CN115747208A - 一种dna/rna混合物的处理方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种DNA/RNA混合物的处理方法，属于生物技术领域。该方法通过提前消化DNA/RNA混合物样本中的部分DNA，能够有效提高DNA/RNA总核酸样本共建库中RNA的检出率，有利于RNA病原的检测和mNGS结果的解析。

Description

一种DNA/RNA混合物的处理方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA/RNA混合物的处理方法。

背景技术

感染性疾病是临床常见疾病之一，多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。感染是急危重症患者死亡的主要原因之一。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，短时间内能否明确致病病原微生物至关重要。

宏基因组高通量测序(metagenomics NGS，mNGS)目前在病原微生物感染检测方面的应用如火如荼，特别是对新发的未知感染源检测特别有效，如新冠肺炎感染，最初就是通过mNGS技术来确诊了感染源是一种新型的冠状病毒。感染相关的病原微生物种类繁多，不过以遗传物质来分类的话，可以分为RNA和DNA病原微生物。常规的mNGS检测一次只能针对一种核酸类型的微生物，比如细菌类的感染病例(肺炎支原体、结核分歧杆菌等)或者RNA病毒类(冠状病毒、艾滋病毒等)的案例。然后在实际的感染病例确诊过程中，特别是对于疑难的新发病例诊断，往往连病原微生物的基本信息都难以获得，换言之无法确认是DNA还是RNA来源的微生物。这时候，如果能同时进行基因组(DNA)和转录组(RNA)建库测序，那必然可以加速感染源的定位。

DNA建库常见方法是双链建库，DNA经过末端补平，加A尾后通过连接的方法加上测序接头完成建库。RNA则是在测序前需要经过逆转录，形成一链cDNA，二链后类似双链DNA后再建库。如果需要对DNA及RNA同时进行检测，一般需要对DNA、RNA分别提取后，分别建库。如果能使DNA、RNA共同建库，共同检测，可以节约样本，单一样本通过总核酸提取后，可以同时对DNA、RNA建库并获得两者遗传信息，因此可以达到节约样本的目的。另一方面，总核酸共同建库可以更加灵敏地获得遗传信息。例如在宏基因组(mNGS)检测中，可以同时检测DNA病毒及RNA病毒，提高了检测效率。在肿瘤检测中，如果同时检测DNA及RNA，不仅可以有效检测突变，插入/缺失突变(Indel)更可以在RNA水平检测出融合和基因跳跃，RNA表达差异等，临床意义巨大。因此，DNA、RNA共测序成为目前技术攻坚对象。

DNA/RNA共建库是一种比较前沿的技术，相关的文献报道很少。鉴于感染中病原微生物RNA/DNA共提取的难度大、复杂性高、DNA和RNA丰度差异大等问题，要想实现DNA/RNA共建库，本身就是一个不小的挑战。目前仅有的DNA/RNA共建库报道中RNA建库部分还是使用了传统的RNA建库原理，即先进行RNA逆转录生产cDNA第一链，而后利用RNase H和DNA聚合酶I合成双链cDNA。最后，体系中原有的基因组DNA和后生成的双链cDNA就可以进行常规的DNA建库方案，一般为片段化酶法和转座酶法建库。该方案存在一些缺点，例如RNA病毒本身含量低且稳定性较差，在多轮实验操作过程中损耗严重，极易因达不到检出限而出现漏检。对于微量DNA/RNA的建库效率低，如从痰液、口拭子、肺泡灌洗液等感染类样本中共提取的DNA/RNA样本。

发明内容

本申请的目的在于提供一种DNA/RNA混合物的处理方法。

本申请的发明人发现，通过共提取获得的临床DNA/RNA混合样本共建库后，得到的测序结果中DNA的数据偏多，RNA数据少而检出率低，对临床上mNGS的结果解析难度很大。尤其是针对本身含量就较少的病毒RNA样本，检出率低会造成漏检的情况，对临床的判断带来很大的困难，因此提高共提取样本用于共建库时的RNA检出是很有必要的，有利于mNGS的检测。

