CN112011835A - 一种病原微生物检测用测序文库的构建方法 - Google Patents

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CN112011835A CN202011138869.4A CN202011138869A CN112011835A CN 112011835 A CN112011835 A CN 112011835A CN 202011138869 A CN202011138869 A CN 202011138869A CN 112011835 A CN112011835 A CN 112011835A
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Abstract

本发明公开了一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，包括S1，从样本中提取得到DNA和RNA，对RNA进行逆转录；S2，往步骤S1中加入二链合成反应液和二链合成酶，使RNA/cDNA复合双链形成双链cDNA；S3，纯化；S4，在S3得到的纯化产物中加入DNA打断修复反应液和DNA打断修复酶混合物，对产物同时进行片段化、末端修复和加A尾；S5，不纯化，向上述片段化的溶液中直接加入接头、接头反应液和连接酶进行接头连接，得接头连接产物；S6，纯化；S7，文库扩增；S8，纯化S7中的扩增产物得到原始DNA/RNA可测序的文库。本发明耗时短；对RNA一链合成和二链合成时，只对RNA起作用，不干扰体系中存在的DNA，待RNA转成双链cDNA后与双链DNA一起片段化，真正做到了一个流程实现共建库的效果。

Description

一种病原微生物检测用测序文库的构建方法
技术领域
本发明属于高通量测序技术领域，具体涉及一种病原微生物检测用测序文库的构建方法。
背景技术
感染性疾病多为细菌、病毒和真菌等病原微生物及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原微生物呈现多样化和复杂化的发展趋势。重症急性呼吸综合征(SARS)、新型冠状病毒肺炎(NCP)、新变异型克雅病、H7N9 禽流感等新发感染性疾病不断出现。而HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原微生物又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类健康带来了巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。
快速、准确的诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，已成为一些重要的感染性疾病的诊断和疗效评价中不可缺少的重要工具。目前常用的病原微生物分子检测方法主要包括：基于PCR的电泳法、实时荧光定量PCR（QPCR）、数字PCR、基因芯片技术、测序技术（Sanger测序技术、焦磷酸测序技术、高通量测序技术）等。
在感染性疾病领域中，获得病原微生物的活体（对于细菌、真菌、病毒而言，主要是培养阳性），是感染性疾病诊断的金标准，但病原微生物的体外培养耗时普遍较长，操作步骤繁琐，且绝大多数病原微生物不可培养；免疫学方法（如补体结合试验、中和试验、酶联免疫吸附实验、免疫荧光法和酶标斑点免疫法等）操作简单，但由于病原微生物种类繁多，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足市场需求；PCR检测具有极高的灵敏度和特异性，但无法完成高通量筛查，检出率较低；基因芯片技术只能对已知的病原微生物基因组进行意向性筛查，而无法检测新的未知病原微生物。据统计，约70%的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原微生物信息，不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。因此，快速、特异且高通量的病原微生物检测方法，对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义。
近年来快速发展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物领域展现了广阔的前景。
