WO2023024465A1 - 一种rna和dna二代测序文库的构建方法及二代测序盒 - Google Patents

一种rna和dna二代测序文库的构建方法及二代测序盒 Download PDF

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WO2023024465A1
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reaction solution
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dna
rna
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蒋析文
梁志坤
张丽珊
吴轶兰
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广州达安基因股份有限公司
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    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
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    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Definitions

  • the present application relates to the field of biotechnology, in particular to a method for constructing an RNA and DNA next-generation sequencing library and a next-generation sequencing box.
  • the existing routine RNA library construction process is: 1. Obtain about 1-10 ⁇ g of pure, complete and quality-checked total RNA; 2. Purify mRNA from total RNA; usually, this is done by combining all RNA annealing to oligo-dT magnetic beads is done; two rounds of purification can be performed to remove non-specifically bound ribosomes and other RNA from oligo-dT; mRNA is then released or isolated from oligo-dT magnetic beads; 3. Use Fragmentation reagent fragments the purified mRNA and breaks the mRNA chain into multiple small fragments; 4. Use random hexamer primers to detect the fragmented mRNA; 5.
  • RNA virus itself has low content and poor stability, and it is seriously worn out during multiple rounds of experimental operations, and it is very easy to miss detection because it cannot reach the detection limit.
  • one of the problems to be solved in this application is to provide a method for constructing RNA and DNA next-generation sequencing libraries with simple library construction, low initial amount and high practicability.
  • the second problem to be solved in this application is to provide an RNA and DNA next-generation sequencing box.
  • a method for constructing RNA and DNA next-generation sequencing libraries comprising the steps of:
  • the second-strand cDNA is fragmented, end repaired, phosphorylated and A-added to obtain the A-added product;
  • RNA and DNA next-generation sequencing libraries Using the recovered target RNA fragments and DNA fragments as templates to perform a PCR amplification reaction to enrich the target RNA fragments and DNA fragments, construct and obtain the RNA and DNA next-generation sequencing libraries.
  • the present application also provides a second-generation sequencing cassette for RNA and DNA prepared by the above-mentioned library construction method.
  • RNA and DNA next-generation sequencing library construction method provided by this application has the following advantages:
  • the overall library construction process simplifies the process steps, greatly reduces the operation process and experimental time, and can minimize the loss of nucleic acid samples; therefore, the requirements for the total amount and quality of DNA and RNA are low, and it can be applied to low In the detection of initial quantity and poor quality RNA and DNA pathogenic microorganisms, the detection rate is greatly improved.
  • Figure 1 is a process flow diagram for the existing construction of an RNA next-generation sequencing library
  • Fig. 2 is a flow chart of the process for constructing RNA and DNA next-generation sequencing libraries of the present application.
  • RNA and DNA next-generation sequencing library includes the following steps:
  • the second-strand cDNA is fragmented, end repaired, phosphorylated and A-added to obtain the A-added product;
  • RNA and DNA next-generation sequencing libraries Using the recovered target RNA fragments and DNA fragments as templates to perform a PCR amplification reaction to enrich the target RNA fragments and DNA fragments, construct and obtain the RNA and DNA next-generation sequencing libraries.
  • the one-chain synthesis also includes the following steps:
  • the RNA binding product is mixed with the reaction solution A, enzyme B, and enzyme C to obtain the one-strand cDNA; wherein, the reaction solution A contains substances and their final concentrations: Tris-HCl (ph8.3) 300mM, MgCl 2 18mM, KCl 300mM, DTT 60mM, dATP 3mM, dGTP 3mM, dCTP 3mM and dTTP 3mM; Enzyme B is Reverse Transcriptase (M-MMLV enzyme); and Enzyme C is Murine RNase Inhibitor (Rnasin).
  • the mixing reaction conditions are as follows: the reaction temperature is 25°C and the reaction time is 5-15 minutes, or the reaction temperature is 42°C and the reaction time is 10-20 minutes; or the reaction temperature is 70°C and the reaction time is 10-30 minutes.
  • step S2 the two-chain synthesis includes the following steps:
  • reaction solution D includes substances and their final concentrations: Tris-HCL (ph8.3) 100mM, MgCl2 6mM, KCl 300mM, DTT 20mM, NAD+208uM, BSA 400ug/ml, dATP 4mM, dGTP 4mM, dCTP 4mM and dTTP 4mM; and enzyme mixture E including DNA Polymerase I (E.coli), E.coli DNA Ligase and RNase H.
  • Tris-HCL ph8.3 100mM, MgCl2 6mM, KCl 300mM, DTT 20mM, NAD+208uM, BSA 400ug/ml, dATP 4mM, dGTP 4mM, dCTP 4mM and dTTP 4mM
  • enzyme mixture E including DNA Polymerase I (E.coli), E.coli DNA Ligase and RNase H.
  • the reaction temperature is 16° C. and the reaction time is 30-60 min.
