg ctgagtcatg gttctagcta 30
<210> 205
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头5正序列(特异性接头5)
<400> 205
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag cagaaggaac gat 43
<210> 206
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头5反序列(特异性接头5)
<400> 206
cgcacagagg ctgagtcgtc ttccttgcta 30
<210> 207
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头6正序列(特异性接头6)
<400> 207
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ctgcaagttc gat 43
<210> 208
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头6反序列(特异性接头6)
<400> 208
cgcacagagg ctgagtcgtt cttcaagcta 30
<210> 209
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头7正序列(特异性接头7)
<400> 209
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ttcgtgattc gat 43
<210> 210
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头7反序列(特异性接头7)
<400> 210
cgcacagagg ctgagtcaag cactaagcta 30
<210> 211
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头8正序列(特异性接头8)
<400> 211
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ttccgataac gat 43
<210> 212
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头8反序列(特异性接头8)
<400> 212
cgcacagagg ctgagtcaag gctattgcta 30
<210> 213
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头9正序列(特异性接头9)
<400> 213
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tgagcggaac gat 43
<210> 214
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头9反序列(特异性接头9)
<400> 214
cgcacagagg ctgagtcact cgccttgcta 30
<210> 215
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头10正序列(特异性接头10)
<400> 215
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ctgaccgaac gat 43
<210> 216
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头10反序列(特异性接头10)
<400> 216
cgcacagagg ctgagtcgac tggcttgcta 30
<210> 217
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头11正序列(特异性接头11)
<400> 217
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tcctcgaatc gat 43
<210> 218
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头11反序列(特异性接头11)
<400> 218
cgcacagagg ctgagtcagg agcttagcta 30
<210> 219
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头12正序列(特异性接头12)
<400> 219
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag taggtggttc gat 43
<210> 220
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头12反序列(特异性接头12)
<400> 220
cgcacagagg ctgagtcatc caccaagcta 30
<210> 221
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头13正序列(特异性接头13)
<400> 221
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tctaacggac gat 43
<210> 222
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头13反序列(特异性接头13)
<400> 222
cgcacagagg ctgagtcaga ttgcctgcta 30
<210> 223
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头14正序列(特异性接头14)
<400> 223
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag ttggagtgtc gat 43
<210> 224
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头14反序列(特异性接头14)
<400> 224
cgcacagagg ctgagtcaac ctcacagcta 30
<210> 225
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头15正序列(特异性接头15)
<400> 225
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tctagaggtc gat 43
<210> 226
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头15反序列(特异性接头15)
<400> 226
cgcacagagg ctgagtcaga tctccagcta 30
<210> 227
<211> 43
<212> DNA
<213> 特异性接头16正序列(特异性接头16)
<400> 227
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag taggtggttc gat 43
<210> 228
<211> 30
<212> DNA
<213> 特异性接头16反序列(特异性接头16)
<400> 228
cgcacagagg ctgagtcaga cctactgcta 30
Claims (10)
1.一种检测BRCA1/2基因突变的引物组，其特征在于，包括三个引物池，引物池1包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～84所示；引物池2包括42对引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.85～168所示；引物池3包括13对引物，上下游引物序列依次如SEQID NO.169～194所示。
2.权利要求1所述引物组在检测BRCA1/2基因突变方面的应用。
3.权利要求1所述引物组在制备BRCA1/2基因突变检测试剂盒方面的应用。
4.权利要求1所述引物组在构建包含BRCA1/2基因及可变剪切区的文库方面的应用。
5.一种BRCA1/2基因突变的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 分别用权利要求1所述三个引物池进行多重PCR扩增BRCA1/2外显子及可变剪切区；
S2. 将三个引物池扩增所得目的片段合在一起，并进行文库构建；
S3. 基于构建的文库，通过半导体测序法获取BRCA1/2基因信息，并通过生物信息分析，获得样本BRCA1/2基因突变情况。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样本DNA提取：对静脉血进行DNA提取得到待测样本DNA；
（2）目的片段扩增：以待测样本DNA为模板，分别利用权利要求1所述三个引物池进行多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；
（3）消化引物序列：将步骤（2）中三个引物池扩增所得目的基因DNA片段合在一起，然后与引物消化液混合反应，得到去除已知扩增引物的平末端目的基因DNA片段；
（4）接头连接：将步骤（3）得到的平末端目的基因DNA片段与连接缓冲液、P1接头、特异性接头1-16、DNA连接酶和无核酸酶水混合后进行连接反应，得到接头DNA片段；
（5）纯化连接产物及文库扩增：用磁珠对步骤（4）得到的接头DNA片段进行纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化后的接头DNA片段；然后加入文库扩增引物及文库扩增反应液对纯化后的接头DNA片段进行PCR扩增，最后用磁珠对扩增的产物进行纯化，去除多余的大片段和小片段，得到文库；
（6）检测文库浓度：将步骤（5）得到的文库稀释到200pmol/L作为测序文库；
（7）模板制备和富集：将步骤（6）得到的测序文库进行乳液PCR扩增，再通过磁珠进行富集纯化，得到上机模板；
（8）上机测序：将步骤（7）得到的上机模板进行上机测序；
（9）数据分析：通过对数据的分析比对，获取BRCA1/2突变信息。
7.一种检测BRCA1/2基因突变的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述检测BRCA1/2基因突变的引物组。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR反应液、DNA连接酶、引物消化液、连接缓冲液、P1接头序列、特异性接头1-16序列、文库扩增反应液、文库扩增引物、磁珠、75%乙醇和/或无核酸酶水。
9.一种包含BRCA1/2基因及可变剪切区的文库，其特征在于，由权利要求6中步骤（1）～（5）或步骤（1）～（6）所述方法制备得到。
10.权利要求9文库在检测BRCA1/2基因突变方面的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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