对于病原微生物的检测，目前NGS的建库流程为：1.DNA打断（物理法或者酶法）；2.RNA打断；3.RNA逆转录一链合成；4.cDNA二链合成；5.二链cDNA纯化；6.打断的DNA与二链cDNA混合；7.DNA与cDNA末端修复；8.3’末端加尾；9.纯化；10.接头连接；11.纯化；12.PCR文库扩增；13.文库纯化。整个流程（如图1）需要8个小时左右的时间。病原微生物造成的感染往往发病很快，且病原微生物在体内生长繁殖很快，因此需要更快的检测方法，而该方法流程较长，步骤较多，操作时间过长，无法满足医护人员和患者对报告时效性的要求。现有流程对样本起始量也高，一般要求大于100ng。由于感染样本往往来源于胸腹水、肺泡灌洗液、脑脊液和血液等复杂样本，提取得到的核酸质量不高，微生物含量低，往往达不到建库要求。而且，DNA和RNA分开两个流程操作，流程多，纯化也多，造成样本大量损失。
在专利CN202010111731.9中使用的是Tn5转座酶法对DNA/RNA共建库方案，Tn5方法针对不同测序平台需要重新制备转座酶复合体，需要重新测试条件，且对起始量有特定要求，且Tn5转座酶法存在很大的偏好性，打断效率也低，尤其是对cDNA的打断效率很低，这些经常受到业界的诟病，据统计Tn5在插入位点两侧9个碱基左右有明显的偏好性。
所以，针对上述存在的问题，现在急需一种针对病原微生物，能同时检测DNA和RNA的快速的建库方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，按照先后顺序包括以下步骤：
S1，从样本中提取得到DNA和RNA，共投入到一链合成反应液和一链合成酶中，对RNA进行逆转录，使RNA形成RNA/cDNA复合双链，在RNA逆转录的条件为温度不超过65℃，其时间不超过15min；
S2，往步骤S1中加入二链合成反应液和二链合成酶，使RNA/cDNA复合双链形成双链cDNA；
S3，纯化上述步骤中的双链cDNA和双链DNA的混合物；
S4，在S3得到的纯化产物中加入DNA打断修复反应液和DNA打断修复酶混合物，对产物同时进行片段化、末端修复和加A尾；
S5，不纯化，向上述片段化的溶液中直接加入接头、接头反应液和连接酶进行接头连接，得接头连接产物；
S6，接着纯化接头连接产物；
S7，文库扩增：步骤S6所得产物中加入扩增酶混合液和引物，进行PCR扩增；
S8，纯化S7中的扩增产物即可以得到原始DNA/RNA可测序的文库。
优选的是，所述步骤S1中的所述样本为鼻咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血清、血浆、血液、尿液或粪便。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S1中的所述一链合成反应液包括：Tris-HCl20-70mM、KCl 50-100mM、MgCl2 1-10mM、DTT 5-20mM、dNTP 20-100μM、RNase Inhibitor 1-10U、Random Primer 0.5-5μM。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S1中的所述一链合成酶为具有逆转录活性的酶。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S2中的所述二链合成反应液包括：Tris-HCl30-100mM、KCl 50-100mM、MgCl2 1-10mM、DTT 5-20mM、dNTP 20-100μM、dATP 20-100μM。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S2中的所述二链合成酶包括：Klenow片段0.01-0.05 U/μL、RNase H 0.01-0.1U/μL。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S3中所述双链cDNA和双链DNA的混合物为0.1-100ng。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S4中所述DNA打断修复反应液包括：Tris-HCl10-50mM、MgCl2 10-50mM、DTT 1-10mM、dNTP 20-100μM、dATP 0.2-1mM、NaCl 20-80mM、BSA0.1-1 mg/ml、TritonX-100 0.1%-0.5%。