  • step S3 the one-step reaction includes the following steps:
  • the two-strand cDNA is reacted with the reaction solution F and the enzyme mixture G to obtain the product of adding A; wherein the reaction solution F includes substances and their final concentrations: Tris-HCL (ph7.5) 200mM, MgCl 100mM, NaCl 500mM, DTT 100mM, Triton X-1001.5%, ATP 5mM, dATP 5mM, dGTP 5mM, dCTP 5mM and dTTP 5mM; and enzyme mixture G is Vvn endonuclease mutant, T7 endonuclease mutant and Taq DNA polymerase mixture.
  • the reaction conditions are: the reaction temperature is 37° C., and the reaction time is 10-30 minutes; or the reaction temperature is 65° C., and the reaction time is 20-30 minutes.
  • step S4 the joint connection includes the following steps:
  • reaction solution H includes substances and their final concentrations: Tris-HCL (ph7.5) 75mM, MgCl 15mM, DTT 15mM, ATP 2.75mM and 20v/v% PEG8000;
  • Reaction solution I is, according to different sequencing platforms, can choose Illumina linker or MGISEQ linker Ad153, and its final concentration is 2uM; and enzyme J is T4DNA ligase ligase.
  • the reaction temperature is 20° C. and the reaction time is 30 minutes.
  • step S4 after the adapter ligation reaction is completed, the adapter product needs to be purified for the first time, and the specific steps are as follows:
  • RNA fragments and DNA fragments, 80 ⁇ L magnetic beads are packed into a centrifuge tube, and the centrifuge tube is inverted or vortexed, so that the RNA fragments and DNA fragments are fully mixed with the magnetic beads;
  • step S5 the PCR amplification reaction includes steps:
  • reaction solution K includes substances and their final concentrations: 5*Q5buffer 80%, dATP 0.8mM, dGTP 0.8mM, dCTP 0.8mM, dTTP 0.8mM and Q5 hot start ultra-fidelity DNA polymerase (4%); and reaction solution L, according to the sequencing platform, you can choose Illumina library amplification primers or MGISEQ library prep primers at a concentration of 15 ⁇ M.
  • reaction temperature and reaction time are as follows:
  • Annealing stage when the reaction temperature is 58°C, the reaction time is 20s;
  • stages respectively need to execute 10-14 cycles; 1) and 5) stages, each executed once.
  • the second purification treatment of the PCR amplification product is also included:
  • the present application also provides a second-generation sequencing cassette for RNA and DNA prepared by the above library construction method, the sequencing cassette is high-throughput sequencing.
  • Table 1 Components of nucleic acid sample configuration in one-strand synthesis
  • reaction solution A Take the reaction solution A, enzyme B, and enzyme C out of the -20°C refrigerator, thaw the reaction solution A at room temperature, mix it upside down and centrifuge for a short time, and then use it for later use. Put it on an ice box for later use; prepare the following reaction system in a PCR tube, as shown in Table 3.
  • the reaction solution A contains substances and their final concentrations: Tris-HCl (ph8.3) 300mM, MgCl 2 18mM, KCl 300mM, DTT 60mM, dATP 3mM, dGTP 3mM, dCTP 3mM and dTTP 3mM; enzyme B is Reverse Transcriptase (M-MMLV enzyme); and enzyme C is Murine RNase Inhibitor (Rnasin).
  • the reaction conditions can be selected as follows: the reaction temperature is 25°C and the reaction time is 10min, or the reaction temperature is 42°C and the reaction time is 15min; or the reaction temperature is 70°C and the reaction time is 15min
  • the reaction solution D includes substances and their final concentrations: Tris-HCL (ph8.3) 100mM, MgCl2 6mM, KCl 300mM, DTT 20mM, NAD+208uM, BSA 400ug/ml, dATP 4mM, dGTP 4mM, dCTP 4mM and dTTP 4mM; and enzyme mixture E including DNA Polymerase I (E.coli), E.coli DNA Ligase and RNase H.
  • Tris-HCL ph8.3 100mM, MgCl2 6mM, KCl 300mM, DTT 20mM, NAD+208uM, BSA 400ug/ml, dATP 4mM, dGTP 4mM, dCTP 4mM and dTTP 4mM
  • enzyme mixture E including DNA Polymerase I (E.coli), E.coli DNA Ligase and RNase H.
  • Second-strand product i.e. second-strand cDNA
  • Reaction solution F 5 Enzyme Mix
  • the reaction solution F includes substances and their final concentrations: Tris-HCL (ph7.5) 200mM, MgCl2 100mM, NaCl 500mM, DTT 100mM, Triton X-100 1.5%, ATP 5mM, dATP 5mM, dGTP 5mM, dCTP 5mM and dTTP 5mM; and enzyme mixture G is a mixture of Vvn endonuclease mutant, T7 endonuclease mutant and Taq DNA polymerase.