由于真实核酸共提取样本中DNA和RNA的比例不是固定值，通过模拟提取样本中不同的DNA和RNA的比例，使用含有不同质量比的DNA和RNA(9：1，5：1，1：1)的混合样本进行共建库并测序。若先消化DNA/RNA共提取混合物中的一部分DNA，将消化后的DNA/RNA混合物中的RNA进行逆转录，在片段化前将剩余DNA掺入，可提高RNA的检出，且消化DNA的比例越高，RNA的检出越多，对低丰度的RNA病原灵敏度提高。

本申请的第一方面提供一种DNA/RNA混合物的处理方法，所述方法包括：

(1)获得DNA/RNA混合物；

(2)将DNA/RNA混合物按照N:1的比例分为样本a和样本b，其中N是大于等于2的常数，所述比例可以是体积比、质量比或摩尔比，优选质量比；

(3)消化样本a中的DNA得到DNA含量减少的DNA/RNA混合物或基本不含DNA的RNA混合物；

任选地，纯化或者不纯化上述消化产物；

(4)将DNA含量减少的DNA/RNA混合物或基本不含DNA的RNA混合物进行逆转录，合成cDNA一链；

任选地，在cDNA一链合成之后再合成cDNA二链；

(5)将步骤(4)的产物与样本b混合。

在一些实施方案中，所述方法采用核酸酶消化样本a中的DNA。在一些实施方案中所述核酸酶是DNA内切酶，例如核酸内切酶dsDNase、T7核酸内切酶、核酸内切酶Vvn或核酸内切酶DNaseⅠ、核酸内切酶DNaseⅡ中的一种或多种，优选核酸内切酶DNaseⅠ。

在一些实施方案中，所述核酸酶是一切具有消化单链或双链DNA功能的酶，且所述核酸酶不消化RNA。

在一些实施方案中，N是大于等于2的常数，例如2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.2、5.5、5.8、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5。

在一些实施方案中，所述N是大于19的常数，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、46、47、48、49、50。

在一些实施方案中，所述逆转录过程使用M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶，优选M-MLV逆转录酶。

在一些实施方案中，所述逆转录过程使用的引物是Oligo(dT)或随机六聚体，优选随机六聚体。

在一些实施方案中，所述DNA/RNA混合物是经过共提取获得的，例如磁珠法，层析柱法和有机溶剂法。

在一些实施方案中，所述DNA/RNA混合物中的DNA的质量大于等于RNA的质量。在一些实施方案中，所述DNA/RNA混合物中的DNA的摩尔量大于等于RNA的摩尔量。