本发明的技术效果和优点：（1）本发明方法使用一个流程，实现对DNA/RNA同时建库，整个过程从原先需要13个步骤、耗时8小时的双流程建库缩短至只需要9个步骤、耗时5小时左右的单流程建库，节省了大量的操作时间和样本；
（2）本发明方法在对RNA一链合成和二链合成时，只对RNA起作用，不干扰体系中存在的DNA，一直保持DNA存在的双链结构，待RNA转成双链cDNA后与双链DNA一起片段化，真正做到了一个流程实现共建库的效果；
（3）本发明方法在对核酸进行片段化时，使用具有序列非特异性的核酸酶，而非使用具有很大偏好性的Tn5转座酶，保留了文库的高复杂度，本发明所用片段化酶针对不同测序平台无需更换酶和测试条件，且能适用广范围进入量的样本。
附图说明
图1为现有的病原微生物的建库流程；
图2为本发明的病原微生物的共建库流程；
图3为本发明的试验例1构建的文库片段分布图；
图4为本发明的试验例2构建的文库片段分布图；
图5为本发明的试验例3中Tn5转座酶法的建库流程；
图6为本发明的试验例3中Tn5转座酶法的文库片段分布图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例一：
一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，按照先后顺序包括以下步骤：
S1，从样本中提取得到DNA和RNA，共投入到一链合成反应液和一链合成酶中，对RNA进行逆转录，使RNA形成RNA/cDNA复合双链，在RNA逆转录的条件为温度不超过65℃，其时间不超过15min，RNA可以是总RNA，也可以是mRNA抓取后或者rRNA去除后的RNA，其抓取和去除方法可以为领域内的常规方法，且DNA和RNA可以是共提取的，其方法可以为领域内的常规方法，例如磁珠法或者柱提法；也可以是分开提取，然后共投入；
S2，往步骤S1中加入二链合成反应液和二链合成酶，使RNA/cDNA复合双链形成双链cDNA；
S3，纯化上述步骤中的双链cDNA和双链DNA的混合物；
S4，在S3得到的纯化产物中加入DNA打断修复反应液和DNA打断修复酶混合物，对产物同时进行片段化、末端修复和加A尾，DNA打断修复酶混合物包括DNA片段化酶和末端修复加尾酶，DNA片段化酶是非特异性DNA片段化酶和T7 Endonuclease I，非特异性DNA片段化酶为Vvn核酸酶；
S5，不纯化，向上述片段化的溶液中直接加入接头、接头反应液和连接酶进行接头连接，得接头连接产物；
S6，接着纯化接头连接产物；
S7，文库扩增：步骤S6所得产物中加入扩增酶混合液和引物，进行PCR扩增；
S8，纯化S7中的扩增产物即可以得到原始DNA/RNA可测序的文库。
优选的是，步骤S1中的样本为鼻咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血清、血浆、血液、尿液或粪便。
具体的，步骤S1中的一链合成反应液包括：Tris-HCl 20mM、KCl 50mM、MgCl2 1mM、DTT 5mM、dNTP 20μM、RNase Inhibitor 1U、Random Primer 0.5μM。
具体的，步骤S1中的一链合成酶为具有逆转录活性的酶。
具体的，步骤S2中的二链合成反应液包括：Tris-HCl 30mM、KCl 50mM、MgCl2 1mM、DTT 5mM、dNTP 20μM、dATP 20μM。
具体的，步骤S2中的二链合成酶包括：Klenow片段0.01U/μL、RNase H 0.01U/μL。
具体的，步骤S3中双链cDNA和双链DNA的混合物为0.1-100ng。
具体的，步骤S4中DNA打断修复反应液包括：Tris-HCl 10mM、MgCl2 10mM、DTT1mM、dNTP 20μM、dATP 0.2mM、NaCl 20mM、BSA 0.1mg/ml、TritonX-100 0.1%。
实施例二：
一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，按照先后顺序包括以下步骤：