  • the fragmentation time depends on the quality of the input nucleic acid and the size of the target insert. As shown in Table 9, select the corresponding fragmentation processing time according to the expected insert size of the DNA. For example, if a 100bp DNA fragment needs to be inserted, the fragmentation time 25-30min.
  • the recommended time in Table 9 is obtained from the test using high-quality Hela cell gDNA as the template.
  • the distribution range of fragmented products is not much different with different input amounts and the same reaction time (the distribution range is basically the same, but the position of the main peak may be slightly different). If the quality of the input DNA is poor or the fragment size is not within the expected range, it is recommended to adjust the fragmentation time up or down by 2-5min.
  • reaction solution H and reaction solution I Take out reaction solution H and reaction solution I from the -20°C refrigerator, thaw at room temperature, mix well and centrifuge briefly for later use; take enzyme J out of the -20°C refrigerator, briefly centrifuge and put it on an ice box for later use.
  • reaction solution H includes substances and their final concentrations: Tris-HCL (ph7.5) 75mM, MgCl2 15mM, DTT 15mM, ATP 2.75mM and 20v/v% PEG8000 20%;
  • Reaction solution I can be Illumina adapter or MGISEQ adapter Ad153 according to different sequencing platforms, and its final concentration is 2uM; enzyme J is T4 DNA ligase ligase.
  • a high-throughput sequencing RNA and DNA next-generation sequencing box is constructed, and the sequencing box includes the RNA and DNA libraries constructed by the above method.

Abstract

提供一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法及二代测序盒，该二代测序文库的构建方法包括步骤：对RNA核酸和DNA核酸进行一链合成，得到一链cDNA；对述一链cDNA进行二链合成，得到二链cDNA；对二链cDNA片段化、末端修复、磷酸化及加A处理后得到加A产物；将加A产物进行接头连接和第一次纯化处理，得到目标RNA片段和DNA片段并回收；对目标RNA片段和DNA片段进行PCR扩增反应，以构建并得到所述RNA和DNA二代测序文库。该方法构建二代测序文库，采用整体建库流程，工艺步骤简化，极大缩减了操作流程和实验时间，可最大程度减少核酸样本的损耗，同时，无需构建两种文库，可大大节约人力、试剂、时间等成本。

Description

一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法及二代测序盒
本申请要求于2021年8月25日提交中国专利局、申请号为202110983590.4，发明名称为“一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法及二代测序盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法及二代测序盒。
背景技术
目前，市场上针对未知病原微生物感染的样本，现有的方案大多采用RNA文库和DNA文库分开构建的方法，费时费力且成本高。
如图1所示，现有常规RNA文库构建流程是：1.获取约1-10μg纯的，完整的经过质量核查的全部RNA；2.从全部RNA中纯化mRNA；通常，这是通过将全部RNA退火到oligo-dT磁珠上来完成的；可以进行两轮纯化，以从oligo-dT中去除非特异性结合的核糖体和其他RNA；然后从oligo-dT磁珠释放或分离mRNA；3.使用fragmentation reagent对纯化mRNA进行片段化处理，将mRNA链断裂成多个小片段；4.用随机六聚体引物对片段化的mRNA进行检测；5.用逆转录酶逆转录片段化的mRNA，从而产生cDNA；6.合成cDNA的第二/互补链并除去mRNA；产物是双链cDNA(ds cDNA)；7.通过将DNA与固相可逆固定(SPRI)珠结合来从游离的核苷酸，酶，缓冲液和RNA中纯化双链cDNA；8.在纯化的洗脱双链cDNA上进行末端修复；9.纯化末端修复的双链cDNA；10.洗脱末端修复的双链cDNA的腺苷酸3'末端；11.将衔接子连接到末端修复的双链cDNA；12.将衔接子连接的末端修复的双链cDNA纯化；13.通过聚合酶链式反应(PCR)扩增富集文库；使用来自衔接子的序列作为引物，使用少量循环(12-16)来扩增已经存在的序列；14.纯化PCR富集的且衔接子连接的末端修复的双链cDNA。