在一些实施方案中，所述方法还包括对逆转录产物进行纯化，优选磁珠纯化。

本申请的第二方面提供一种DNA/RNA共建库方法，所述方法包括：

(1)使用第一方面的方法处理DNA/RNA混合物样本，得到总核酸样本；

(2)任选地，纯化得到的总核酸样本；

(3)将总核酸样本与转座酶复合物孵育，得到片段化的核酸样本；

(4)加入带有接头序列的引物，通过PCR扩增得到带有接头的核酸片段；

(5)任选地，对扩增产物进行纯化。

在一些实施方案中，所述转座酶复合物包括转座酶和转座酶识别核心序列(ME序列)，优选地，所述转座酶复合物还包括标签序列。

在一些实施方案中，所述转座酶是Tn5转座酶，所述Tn5转座酶是本领域已知的任何Tn5转座酶或其活性突变体。

在一些实施方案中，所述Tn5转座酶是具有打断RNA-cDNA杂合链活性的Tn5转座酶。

在一些实施例中，所述引物包括带有第一接头序列的第一引物和带有第二接头序列的第二引物。

在一些实施方案中，所述接头序列是当前或将来测序平台(包括但不限于iontorrent平台、illumina平台和华大平台)使用的测序基质相关序列。

在一些实施方案中，所述第一接头序列是Illumina平台的P5接头序列，所述第二接头序列是Illumina平台的P7接头序列，反之亦然。

在一些实施方案中，所述第一接头序列是ion torrent平台的P1衔接头序列，所述第二接头序列是ion torrent平台的A衔接头，反之亦然。

在一些实施方案中，所述第一接头序列是MGI平台的单端标签建库上游夹板序列，所述第二接头序列是MGI平台的单端标签建库下游夹板序列，反之亦然。在一些实施方案中，所述第一接头序列是MGI平台的双端标签建库上游夹板序列，所述第二接头序列是MGI平台的双端标签建库下游夹板序列，反之亦然。

在一些实施方案中，所述引物还包括索引序列(index)。在一些实施方案中，所述索引序列为例如6-8个碱基，优选8个。

在一些实施方案中，所述引物还包括与Tn5识别核心序列(ME序列)相同或互补的序列。在一些实施方案中，所述引物还包括与标签序列互补的序列。

在一些实施方案中，所述第一引物是N5引物，所述第二引物是N7引物，反之亦然。

在一些实施方案中，所述步骤(3)的孵育温度是40-70℃，例如45-65℃，例如50-60℃，例如55℃温育1-25分钟，例如3-20分钟，例如5-15分钟，例如10分钟。

在一些实施方案中，所述方法还包括终止片段化反应的步骤，例如使Tn5转座酶失活，例如加入EDTA。

在一些实施方案中，所述纯化步骤中采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法，优选磁珠法。

本申请的第三方面提供一种DNA/RNA共建库方法，所述方法包括：(1)使用第一方面的方法处理DNA/RNA混合样本，得到总核酸样本；(2)打断，获得片段化的核酸样本；(3)对片段化的核酸末端修复得到核酸片段；(4)任选地，纯化核酸片段；(5)接头连接；(6)文库扩增。

在一些实施方案中，所述打断包括但不限于采用片段化酶法、化学法和/或机械法对所述核酸样本进行片段化。在一些实施方案中，所述机械法为例如超声断裂法、离心法或热休克法，所述化学法为例如利用化学试剂处理所述核酸样本使其断裂为多个片段。

在一些实施方案中，所述片段化酶法是例如使用EndonucleaseⅤ、Fragmentase、T7 endonuclease I中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述末端修复包括对所述片段化的核酸的末端进行补平，以使所述片段化的核酸能够与平端接头进行连接。

在一些实施方案中，所述末端修复还包括加A的步骤，即在末端补平后的3’末端加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，以实现将所述核酸片段与所述接头通过A-T连接。

在一些实施方案中，对所述片段化的核酸进行末端补平的酶为例如T4 DNA聚合酶，所述加A步骤使用的酶为例如Klenow DNA聚合酶(3'-5'exo-)。

在一些实施方案中，所述接头是Y型衔接头或泡状接头。在一些实施方案中，所述接头是illumina平台的测序长接头或短接头或华大智造MGI平台的泡状接头或IonTorrent平台的测序接头。

在一些实施方案中，所述纯化步骤中采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法进行纯化；优选磁珠法。

本申请的第四方面提供一种根据第二方面或第三方面的方法构建的测序文库。

在一些实施方案中，所述测序文库中RNA的reads数大于未经处理的DNA/RNA混合样本共建文库中RNA的reads数。

本申请的第五方面提供一种基于mNGS检测病原微生物的方法，所述方法包括：(1)获取生物样本；(2)共提取核酸，获得DNA/RNA混合物样本；(3)使用第一方面的方法处理DNA/RNA混合物样本，获得总核酸样本；(4)对总核酸样本进行文库构建；(5)上机测序。