S1，从样本中提取得到DNA和RNA，共投入到一链合成反应液和一链合成酶中，对RNA进行逆转录，使RNA形成RNA/cDNA复合双链，在RNA逆转录的条件为温度不超过65℃，其时间不超过15min，RNA可以是总RNA，也可以是mRNA抓取后或者rRNA去除后的RNA，其抓取和去除方法可以为领域内的常规方法，且DNA和RNA可以是共提取的，其方法可以为领域内的常规方法，例如磁珠法或者柱提法；也可以是分开提取，然后共投入；
S2，往步骤S1中加入二链合成反应液和二链合成酶，使RNA/cDNA复合双链形成双链cDNA；
S3，纯化上述步骤中的双链cDNA和双链DNA的混合物；
S4，在S3得到的纯化产物中加入DNA打断修复反应液和DNA打断修复酶混合物，对产物同时进行片段化、末端修复和加A尾，DNA打断修复酶混合物包括DNA片段化酶和末端修复加尾酶，DNA片段化酶是非特异性DNA片段化酶和T7 Endonuclease I，非特异性DNA片段化酶为Vvn核酸酶；
S5，不纯化，向上述片段化的溶液中直接加入接头、接头反应液和连接酶进行接头连接，得接头连接产物；
S6，接着纯化接头连接产物；
S7，文库扩增：步骤S6所得产物中加入扩增酶混合液和引物，进行PCR扩增；
S8，纯化S7中的扩增产物即可以得到原始DNA/RNA可测序的文库。
优选的是，步骤S1中的样本为鼻咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血清、血浆、血液、尿液或粪便。
具体的，步骤S1中的一链合成反应液包括：Tris-HCl 40mM、KCl 70mM、MgCl2 5mM、DTT 13mM、dNTP 60μM、RNase Inhibitor 5U、Random Primer 3μM。
具体的，步骤S1中的一链合成酶为具有逆转录活性的酶。
具体的，步骤S2中的二链合成反应液包括：Tris-HCl 60mM、KCl 75mM、MgCl2 5mM、DTT 13mM、dNTP 60μM、dATP 60μM。
具体的，步骤S2中的二链合成酶包括：Klenow片段0.03 U/μL、RNase H 0.05U/μL。
具体的，步骤S3中双链cDNA和双链DNA的混合物为0.1-100ng。
具体的，步骤S4中DNA打断修复反应液包括：Tris-HCl 30mM、MgCl2 30mM、DTT5mM、dNTP 60μM、dATP 0.6mM、NaCl 50mM、BSA 0.5mg/ml、TritonX-100 0.3%。
实施例三：
一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，按照先后顺序包括以下步骤：
S1，从样本中提取得到DNA和RNA，共投入到一链合成反应液和一链合成酶中，对RNA进行逆转录，使RNA形成RNA/cDNA复合双链，在RNA逆转录的条件为温度不超过65℃，其时间不超过15min，RNA可以是总RNA，也可以是mRNA抓取后或者rRNA去除后的RNA，其抓取和去除方法可以为领域内的常规方法，且DNA和RNA可以是共提取的，其方法可以为领域内的常规方法，例如磁珠法或者柱提法；也可以是分开提取，然后共投入；
S2，往步骤S1中加入二链合成反应液和二链合成酶，使RNA/cDNA复合双链形成双链cDNA；
S3，纯化上述步骤中的双链cDNA和双链DNA的混合物；
S4，在S3得到的纯化产物中加入DNA打断修复反应液和DNA打断修复酶混合物，对产物同时进行片段化、末端修复和加A尾，DNA打断修复酶混合物包括DNA片段化酶和末端修复加尾酶，DNA片段化酶是非特异性DNA片段化酶和T7 Endonuclease I，非特异性DNA片段化酶为Vvn核酸酶；
S5，不纯化，向上述片段化的溶液中直接加入接头、接头反应液和连接酶进行接头连接，得接头连接产物；
S6，接着纯化接头连接产物；
S7，文库扩增：步骤S6所得产物中加入扩增酶混合液和引物，进行PCR扩增；
S8，纯化S7中的扩增产物即可以得到原始DNA/RNA可测序的文库。
优选的是，步骤S1中的样本为鼻咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血清、血浆、血液、尿液或粪便。
具体的，步骤S1中的一链合成反应液包括：Tris-HCl 70mM、KCl 100mM、MgCl210mM、DTT 20mM、dNTP 100μM、RNase Inhibitor 10U、Random Primer 5μM。
具体的，步骤S1中的一链合成酶为具有逆转录活性的酶。