以上可知，14个步骤六步纯化。可见，现有RNA建库步骤繁琐，RNA的总量和质量要求高，在多次磁珠纯化上耗时长，二链合成产物产物、末端修复产物接头连接产物需要纯化，末端修复和加A步骤无法一体化，这些流程不仅操作成本高，耗时长，而且多步纯化会不可避免地增加RNA样本的损耗。而RNA病毒本身含量低且稳定性较差，在多轮实验操作过程中损耗严重，极易因达不到检出限而出现漏检。
因此，针对现有技术，开发一种简化的建库方法，特别是适用于较低起始量及较差质量的RNA和DNA共同建库方法，将非常有实用价值。
发明内容
基于上述问题，本申请所要解决的问题之一在于提供一种建库简单、起始量低且实用性高的RNA和DNA二代测序文库的构建方法。
本申请所要解决的问题之二在于提供一种RNA和DNA二代测序盒。
本申请的技术方案一如下：
一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法，包括如下步骤：
S1、对RNA核酸和DNA核酸进行一链合成，得到一链cDNA；
S2、对所述一链cDNA进行二链合成，得到二链cDNA；
S3、通过一步反应，实现对所述二链cDNA片段化、末端修复、磷酸化及加A处理后得到加A产物；
S4、将所述加A产物进行接头连接和第一次纯化处理，得到目标RNA片段和DNA片段并回收；
S5、以回收的所述目标RNA片段和DNA片段作为模板进行PCR扩增反应，以富集所述目标RNA片段和DNA片段，构建并得到所述RNA和DNA二代测序文库。
本申请还提供一种采用上述建库方法制得的RNA和DNA二代测序盒。
相对于现有技术而言，本申请提供的RNA和DNA二代测序文库构建方法， 具有如下有点：
(1)RNA和DNA共建库，无需构建两种文库，可大大节约人力、试剂、时间等成本。
(2)整体建库流程，工艺步骤简化，极大缩减了操作流程和实验时间，可最大程度减少核酸样本的损耗；因此对DNA和RNA的总量和质量要求较低，可应用于较低起始量及较差质量的RNA和DNA病原微生物检测中，大大提高了检出率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请中的方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为现有构建RNA二代测序文库的工艺流程图；
图2为本申请构建RNA和DNA二代测序文库的工艺流程图。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请；本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实 施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
下面结合附图，对本申请的较佳实施例作进一步详细说明。
本申请提供的一种RNA和DNA二代测序文库的构建工艺流程，如图2所示，包括如下步骤：
S1、将RNA核酸和DNA核酸进行一链合成，得到一链cDNA；
S2、将一链cDNA进行二链合成，得到二链cDNA；
S3、通过一步反应，实现对二链cDNA片段化、末端修复、磷酸化及加A处理后得到加A产物；
S4、将所述加A产物进行接头连接和第一次纯化处理，得到目标RNA片段和DNA片段并回收；
S5、以回收的所述目标RNA片段和DNA片段作为模板进行PCR扩增反应，以富集所述目标RNA片段和DNA片段，构建并得到所述RNA和DNA二代测序文库。
上述构建工艺流程中，进一步地，上述步骤S1中，一链合成还包括如下步骤：
S11、将RNA与随机引物Random Primers(100uM)先于65℃结合处理5min；
S12、所述RNA结合产物与反应液A、酶B、酶C进行混合反应，得到所述一链cDNA；其中，反应液A包含物质及其终浓度：Tris-HCl(ph8.3)300mM、MgCl 2 18mM、KCl 300mM、DTT 60mM、dATP 3mM、dGTP 3mM、dCTP 3mM及dTTP 3mM；酶B为Reverse Transcriptase(M-MMLV酶)；及酶C为Murine RNase Inhibitor(Rnasin)。
优选步骤S12中，混合反应条件为：反应温度为25℃、反应时间5-15min，或者反应温度为42℃、反应时间为10-20min；或者反应温度为70℃、反应时间为10-30min。
上述构建工艺流程中，又进一步地，步骤S2中，所述二链合成包括如下步 骤：
将一链cDNA与反应液D和酶混合液E进行混合反应，得到二链cDNA；其中，反应液D包括物质及其终浓度：Tris-HCL(ph8.3)100mM、MgCl2 6mM、KCl 300mM、DTT 20mM、NAD+208uM、BSA 400ug/ml、dATP 4mM、dGTP 4mM、dCTP 4mM及dTTP 4mM；及酶混合液E包括DNA Polymerase I(E.coli)、E.coli DNA Ligase及RNase H。
优选二链合成的混合反应中，反应温度为16℃、反应时间为30-60min。
上述构建工艺流程中，再进一步地，步骤S3中，所述一步反应包括如下步骤：
将二链cDNA与反应液F和酶混合液G进行反应，，得到所述加A产物；其中，反应液F包括物质及其终浓度：Tris-HCL(ph7.5)200mM、MgCl2 100mM、NaCl 500mM、DTT 100mM、Triton X-1001.5％、ATP 5mM、dATP 5mM、dGTP 5mM、dCTP 5mM及dTTP 5mM中；及酶混合液G为Vvn endonuclease mutan、T7 endonuclease mutant和Taq DNA polymerase混合液。