在一些实施方案中，所述生物样本为鼻咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血液、尿液或粪便。

在一些实施方案中，所述DNA/RNA混合物样本来源于宿主和病原微生物，所属宿主是例如人，所述病原微生物是例如真菌、细菌、病毒、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、朊毒体和寄生虫中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述病原细菌是例如金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、艰难梭菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌、嗜肺军团菌、粪肠球菌、脓肿分枝杆菌、副流感嗜血杆菌和结核分枝杆菌。

在一些实施方案中，所述病原真菌是例如白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、粗球孢子菌、耶氏肺孢子菌、荚膜组织胞浆菌和近平滑念珠菌。

在一些实施方案中，所述病原病毒是例如人博卡病毒、人细小病毒、人多瘤病毒、EB病毒、巨细胞病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒、细环病毒、水痘-带状疱疹病毒、传染性软疣病毒、呼吸道合胞病毒、水疱性口炎病毒和登革热病毒。

在一些实施方案中，所述文库构建方法包括但不限于本领域常用的片段化酶法、机械法和转座酶法。

有益效果

本发明可解决在共提取时因DNA多于RNA而在共建库时造成RNA检出低的问题，将RNA的检出率提高40％-191％。因此显著提高了RNA检测的灵敏度，实现一份共提取样本可同时对其DNA和RNA进行检测。

相关术语解释

共提取：将样本中的DNA和RNA同时提取出来，可以实现一份样本一次性提取两种核酸，提高了样本的利用率(尤其是针对珍贵的样本)、缩短了提取的时间、降低了提取的试剂成本、减少了提取的时间。

共建库：能同时利用DNA模板和RNA模板进行建库，实现一份样本同时得到DNA和RNA的信息。

mNGS：宏基因组测序(Metagenomics Next Generation Sequencing)是综合分析来自患者样本的微生物和宿主的基因物质(DNA和RNA)的方法，应用于多种感染性疾病的诊断、疾病和健康状态下微生物学分析、人类宿主反应对感染传播的特征化、识别肿瘤相关病毒。

附图说明

图1：DNA消化90％时，对照组和实验组的实验流程图；

图2：DNA消化90％时，DNA和RNA模板掺入比例为1:1的建库产出图；

图3：DNA消化90％时，DNA和RNA模板掺入比例为1:1的测序reads数；

图4：DNA消化90％时，DNA和RNA模板掺入比例为5:1的建库产出图；

图5：DNA消化90％时，DNA和RNA模板掺入比例为5:1的测序reads数；

图6：DNA消化90％时，DNA和RNA模板掺入比例为10:1的建库产出图；

图7：DNA消化90％时，DNA和RNA模板掺入比例为10:1的测序reads数；

图8：DNA消化95％时，对照组和实验组的实验流程图；

图9：DNA消化95％时，DNA和RNA模板掺入比例为10:1的建库产出图；

图10：DNA消化95％时，DNA和RNA模板掺入比例为10:1的测序reads数；

图11：DNA消化68％时，对照组和实验组的实验流程图；

图12：DNA消化68％时，DNA和RNA模板掺入比例为10:1的建库产出图；

图13：DNA消化68％时，DNA和RNA模板掺入比例为10:1的测序reads数。

具体实施方式(实施例)

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案，但下述的实例仅仅是本申请的简易例子，并不代表或限制本申请的权利保护范围，本申请的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1

DNA和RNA模板掺入质量比例：1:1

(1)模板准备：DNA和RNA混合模板(DNA模板：1ng拟南芥DNA+100pg PRV；RNA模板：1ng 293gRNA+100pg PRRSV)，模板共10μl。对照组使用此模板。

(2)实验组模板部分消化(先消化90％的DNA)：取9μl的上述DNA和RNA的混合模板，加入3μl的Nuclease-free ddH₂O，3μl的wiper(Vazyme#TR501)，共15μl。在PCR仪中42℃2min，85℃30sec，4℃Hold。