具体的，步骤S2中的二链合成反应液包括：Tris-HCl 100mM、KCl 100mM、MgCl210mM、DTT 20mM、dNTP 100μM、dATP 100μM。
具体的，步骤S2中的二链合成酶包括：Klenow片段0.05 U/μL、RNase H 0.1U/μL。
具体的，步骤S3中双链cDNA和双链DNA的混合物为0.1-100ng。
具体的，步骤S4中DNA打断修复反应液包括：Tris-HCl 50mM、MgCl2 50mM、DTT10mM、dNTP 100μM、dATP 1mM、NaCl 80mM、BSA 1mg/ml、TritonX-100 0.5%。
下述试验例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下试验例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
在上述优选的实施例中，在对RNA进行逆转录过程中基本上都是低温操作，高温失活酶的温度不超过65℃，其时间不超过15min，在这种温度和时间下，双链DNA模板基本上不受影响，依然保存着双链的状态，保持着原始的DNA信息。所以才可以在一个体系中同时添加DNA和RNA，然后同时对DNA和RNA建库。
本发明中，在进行片段化、末端修复及加A过程中，不使用超声法进行打断，因为超声法会对DNA造成至少一半的损失，且需要昂贵的打断设备；也没有使用DNaseⅠ、Endonuclease V酶等，因为DNaseⅠ对嘧啶核苷酸旁边位点有偏好性，Endonuclease V酶一般识别特定的位点，这些酶都将大大影响终文库的多样性；更没有使用Tn5转座酶法打断，因为其片段化的偏好性经常受到业界的诟病，且其对cDNA的打断效率低，本发明中使用的是序列非特异性核酸酶——Vvn核酸酶和T7 Endonuclease I的组合。Vvn核酸酶可以在DNA上随机产生切刻，进而T7 Endonuclease I识别这个缺刻并在互补链上切割，从而产生DNA双链断裂。只需要改变酶切时间就可以将DNA酶切至特定大小的DNA片段，与初始的InputDNA量以及Input DNA长度无关，随机性与超声法相当。
下面将结合具体的试验例来进一步说明本发明的有益效果。
试验例1：
构建适用于illumina平台的文库
1.样本准备：用Qubit精确测定基因组DNA和RNA的浓度，分别取5ng酵母菌DNA和5ng人rRNA去除后的RNA，合并后用无核酸酶水补足至8.5μL；
2.一链合成：具体反应体系如下表1所示
表1
组分 体积（μL）
DNA/RNA 8.5
一链合成反应液 15.5
一链合成酶 1
总计 25
其中，一链合成反应液包括：Tris-HCl 30mM、KCl 50mM、MgCl2 1mM、DTT 5mM、dNTP 20μM、RNase Inhibitor 1U、Random Primer 0.5μM；一链合成酶是具有逆转录活性的酶，为本领域内常见的商业化的逆转录酶；
体系配制完成后将反应管置于PCR仪或其它热孵育反应仪器中，设置反应程序如表2所示，反应结束后取出反应管进行二链合成；
表2
温度℃ 时间min
25 10
42 15
65 15
4 Hold
3.二链合成：具体反应体系如下表3所示
表3
组分 体积（μL）
一链合成产物 25
二链合成反应液 3.6
二链合成酶 1
无核酸酶水 20.4
总计 25
其中，二链合成反应液包括：Tris-HCl 30mM、KCl 50mM、MgCl2 1mM、DTT 5mM、dNTP 20μM、dATP 20μM；二链合成酶包括：Klenow片段0.05U/μL、RNase H 0.05U/μL；
体系配制完成后将反应管置于PCR仪或其它热孵育反应仪器中，设置反应程序如表4所示，反应结束后取出反应管进行磁珠纯化；
表4
温度℃ 时间min
16 30
65 15
4 Hold
4.纯化
（1）DNA纯化磁珠在室温平衡30min后，充分涡旋振荡混匀，吸取90μl到上一步的反应产物中，吹打10次充分混匀，室温放置5min，使核酸充分吸附到磁珠上；
（2）放置于磁力架上静置，澄清后弃上清液；
（3）保持样品在磁力架上，加入200μl的新鲜配制的80%乙醇，静置30秒后弃上清；重复一次；
（4）保持反应管在磁力架上，开盖空气干燥约5min；
（5）将反应管从磁力架上取下，加入28μl无核酸酶水洗脱，用移液器吹打10次混匀，室温静置2min；
（6）将反应管离心后置于磁力架上，液体澄清后，转移全部上清至一新的PCR管中，进行下一步反应。