较好地，所述一步反应中，其反应条件为：反应温度为37℃、反应时间为10-30min；或者反应温度为65℃、反应时间为20-30min。
更进一步地，步骤S4中，所述接头连接包括如下步骤：
将加A产物与反应液H、反应液I和酶J进行反应，得到RNA片段和DNA片段；其中，所述反应液H包括物质及其终浓度：Tris-HCL(ph7.5)75mM、MgCl2 15mM、DTT 15mM、ATP 2.75mM及20v/v％PEG8000；
反应液I为，根据不同测序平台，可以选择为Illumina接头或MGISEQ接头Ad153，其终浓度为2uM；及酶J为T4DNA ligase连接酶。
较好地，接头连接反应中，反应温度为20℃、反应时间为30min。
较好地，步骤S4中，接头连接反应结束后，还需对接头产物进行第一次纯化处理，具体步骤如下：
S41、将所述RNA片段和DNA片段、80μL磁珠装入离心管中，并颠倒或旋 涡振荡离心管，使RNA片段和DNA片段与磁珠充分混匀；
S42、采用EP吸管反复吹打RNA片段和DNA片段，使其与磁珠充分混匀混匀，将离心管置于磁力架上室温静置；
S43、待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；
S44、往离心管中加入200μL新鲜配制的80v/v％乙醇漂洗磁珠；
S45、重复步骤S42至S44；
S46、将离心管离心处理后，再把离心管置于磁力架上，彻底去除离心管中的上清液；
S47、将离心管中的样品取出来，加入22μL去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，得到所述目标RNA片段和DNA片段。
上述构建工艺流程中，再更进一步地，步骤S5中，所述PCR扩增反应包括步骤：
将第一次纯化后得到的目标RNA片段和DNA片段与反应液K、反应液L进行反应，得到RNA和DNA的二代测序文库；其中，反应液K包括物质及其终浓度：5*Q5buffer 80％、dATP 0.8mM、dGTP 0.8mM、dCTP 0.8mM、dTTP 0.8mM及Q5热启动超保真DNA聚合酶(4％)；及反应液L，根据测序平台，可以选择Illumina文库扩增引物或MGISEQ文库制备引物，浓度为15μM。
较好地，PCR扩增反应中，根据反应阶段，其反应温度和反应时间如下:
1)预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
2)变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为20s；
3)退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；
4)延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s；
5)终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；
6)保存阶段：反应温度为4℃；
其中；第2)至4)阶段，分别需要执行10-14个循环；第1)和第5)阶 段，各执行1次。
优选地，所述PCR扩增反应结束后，还包括对PCR扩增产物进行的第二次纯化处理：
S51、将所述PCR扩增产物、85μL磁珠装入离心管中，并颠倒或旋涡振荡离心管，使PCR扩增产物与磁珠充分混匀；
S52、采用EP吸管反复吹打PCR扩增产物，使其与磁珠充分混匀混匀，将离心管置于磁力架上室温静置；
S53、待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；
S54、往离心管中加入200μL新鲜配制的80v/v％乙醇漂洗磁珠；
S55、重复步骤S52至S54；
S56、将离心管离心处理后，再把离心管置于磁力架上，彻底去除离心管中的上清液；
S57、将离心管中的样品取出来，加入22μL去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，得到所述RNA和DNA二代测序文库。
本申请还提供一种采用上述建库方法制得的RNA和DNA二代测序盒，该测序盒为高通量测序。
下面采用具体实施例详细说明RNA和DNA二代测序文库构建流程。
1、一链合成
1.1、将Random Primers(100uM)从-20℃冰箱取出，室温解冻，在PCR管中配制以下体系，如表1所示。
表1一链合成中核酸样本配置组分
组分 体积(uL)
核酸样本(即RNA和DNA核酸样本) 19
Random Primers 1
共计 20
反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
1.2、将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表2。
表2一链合成中核酸样本配置条件
温度 时间
热盖 75℃
65℃ 5min
4℃ Hold
1.3、将反应液A、酶B、酶C从-20℃冰箱取出，反应液A室温解冻，颠倒混匀短暂离心后备用，酶B、酶C冰上解冻呈液态，颠倒混匀短暂离心后放冰盒上备用；在PCR管中配制以下反应体系，如表3所示。
表3一链合成反应体系组分
组分 体积(uL)
产物 20
反应液A 5
酶B 3
酶C 0.5
无核酸酶水 1.5
共计 30
其中，反应液A包含物质及其终浓度：Tris-HCl(ph8.3)300mM、MgCl 2 18mM、KCl 300mM、DTT 60mM、dATP 3mM、dGTP 3mM、dCTP 3mM及dTTP 3mM中；酶B为Reverse Transcriptase(M-MMLV酶)；及酶C为Murine RNase Inhibitor(Rnasin)。
1.4、反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
1.5、将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表4所示。
表4一链合成反应条件
温度 时间
热盖 10℃
25℃ 10min
42℃ 15min
70℃ 15min
4℃ Hold
