CN112011596A - 一种同时检测多种微生物基因组的方法、溶液和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种同时检测多种微生物基因组的方法、溶液和试剂盒。本申请方法包括采用微生物RNA检测流程对待测样品进行高通量测序；在此之前，预先对待测样品进行微生物细胞裂解处理，即采用真菌细胞壁溶解酶对待测样品进行细胞壁裂解处理，同时，在处理溶液中添加RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇；细胞壁裂解处理完成后，进一步进行物理研磨；然后再进行核酸提取和微生物RNA检测流程。本申请方法，实现了一份样品仅通过一个流程即可全面检测样品中包括RNA和DNA在内的微生物基因组核酸；降低了微生物基因组检测成本和工作量，提高了检测效率；减少了样品用量，使样品量较少的特殊样品或珍贵样品也能更完整的获得微生物基因组核酸信息。

Description

一种同时检测多种微生物基因组的方法、溶液和试剂盒

技术领域

本申请涉及微生物基因组检测领域，特别是涉及一种同时检测多种微生物基因组的方法、溶液和试剂盒。

背景技术

相比于常规的微生物检测方法，高通量测序技术可以更快捷、更精确地鉴定微生物物种，并且可以做到同时检测样品中含有的全部微生物；因此，高通量测序技术正逐渐被广泛应用于微生物检测领域，尤其是对于背景情况未知的样品。

基于高通量测序技术可以同时检测未知样品中的多种微生物的基因组，即实现多种微生物基因组同时检测。但是面对未知样品时，同时检测多种微生物基因组的高通量测序技术同样面临一些困难，具体如下：

微生物基因组分为两种，有些物种基因组为DNA，有些基因组为RNA，如RNA病毒；因此，同时检测多种微生物基因组的高通量测序技术也相应分为微生物DNA检测流程和微生物RNA检测流程。为了满足检测结果的全面性与准确性，现在流行的检测方式是将一份样品同时做两次检测，即分别进行微生物DNA检测流程和微生物RNA检测流程，将两个检测流程的结果相加，即得到待测样品的全部的微生物基因组核酸信息。但是对于一些特殊样品或珍贵样品，由于样品采样量小或剩余量较少，无法满足同时操作微生物DNA检测流程和微生物RNA检测流程，以至于难以获得更完整的微生物基因组核酸信息。

研究显示，微生物RNA检测流程中会保留部分DNA信息；因此，相对于微生物DNA检测流程，微生物RNA检测流程能够获得更多的微生物基因组核酸信息。但是，毕竟微生物RNA检测流程的主要检测对象是RNA，DNA信息只是部分残留，会存在较多的漏检，无法获得完整的DNA信息；因此，仅仅是微生物RNA检测流程，也难以获得完整的全部微生物基因组核酸信息。

综上所述，对于无法满足同时操作微生物DNA检测流程和微生物RNA检测流程两个检测流程的待测样品，如何更完整的获得其微生物基因组核酸信息，是目前亟待解决的技术难题。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的同时检测多种微生物基因组的方法、溶液和试剂盒。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种同时检测多种微生物基因组的方法，包括采用微生物RNA检测流程对待测样品进行高通量测序；并且，在进行微生物RNA检测流程之前，预先对准备进行核酸提取的待测样品进行微生物细胞裂解处理；该微生物细胞裂解处理包括，采用真菌细胞壁溶解酶对待测样品进行细胞壁裂解处理，同时，在细胞壁裂解处理的溶液中添加RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇；细胞壁裂解处理完成后，进一步进行物理研磨；然后再进行后续的核酸提取以及微生物RNA检测流程。

需要说明的是，本申请同时检测多种微生物基因组的方法，在对待测样品进行核酸提取之前，预先采用真菌细胞壁溶解酶对待测样品中可能含有的厚壁微生物，例如真菌、金黄色葡萄球菌(G+)，进行细胞壁裂解；同时加入RNA保护剂RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇(DTT)对病毒RNA进行保护，在确保厚壁微生物可以有效裂解的同时也可以保护病毒RNA不受影响，充分释放并保护待测样品中全部微生物基因组信息。因此，本申请的方法，与直接采用微生物RNA检测流程检测待测样品相比，能够获得更完整的DNA信息，从而获得待测样品更完整的微生物基因组核酸信息。采用本申请的同时检测多种微生物基因组的方法，只需要一份样品进行一次检测，就可以同时获得DNA微生物和RNA微生物的基因组核酸信息，与分别进行微生物DNA检测流程和微生物RNA检测流程的方案相比，本申请的方法大大降低了检测成本和工作量，同时减少了样品用量，使得样品量较少的一些特殊样品或珍贵样品也能够满足检测需求。此外，本申请的一种实现方式中，具体使用MGISEQ测序平台，也可以有效缩短测序时长，并降低测序成本。