5.片段化、末端修复及加A：具体反应体系如下表5所示
表5
组分 体积（μL）
上一步纯化产物 27.6
DNA打断修复反应液 10
DNA片段化酶 10
末端修复加尾酶 2.4
总计 50
其中，末端修复加尾酶组分为：T4多聚核苷酸激酶0.2U/μL、T4 DNA聚合酶0.02U/μL、Klenow片段0.02U/μL、Taq酶0.02U/μL；DNA打断修复反应液组分为：Tris-HCl 50mM、MgCl210mM、DTT 1mM、dNTP 20μM、dATP 0.2mM、NaCl 20mM、BSA 0.1mg/ml、TritonX-100体积比0.1%；体系配制完成后将反应管置于PCR仪或其它热孵育反应仪器中，设置32℃孵育22分钟；65℃孵育30分钟，取出反应管进行接头连接；
6.接头连接：向经步骤5处理过的修复片段及所在反应液中加入连接试剂，将接头与DNA片段连接起来，反应体系如下表6所示
表6
组分 体积（μL）
上一步产物 50
接头 8
接头反应液 16
连接酶 6
总计 80
其中，连接酶组分为：T4 DNA连接酶 20U/μL、接头反应液组分为：Tris-HCl 40mM、MgCl2 5mM、DTT 1mM、ATP 0.5mM、PEG6000 5%（w/v）、1,2丙二醇 1%（v/v）；
体系配制完成后将反应管置于PCR仪或其它热孵育反应仪器中，设置25℃ 15min，反应结束后取出反应管进行下一步纯化过程；
该步骤中使用的接头为Y字形接头，接头的序列如SEQ ID NO.1-2所示，
SEQ ID NO.1：5´-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3´；
SEQ ID NO.2：5´-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC-3´；
由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.1-2两条引物退火而成，其中，SEQ ID NO.1中，3’端最后两个核苷酸之间的连接键进行硫代磷酸化修饰；SEQ ID NO.2中，第一位G进行磷酸化修饰；
7.连接产物纯化
（1）充分涡旋振荡混匀DNA纯化磁珠，吸取64μl到上一步的反应产物中，吹打10次充分混匀，室温放置5min，使核酸充分吸附到磁珠上；
（2）放置于磁力架上静置，澄清后弃上清液；
（3）保持样品在磁力架上，加入200μl的新鲜配制的80%乙醇，静置30秒后弃上清；重复一次；
（4）保持反应管在磁力架上，开盖空气干燥约5min；
（5）将反应管从磁力架上取下，加入21μl无核酸酶水洗脱，用移液器吹打10次混匀，室温静置2min；
（6）将反应管离心后置于磁力架上，液体澄清后，转移全部上清至一新的PCR管中，进行下一步反应；
8.文库扩增：利用扩增酶和通用引物、index引物对纯化后的带接头片段进行PCR富集，得到DNA文库，具体见表7
表7
组分 体积（μL）
上一步产物 20
高保真扩增酶混液 25
通用引物(10μM) 2.5
index引物(10μM) 2.5
总计 50
其中，高保真扩增酶混液为kapa 2xHiFi Hotstart ReadyMix。
通用引物序列如SEQ ID NO.3所示，index引物序列如SEQ ID NO.4所示，
SEQ ID NO.3：5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3´；
SEQ ID NO.4：5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3´；
其中第24位与第25位碱基之间的“NNNNNNNN”表示8个碱基的标签序列。通用引物和index引物的3’端最后两个核苷酸之间的连接键进行硫代磷酸化修饰。
接着，按照表8的PCR程序进行PCR扩增
表8
Figure DEST_PATH_IMAGE002
9.PCR产物纯化
（1）充分涡旋振荡混匀DNA纯化磁珠，吸取45μl到上一步的反应产物中，吹打10次充分混匀，室温放置5min，使核酸充分吸附到磁珠上；
（2）放置于磁力架上静置，澄清后弃上清液；
（3）保持样品在磁力架上，加入200μl的新鲜配制的80%乙醇，静置30秒后弃上清；重复一次；
（4）保持反应管在磁力架上，开盖空气干燥约5min；