上述表4中，反应条件可以选择为：反应温度为25℃、反应时间10min，或者反应温度为42℃、反应时间为15min；或者反应温度为70℃、反应时间为15min
2、二链合成
2.1、将反应液D和酶混合液E从-20℃冰箱取出，反应液D室温解冻，颠倒混匀短暂离心后备用，酶混合液E冰上解冻呈液态，颠倒混匀短暂离心后放冰盒上备用；在PCR管中配制以下反应体系，如表5所示。
表5二链合成反应体系组分
组分 体积(uL)
一链产物(即一链cDNA) 30
反应液D 5
酶混合液E 5
共计体积数 40
其中，反应液D包括物质及其终浓度：Tris-HCL(ph8.3)100mM、MgCl2 6mM、KCl 300mM、DTT 20mM、NAD+208uM、BSA 400ug/ml、dATP 4mM、dGTP 4mM、dCTP 4mM及dTTP 4mM；及酶混合液E包括DNA Polymerase I(E.coli)、E.coli DNA Ligase及RNase H。
2.2、反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
2.3、将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表6所示。
表6二链合成反应条件
温度 时间
热盖 Off
16℃ 30min
4℃ Hold≤1h
3、片段化、末端修复、磷酸化及加A
3.1、将反应液F、酶混合液G从-20℃冰箱取出，反应液F室温解冻，颠倒混匀短暂离心后备用，酶混合液G冰上解冻，颠倒混匀短暂离心后放冰盒上备用；在PCR管中配制以下反应体系，如表7所示。
表7一步反应体系组分
组份 体积(μl)
二链产物(即二链cDNA) 40
反应液F 5
酶混合液G 5
Total 50
其中，反应液F包括物质及其终浓度：Tris-HCL(ph7.5)200mM、MgCl2 100mM、NaCl 500mM、DTT 100mM、Triton X-100 1.5％、ATP 5mM、dATP 5mM、dGTP 5mM、dCTP 5mM及dTTP 5mM；及酶混合液G为Vvn endonuclease mutan、T7 endonuclease mutant和Taq DNA polymerase混合液。
3.2、反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
3.3、将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表8所示。
表8一步反应条件
Figure PCTCN2022077618-appb-000001
片段化时间需按投入的核酸质量及目标插入片段大小而定，如表9所示，根据DNA预期插入片段大小选择相应的片段化处理时间，如，需要插入100bp的DNA片段，则片段化时间为25-30min。
表9一步反应体系中DNA片段化反应条件
预期插入片段大小 片段化时间
100bp 25-30min
150bp 15-25min
200-700bp 10-15min
注：表9上的推荐时间，为使用高质量的Hela细胞gDNA为模板测试所得。当使用高质量Hela细胞gDNA进行建库时，不同投入量相同反应时间，片段化产物分布范围差异不大(分布范围基本一致，但主峰位置可能会略有差异)。如Input DNA质量不佳或片段化大小不在预期范围，建议以2-5min的幅度上下调整片段化时间。
3.4接头连接
4.1将反应液H、反应液I从-20℃冰箱取出，室温解冻，混匀短暂离心后备用；将酶J从-20℃冰箱取出，短暂离心后放冰盒上备用。
4.2在片段化、末端修复、加A后的产物中依次添加以下各组分，如表10。
表10 DNA片段接头反应组分
组份 体积(μL)
上一步产物(即加A产物) 50
反应液H 20
反应液I 5
酶J 5
Total 80
其中，所述反应液H包括物质及其终浓度：Tris-HCL(ph7.5)75mM、MgCl2 15mM、DTT 15mM、ATP 2.75mM及20v/v％PEG8000 20％；
反应液I，根据不同测序平台，可以选择为Illumina接头或MGISEQ接头Ad153，其终浓度为2uM；酶J为T4 DNA ligase连接酶。
4.3反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
4.4将PCR管置于PCR仪中，设置如下反应程序，如表11所示。
表11 DNA片段接头反应条件
Figure PCTCN2022077618-appb-000002
5连接产物的第一次纯化
5.1将DNA纯化磁珠提前30min从2-8℃冰箱取出，静置，使其温度平衡至室温；
5.2颠倒或旋涡振荡使DNA纯化磁珠充分混匀，将80μL磁珠分装至1.5mL低吸附离心管中；
5.3将上步80μL连接产物加到磁珠中反复吹打混匀(混匀时吸头不要离开液面，防止产生过多气泡)；
5.4室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；
5.5将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
5.6保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
5.7重复步骤3.5.6一次，总计漂洗二次。
5.8将样品瞬时离心5s，把样品置于磁力架上，用10μL的移液器把残留的上清彻底去干净，保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5-10min至磁珠表面无反光。
5.9将样品从磁力架上取出，加入22μL去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(≈5min)，小心吸取20μL上清至下步反应的PCR管中。
3.6文库扩增
6.1将从-20℃冰箱取出反应液K、反应液L，反应液K放于冰上解冻20min， 反应液L室温解冻20min，混匀短离备用，在上步纯化后的连接产物中依次添加以下各组分，如表12。
表12 RNA片段和DNA片段文库PCR扩增组分
组份 体积(μL)
连接产物 20
反应液K 25
反应液L 5
Total 50