(3)对照组模板：10μl未处理的DNA和RNA混合模板，加入5μl的Nuclease-freeddH₂O，共15μl。

(4)逆转录：将2μl的10×RT Mix(逆转录缓冲液，Vazyme#TR501)，2μl的HiScriptIII Enzyme Mix(逆转录酶，Vazyme#TR501)，1μl的Random hexamers(随机六聚体引物，Vazyme#TR501)混合，作为逆转录试剂。实验组：将5μl的逆转录试剂，与15μl的上述实验组部分消化的模板混匀。对照组：将5μl的逆转录试剂，与15μl的上述对照组的模板混匀。在PCR仪中进行25℃5min；37℃20min；85℃5sec；4℃Hold。

(5)片段化：实验组：将20μl的逆转录产物，与1μl未处理的样本混匀，再加入10μl的Tagment buffer(片段化反应缓冲液，Vazyme#TR501)与5μl的Tn5 VR100(Tn5转座酶，Vazyme#TR501)混匀，在PCR仪中55℃反应10min。对照组：将20μl的逆转录产物，与1μl的Nuclease-free ddH₂O混匀，再加入10μl的Tagment buffer(Vazyme#TR501)与5μl的Tn5VR100(Vazyme#TR501)混匀，在PCR仪中55℃反应10min。

(6)终止反应：室温解冻TStop Solution(终止液，Vazyme#TR501)，上下颠倒混匀后备用。反应完成后，在反应液中加入2μl TStop Solution，涡旋振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

(7)PCR反应：按照如下表配制反应体系，共100μl：

将配制好的测试组反应体系至于PCR仪器中，进行如下反应：

将配制好的对照组反应体系至于PCR仪器中，进行如下反应：

(8)磁珠纯化

①将VAHTS DNA Clean Beads(Vazyme#N411)提前30min从2～8℃取出，静置使其平衡至室温。

②颠倒或旋涡振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取50μl(1×)加入到上一步产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。

③室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上。

④将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。

⑤保持样品处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。

⑥重复步骤⑤一次。

⑦保持样品处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min。

⑧将样品从磁力架上取出，加入22.5μl Nuclease-free H₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取20μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。

(9)产量检测：将纯化的产物进行浓度测定，产出如图2，实验组和对照组产出均较高超过500ng，可以进行测序。

(10)测序：将对照组和测试组进行二代测序，数据量为20M，分析其不同DNA和RNA模板的检出。

检出结果如图3，实验组比对照组的两种RNA检测灵敏度提高了55-81％，其中293gRNA提升55％((6033466-3884194)/3884194)，PRRSV提升81％((31002-17190)/17190)。

实施例2

DNA和RNA模板掺入质量比例：5:1

(1)模板准备：DNA和RNA混合模板(DNA模板：1ng拟南芥DNA+100pg PRV；RNA模板：200pg 293gRNA+20pg PRRSV)，模板共10μl。

(2)后续实验步骤同实施例1(先消化90％的DNA)。

(3)产量检测：将纯化的产物进行浓度测定，产出如图4，实验组和对照组产出均较高超过500ng，可以进行测序。

(4)测序：将对照组和实验组进行二代测序，数据量为20M，分析其不同DNA和RNA模板的检出。

检出结果如图5，实验组比对照组的两种RNA检测灵敏度提高了67-75％，其中293gRNA提升75％((2570191-1472580)/1472580)，PRRSV提升67％((12474-7488)/7488)。

实施例3

DNA和RNA模板掺入质量比例：10:1

(1)模板准备：DNA和RNA混合模板(DNA模板：1ng拟南芥DNA+100pg PRV；RNA模板100pg 293gRNA+10pg PRRSV)，模板共10μl。

(2)后续实验步骤同实施例1(先消化90％的DNA)。

(3)产量检测：将纯化的产物进行浓度测定，产出如图6，实验组和对照组产出均较高超过500ng，可以进行测序。

(4)测序：将对照组和实验组进行二代测序，数据量为20M，分析其不同DNA和RNA模板的检出。

检出结果如图7，实验组比对照组的两种RNA检测灵敏度提高了58％，其中293gRNA提升58％((1520249-959203)/959203)，PRRSV提升58％((6079-3857)/3857)。