（5）将反应管从磁力架上取下，加入21μl无核酸酶水洗脱，用移液器吹打10次混匀，室温静置2min；
（6）将反应管离心后置于磁力架上，液体澄清后，转移20μl上清至一新的PCR管中，进行下一步反应。
10.文库质检：使用Qubit® dsDNA HS Assay Kit检测文库的浓度，使用Qsep-100分析文库片段大小，均按照说明书要求进行操作，经质检，如表9和图3可以看出，本发明的方法快速，构建的文库总量高；
表9
起始量ng 浓度ng/μl 体积μl 总量ng
5ng DNA+5ng RNA 7.74 20 154.8
11.上机测序，并进行数据分析，得到表10数据
表10
Type Number
Raw Reads 42922632
Clean Reads 37140314
Raw Base(G) 12.88
Clean Base(G) 11.14
Effectice Rate(%) 86.53
比对到酿酒酵母的Reads(e6) 6.32
比对到人基因组的Reads(e6) 33.77
从表中数据可以看出，本发明所述的DNA/RNA共建库得到的文库有效数据量高，DNA和RNA都很好的检测到，做到了真正意义上的共建库。
试验例2：
构建适用于华大智造平台的文库
同样以5ng 酵母菌DNA和5ng人rRNA去除后的RNA为样本构建文库，与实施例一不同的是接头和引物的序列。
针对华大智造平台所用的接头是Ω型接头，接头的序列如SEQ ID NO.5-6所示：
SEQ ID NO.5：5´-TTGTCTTCCTAAGGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3´；
SEQ ID NO.6：5´-AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAYYYYYYYYYYCAACTCCTTGGCTCACA-3´；
由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6两条引物退火而成。其中，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中，3’端最后两个核苷酸之间的连接键进行硫代磷酸化修饰；SEQ ID NO.6中，第一位A进行磷酸化修饰，其中第31位与第32位碱基之间的“YYYYYYYYYY”表示10个碱基的标签序列；
相应的，PCR扩增引物包含一对通用引物，序列如SEQ ID NO.7-8所示：
SEQ ID NO.7：5´-GAACGACATGGCTACGA-3´；
SEQ ID NO.8：5´-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3´；
其中，SEQ ID NO.7的第一位碱基G进行磷酸化修饰。
样本的建库结果如下表11和图4所示：
表11
起始量ng 浓度ng/μl 体积μl 总量ng
5ng DNA+5ng RNA 5.5 20 110
从表中数据可以看出，本发明所述的DNA/RNA共建库流程，在针对不同测序平台进行建库时，不用更换片段化酶，也无需针对酶再制作复合体，至需要更换成现有的针对不同平台的接头和引物即可。
试验例3：Tn5转座酶法构建DNA/RNA共建库，与试验例1结果对比。
购买商业上Tn5转座酶法试剂盒针对DNA/RNA共建库的试剂盒进行建库，具体建库流程如图5所示。
样本准备：用Qubit精确测定基因组DNA和RNA的浓度。同样，分别取5ng 酵母菌DNA和5ng 人rRNA去除后的RNA混合建库。
其余流程操作严格按照说明书进行，建库结果如表12和图6所示，上机测序后的分析结果如表13所示，从分析结果可以看出，同样的DNA和RNA进入量情况下，（1）Reads数和Base数都要比本发明的结果低；（2）数据有效率也很低，只有23.32%；（3）比对到RNA上的数据量很少。说明Tn5这种方法对cDNA的打断效率低，没有真正做到共建库效果。
表12
起始量ng 浓度ng/μl 体积μl 总量ng
5ng DNA+5ng RNA 22 20 440
表13
Type Number
Raw Reads 28622927
Clean Reads 6675153
Raw Base(G) 8.59
Clean Base(G) 2
Effectice Rate(%) 23.32
比对到酿酒酵母的Reads(e6) 3.38