6.2反应组份在PCR管中轻微涡旋混匀，然后离心机中短暂离心3s；
6.3按如下程序在热循环仪中运行扩增，如表13。
表13 RNA片段和DNA片段文库PCR扩增反应条件
Figure PCTCN2022077618-appb-000003
注：建库的核酸投入量在10ng以下，X＝14；核酸投入量在10-30ng，X＝12；核酸投入量在30-50ng，X＝10。
7扩增产物片段第二次纯化
7.1将DNA纯化磁珠提前30min从2-8℃冰箱取出，静置，使其温度平衡至室温；
7.2颠倒或涡旋振荡使DNA纯化磁珠充分混匀，将85μL DNA纯化磁珠分装至1.5mL低吸附离心管中；
7.3将上步50μL PCR产物补水至100μL并加到磁珠中反复吹打混匀(混匀时吸头不要离开液面，防止产生过多气泡)；
7.4室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；
7.5将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，取上清至含40μL DNA纯化磁珠的低吸附离心管中；
7.6室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；
7.7将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
7.8保持样品始终处于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；
7.9重复步骤3.7.8一次，总计漂洗二次；
7.10将样品瞬时离心5s，把样品置于磁力架上，用10μL的移液器把残留的上清彻底去干净，保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5-10min至磁珠表面无反光；
7.11将样品从磁力架上取出，加入22μL去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(≈5min)，小心吸取20μL上清至一个新的1.5mL EP管中。
另一实施例中，构建一高通量测序的RNA和DNA二代测序盒，该测序盒包含上述方法构建获得的RNA和DNA文库。
显然，以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，附图中给出了本申请的较佳实施例，但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现，相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来而言，其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本申请专利保护范围之内。

Claims (20)

  1. 一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法，包括如下步骤：
    S1、对RNA核酸和DNA核酸进行一链合成，得到一链cDNA；
    S2、对所述一链cDNA进行二链合成，得到二链cDNA；
    S3、通过一步反应，实现对所述二链cDNA片段化、末端修复、磷酸化及加A处理后得到加A产物；
    S4、将所述加A产物进行接头连接和第一次纯化处理，得到目标RNA片段和DNA片段并回收；
    S5、以回收的所述目标RNA片段和DNA片段作为模板进行PCR扩增反应，以富集所述目标RNA片段和DNA片段，构建并得到所述RNA和DNA二代测序文库。
  2. 根据权利要求1所述的构建方法，其中，步骤S1中，一链合成还包括如下步骤：
    S11、将RNA与Random Primers于65℃进行结合处理5min，得到RNA结合产物；
    S12、将所述RNA结合产物与反应液A、酶B和酶C进行混合反应，得到所述一链cDNA；其中，反应液A包括Tris-HCl、MgCl 2、KCl、DTT、dATP、dGTP、dCTP及dTTP；所述酶B为M-MMLV酶；所述酶C为Rnasin酶。
  3. 根据权利要求2所述的构建方法，其中，步骤S12中，所述混合反应中，混合反应条件为：反应温度为25℃、反应时间5-15min，或者反应温度为42℃、反应时间为10-20min；或者反应温度为70℃、反应时间为10-30min。
  4. 根据权利要求1所述的构建方法，其中，步骤S2中，所述二链合成包括：
    将所述一链cDNA与反应物D、酶混合液E进行二链合成反应，得到所述二链cDNA；其中，反应液D包括Tris-HCl、MgCl 2、KCl、DTT、NAD+、BSA、dATP、dGTP、dCTP及dTTP；所述酶混合液E包括DNA Polymerase I、 E.coli DNA Ligase及RNase H。
  5. 根据权利要求4所述的构建方法，其中，所述二链合成反应中，反应温度为16℃、反应时间为30-60min。
  6. 根据权利要求1所述的构建方法，其中，步骤S3中，所述一步反应包括如下步骤：
    将所述二链cDNA与反应液F和酶混合液G进行混合反应，得到所述加A产物；其中，所述反应液F包括Tris-HCl、MgCl 2、NaCl、DTT、Triton X-100、ATP、dATP、dGTP、dCTP及dTTP；所述酶混合液G为Vvn endonuclease mutan、T7 endonuclease mutant和Taq DNA polymerase的混合液。
  7. 根据权利要求6所述的构建方法，其中，所述混合反应中，反应条件为：反应温度为37℃、反应时间为10-30min；或者反应温度为65℃、反应时间为20-30min。
  8. 根据权利要求1所述的构建方法，其中，步骤S4中，所述接头连接包括如下步骤：
    将所述加A产物与反应液H、反应液I和酶J进行混合反应，得到RNA片段和DNA片段；其中，所述反应液H包括Tris-HCl、MgCl 2、DTT、ATP及PEG8000中；所述反应液I为接头X为Illumina接头或MGISEQ接头Ad153；所述酶J为T4 DNA ligase连接酶。