实施例4

DNA和RNA模板掺入质量比例：10:1

(1)模板准备：DNA和RNA混合模板(DNA模板：1ng拟南芥DNA+100pg PRV；RNA模板100pg 293gRNA+10pg PRRSV)，模板共10μl。

(2)实验组模板部分消化(先消化95％的DNA)：取9.5μl的上述DNA和RNA的混合模板，加入2.5μl的Nuclease-free ddH₂O，3μl的wiper(Vazyme#TR501)，共15μl。在PCR仪中42℃2min，85℃30sec，4℃Hold。

(3)对照组模板：10μl未处理的DNA和RNA混合模板，加入5μl的Nuclease-freeddH2O，共15μl。

(4)逆转录：将2μl的10×RTMix(Vazyme#TR501)，2μl的HiScript III Enzyme Mix(Vazyme#TR501)，1μl的Random hexamers(Vazyme#TR501)混合，作为逆转录试剂。实验组：将5μl的逆转录试剂，与15μl的上述实验组部分消化的模板混匀。对照组：将5μl的逆转录试剂，与15μl的上述对照组的模板混匀。在PCR仪中进行25℃5min；37℃20min；85℃5sec；4℃Hold。

(5)片段化：实验组：将20μl的逆转录产物，与0.5μl未处理的样本混匀，再加入10μl的Tagment buffer(Vazyme#TR501)与5μl的Tn5 VR100(Vazyme#TR501)混匀，在PCR仪中55℃反应10min。对照组：将20μl的逆转录产物，与0.5μl的Nuclease-free ddH₂O混匀，再加入10μl的Tagment buffer(Vazyme#TR501)与5μl的Tn5 VR100(Vazyme#TR501)混匀，在PCR仪中55℃反应10min。

(6)后续实验步骤同实施例1。

(7)产量检测：将纯化的产物进行浓度测定，产出如图9，实验组和对照组产出均较高超过500ng，可以进行测序。

(8)测序：将对照组和实验组进行二代测序，数据量为20M，分析其不同DNA和RNA模板的检出。

检出结果如图10，实验组比对照组的两种RNA检测灵敏度提高了40-191％，其中293gRNA提升40％((1141108-813142)/813142)，PRRSV提升191％((5752-1975)/1975)。

实施例5

DNA和RNA模板掺入质量比例：10:1，流程如图11。

(1)模板准备：DNA和RNA混合模板(DNA模板：1ng拟南芥DNA+100pg PRV；RNA模板100pg 293RNA+10pg PRRSV)，模板共3.1μl。

(2)实验组模板部分消化(先消化68％的DNA)：取2.1μl的上述DNA和RNA的混合模板，加入9.9μl的Nuclease-free ddH₂O，3μl的wiper(Vazyme#TR501)，共15μl。在PCR仪中42℃2min，85℃30sec，4℃Hold。

(3)对照组模板：10μl未处理的DNA和RNA混合模板，加入5μl的Nuclease-freeddH₂O，共15μl。

(4)逆转录：将2μl的10×RTMix(Vazyme#TR501)，2μl的HiScript III Enzyme Mix(Vazyme#TR501)，1μl的Random hexamers(Vazyme#TR501)混合，作为逆转录试剂。实验组：将5μl的逆转录试剂，与15μl的上述实验组部分消化的模板混匀。对照组：将5μl的逆转录试剂，与15μl的上述对照组的模板混匀。在PCR仪中进行25℃5min；37℃20min；85℃5sec；4℃Hold。