比对到人基因组的Reads(e6) 0.24
试验例4：验证本发明方法的效果。
样本准备：实验上已经验证过的DNA样本和RNA样本，其具体的病原微生物种类和Reads如下表14所示
表14
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实验分组：按照下表15所示对样本进行分组，共投入DNA和RNA，以验证本方法的检出效果，其余实验条件同试验例1。
表15
样本 DNA RNA
H1 DNA样本1 RNA样本
H2 DNA样本2 RNA样本
H3 DNA样本3 RNA样本
三个样本的测序分析结果如下表16所示，从结果中，可以看出，DNA病原和RNA病原都能很好的检测出，本发明方法可以完成DNA/RNA共建库。
表16
Figure DEST_PATH_IMAGE006
可见，本发明通过改进酶体系和缓冲液体系，改变关键步骤的处理方法，使得病原微生物建库时间短且高效，该方法有效解决了目前病原微生物建库时间长、起始量要求高、成本高的问题，而且真正意义上做到了共建库，提高了二代测序的适用范围，使得其应用范围更广。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
S1，从样本中提取得到DNA和RNA，共投入到一链合成反应液和一链合成酶中，对RNA进行逆转录，使RNA形成RNA/cDNA复合双链，在RNA逆转录的条件为温度不超过65℃，其时间不超过15min；
S2，往步骤S1中加入二链合成反应液和二链合成酶，使RNA/cDNA复合双链形成双链cDNA；
S3，纯化上述步骤中的双链cDNA和双链DNA的混合物；
S4，在S3得到的纯化产物中加入DNA打断修复反应液和DNA打断修复酶混合物，对产物同时进行片段化、末端修复和加A尾；
S5，不纯化，向上述片段化的溶液中直接加入接头、接头反应液和连接酶进行接头连接，得接头连接产物；
S6，接着纯化接头连接产物；
S7，文库扩增：步骤S6所得产物中加入扩增酶混合液和引物，进行PCR扩增；
S8，纯化S7中的扩增产物即可以得到原始DNA/RNA可测序的文库。
2.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中的所述样本为鼻咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血清、血浆、血液、尿液或粪便。
3.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中的所述一链合成反应液包括：Tris-HCl 20-70mM、KCl 50-100mM、MgCl2 1-10mM、DTT 5-20mM、dNTP 20-100μM、RNase Inhibitor 1-10U、Random Primer 0.5-5μM。
4.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中的所述一链合成酶为具有逆转录活性的酶。
5.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中的所述二链合成反应液包括：Tris-HCl 30-100mM、KCl 50-100mM、MgCl2 1-10mM、DTT 5-20mM、dNTP 20-100μM、dATP 20-100μM。
6.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中的所述二链合成酶包括：Klenow片段0.01-0.05 U/μL、RNase H 0.01-0.1U/μL。
7.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S3中所述双链cDNA和双链DNA的混合物为0.1-100ng。
8.根据权利要求1所述的一种病原微生物检测用测序文库的构建方法，其特征在于：所述步骤S4中所述DNA打断修复反应液包括：Tris-HCl 10-50mM、MgCl2 10-50mM、DTT 1-10mM、dNTP 20-100μM、dATP 0.2-1mM、NaCl 20-80mM、BSA 0.1-1 mg/ml、TritonX-1000.1%-0.5%。
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