  9. 根据权利要求8所述的构建方法，其中，所述混合反应中，反应温度为20℃、反应时间为30min。
  10. 根据权利要求8所述的构建方法，其中，步骤S4中，所述第一次纯化处理包括如下步骤：
    S41、将所述RNA片段和DNA片段、80μL磁珠装入离心管中，并颠倒或旋涡振荡离心管，使RNA片段和DNA片段与磁珠充分混匀；
    S42、采用EP吸管反复吹打RNA片段和DNA片段，使其与磁珠充分混匀混匀，将离心管置于磁力架上室温静置；
    S43、待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；
    S44、往离心管中加入200μL新鲜配制的80v/v％乙醇漂洗磁珠；
    S45、重复步骤S42至S44；
    S46、将离心管离心处理后，再把离心管置于磁力架上，彻底去除离心管中的上清液；
    S47、将离心管中的样品取出来，加入22μL去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，得到所述目标RNA片段和DNA片段。
  11. 根据权利要求1所述的构建方法，其中，步骤S5中，所述PCR扩增反应包括步骤：
    将所述目标RNA片段和DNA片段与反应液K和反应液L进行混合反应，得到RNA和DNA的二代测序文库；其中，所述反应液K包括5*Q5 buffer、dATP、dGTP、dCTP、dTTP及Q5热启动超保真DNA聚合酶；所述反应液L为Illumina文库扩增引物或MGISEQ文库制备引物。
  12. 根据权利要求11所述的构建方法，其中，所述PCR扩增反应中，根据反应阶段，其反应温度和反应时间如下:
    1)预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；
    2)变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为20s；
    3)退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；
    4)延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s；
    5)终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；
    6)保存阶段：反应温度为4℃；
    其中；第2)至4)阶段，分别需要执行10-14个循环；第1)和第5)阶段，各执行1次。
  13. 根据权利要求11所述的构建方法，其中，所述PCR扩增反应结束后，还包括对PCR扩增产物进行的第二次纯化处理：
    S51、将所述PCR扩增产物、85μL磁珠装入离心管中，并颠倒或旋涡振荡离心管，使PCR扩增产物与磁珠充分混匀；
    S52、采用EP吸管反复吹打PCR扩增产物，使其与磁珠充分混匀混匀，将离心管置于磁力架上室温静置；
    S53、待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；
    S54、往离心管中加入200μL新鲜配制的80v/v％乙醇漂洗磁珠；
    S55、重复步骤S52至S54；
    S56、将离心管离心处理后，再把离心管置于磁力架上，彻底去除离心管中的上清液；
    S57、将离心管中的样品取出来，加入22μL去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，得到所述RNA和DNA二代测序文库。
  14. 根据权利要求2所述的构建方法，其中，所述反应液A中的Tris-HCl终浓度为300mM，所述反应液A中的MgCl 2终浓度为18mM，所述反应液A中的KCl终浓度为300mM，所述反应液A中的DTT终浓度为60mM，所述反应液A中的dATP终浓度为3Mm，所述反应液A中的dGTP终浓度为3mM，所述反应液A中的dCTP终浓度为3mM，所述反应液A中的dTTP终浓度为3mM。
  15. 根据权利要求4所述的构建方法，其中，所述反应液D中的Tris-HCl终浓度为100mM，所述反应液D中的MgCl 2终浓度为6mM，所述反应液D中的KCl终浓度为300mM，所述反应液D中的DTT终浓度为20mM，所述反应液D中的NAD+终浓度为208μM，所述反应液D中的BSA终浓度为400ug/ml，所述反应液D中的dATP终浓度为4mM，所述反应液D中的dGTP终浓度为4mM，所述反应液D中的dCTP终浓度为4mM，所述反应液D中的dTTP终浓度为4mM。
  16. 根据权利要求6所述的构建方法，其中，所述反应液F中的Tris-HCl终浓度为200mM，所述反应液F中的MgCl 2终浓度为100mM，所述反应液F 中的NaCl终浓度为500mM，所述反应液F中的DTT终浓度为100mM，所述反应液F中的ATP终浓度为5mM，所述反应液F中的dATP终浓度为5mM，所述反应液F中的dGTP终浓度为5mM，所述反应液F中的dCTP终浓度为5mM，所述反应液F中的dTTP终浓度为5mM。
  17. 根据权利要求7所述的构建方法，其中，在所述反应温度为37℃时，所述反应时间根据二链cDNA预期插入片段大小选择相应的反应时间，其中，所述二链cDNA预期插入片段大小为100bp，所述反应时间为25-30min；所述二链cDNA预期插入片段大小为150bp，所述反应时间为15-25min；所述二链cDNA预期插入片段大小为200-700bp，所述反应时间为10-15min。
  18. 根据权利要求8所述的构建方法，其中，所述Illumina接头或MGISEQ接头Ad153的终浓度为2μM。
  19. 根据权利要求8所述的构建方法，其中，所述反应液H中的Tris-HCl终浓度为75mM，所述反应液H中的MgCl 2终浓度为15mM，所述反应液H中的DTT终浓度为15mM，所述反应液H中的ATP终浓度为2.75mM。
  20. 一种采用权利要求1至19任一所述构建方法制得的RNA和DNA二代测序盒。
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