(6)后续实验步骤同实施例1。

(7)产量检测：将纯化的产物进行浓度测定，产出如图12，实验组和对照组产出均较高超过500ng，可以进行测序。

(8)测序：将对照组和实验组进行二代测序，数据量为20M，分析其不同DNA和RNA模板的检出。

检出结果如图13，实验组比对照组的两种RNA检测灵敏度提高了6-10％，其中293gRNA提升了6％((894837-842540)/842530)，PRRSV提升了10％((2341-2133)/2133)。

Claims (25)

1.一种DNA/RNA混合物的处理方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)获得DNA/RNA混合物；

(2)将所述混合物按照N:1的比例分为样本a和样本b，其中N是大于等于2的常数；

(3)消化样本a中的DNA得到DNA含量减少的DNA/RNA混合物或基本不含DNA的RNA混合物；任选地，纯化或者不纯化上述消化产物；

(4)将DNA含量减少的DNA/RNA混合物或基本不含DNA的RNA混合物进行逆转录，合成cDNA一链；任选地，在cDNA一链合成之后再合成cDNA二链；

(5)将步骤4的产物与样本b混合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法采用核酸酶消化样本a中的DNA，优选DNA内切酶，更优选DNaseⅠ。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N小于等于25，优选小于等于24，更优选小于等于23，更优选小于等于22，更优选小于等于21，更优选小于等于20，最优选小于等于19。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录过程使用随机六聚体引物。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA/RNA混合物中的DNA的质量大于等于RNA的质量。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA/RNA混合物中的DNA的摩尔量大于等于RNA的摩尔量。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA/RNA混合物是经过共提取获得的，优选磁珠法共提取。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对步骤(4)的产物进行纯化，优选磁珠纯化。

9.一种提高DNA/RNA共建库方法，所述方法包括：(1)使用权利要求1-8任一项所述的方法处理DNA/RNA混合物样本，得到总核酸样本；(2)任选地，纯化得到的总核酸样本；(3)将总核酸样本与转座酶复合物孵育，得到片段化的核酸样本；(4)加入带有接头序列的引物，通过PCR扩增得到带有接头的核酸片段；(5)任选地，对扩增产物进行纯化。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转座酶复合物包括转座酶和转座酶识别核心序列(ME序列)，优选地，所述转座酶是Tn5转座酶。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述转座酶复合物还包括标签序列。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述引物还包括索引序列(index)。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述引物还包括与标签序列互补的序列。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述引物包括带有第一接头序列的第一引物和带有第二标签序列的第二引物。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第一接头序列是Illumina平台的P5接头序列，所述第二接头序列是Illumina平台的P7接头序列。

16.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括终止片段化反应的步骤，优选加入EDTA。

17.一种DNA/RNA共建库方法，所述方法包括：(1)使用权利要求1-8任一项所述的方法处理DNA/RNA混合样本，得到总核酸样本；(2)打断，获得片段化的核酸样本；(3)对片段化的核酸末端修复得到核酸片段；(4)任选地，纯化核酸片段；(5)接头连接；(6)文库扩增。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述末端修复包括对所述片段化的核酸的末端进行补平。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述末端修复还包括在所述片段化的核酸的3’末端加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。

20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述打断方式是片段化酶法、化学法和/或机械法对所述核酸样本进行片段化，优选片段化酶法。

21.使用权利要求9-20任一项所述方法构建的测序文库。

22.一种基于mNGS检测病原微生物的方法，所述方法包括：(1)获取生物样本；(2)共提取核酸，获得DNA/RNA混合物样本；(3)使用权利要求1-8任一项所述的方法处理DNA/RNA混合物样本，获得总核酸样本；(4)对总核酸样本进行文库构建；(5)上机测序。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述生物样本为鼻咽拭子、口腔拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血液、尿液或粪便。

24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述DNA/RNA混合物样本来源于宿主和病原微生物，所述病原微生物是真菌、细菌、病毒、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、朊毒体和寄生虫中的一种或多种。

25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述文库构建方法是片段化酶法、机械法或转座酶法。

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