本申请的一种实现方式中，细胞壁裂解处理的条件为25℃-35℃温浴10min-60min。

需要说明的是，本申请的关键在于，预先对待测样品进行细胞壁裂解处理，使得厚壁微生物的细胞壁裂解；因此，原则上细胞壁裂解处理的条件即真菌细胞壁溶解酶的活性温度；当然，在具体选择细胞壁裂解处理条件时，同时需要考虑RNA酶抑制剂和DTT的作用温度，使得RNA能够得到更好的保护；从而获得更完整的RNA微生物基因组核酸信息和DNA微生物基因组核酸信息。

还需要说明的是，一般来说，真菌细胞壁溶解酶的酶解温度为25-35℃，酶解时间为1-2小时；但是，考虑到尽量减小RNA的破坏和损失，本申请优选的实现方式中细胞壁裂解处理条件为30℃温浴30min。

本申请的一种实现方式中，物理研磨采用的是玻璃珠研磨法，玻璃珠研磨完成后，离心，取上清液用于核酸提取。

本申请的一种实现方式中，玻璃珠研磨完成后的离心条件为8000rpm-10000rpm离心30sec-1min。

本申请的一种实现方式中，核酸提取采用的是RNA和DNA共提取试剂盒。

本申请的另一方面公开了一种用于同时检测多种微生物基因组的溶液，该溶液的活性成份包括真菌细胞壁溶解酶、RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇。

需要说明的是，本申请的溶液实际上就是本申请同时检测多种微生物基因组的方法中，微生物细胞裂解处理采用的试剂组装而成；采用申请的溶液对待测样品进行预处理，然后再进行核酸提取，可以在有效裂解厚壁微生物的同时保护病毒RNA不受影响，充分释放并保护待测样品中全部微生物的基因组信息；从而获得待测样品更完整的包括RNA微生物基因组和DNA微生物基因组在内的微生物基因组核酸信息。

本申请的一种实现方式中，溶液中真菌细胞壁溶解酶的含量为0.1-2.5U/μL，RNA酶抑制剂的含量为0.5-10U/μL，二硫苏糖醇的浓度为0.002-0.05mol/L。

可以理解，本申请溶液的关键在于采用真菌细胞壁溶解酶对厚壁微生物的细胞壁进行裂解，同时采用RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇对RNA进行保护；至于各组分的用量可以参考各组分常规的工作液浓度或用量，或者根据需要处理的待测样品而定。

本申请的再一方面公开了一种用于同时检测多种微生物基因组的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的溶液，或者含有用于配制本申请的溶液的真菌细胞壁溶解酶、RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇。

需要说明的是，采用本申请的试剂盒，其中包含的本申请的溶液对待测样品进行预处理，可以在有效裂解厚壁微生物的同时保护病毒RNA不受影响，充分释放并保护待测样品中全部微生物的基因组信息；从而获得待测样品更完整的包括RNA微生物基因组和DNA微生物基因组在内的微生物基因组核酸信息。

本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒中还含有玻璃珠。

优选的，试剂盒中的玻璃珠的粒径为0.5mm。

需要说明的是，本申请同时检测多种微生物基因组的方法中，微生物细胞裂解处理除了包含细胞壁裂解处理以外，还包含物理研磨；因此，为了使用方便，本申请的试剂盒中还可以包含用于物理研磨的玻璃珠。当然，玻璃珠也可以自行购买，在此不作具体限定。

本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒中还含有核酸提取试剂、逆转录试剂、文库构建试剂和测序试剂中的至少一种。

需要说明的是，本申请的试剂盒主要是通过本申请的方法对待测样品进行多种微生物基因组的同时检测；因此，原则上，本申请同时检测多种微生物基因组的方法中所有采用的试剂都可以整合到本申请的试剂盒中。但是，考虑到试剂盒自身的容量，可以选择其中部分重要的试剂组成本申请的试剂盒，例如本申请的溶液；其它试剂可以选择性的根据使用需求或产品设计组装到本申请的试剂盒中或者自行购买获得，在此不作具体限定。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请同时检测多种微生物基因组的方法，实现了一份样品仅通过一个流程即可全面检测样品中包括RNA微生物和DNA微生物在内的微生物基因组核酸信息；不仅降低了样品中微生物基因组检测的成本和工作量，提高了检测效率；而且减少了样品用量，使得样品量较少的一些特殊样品或珍贵样品也能够更完整的获得其微生物基因组核酸信息。

附图说明

图1是本申请实施例中同时检测多种微生物基因组的方法的流程框图；

图2是本申请实施例中构建的MGISEQ平台测序文库的Agilent 2100Bioanalyzer检测结果；

图3是本申请实施例中三种流程各微生物物种检出的reads统计结果图。

具体实施方式

目前对待测样品中含有的微生物基因组进行高通量检测的方式主要是基于高通量测序的微生物DNA检测流程和微生物RNA检测流程。其中，微生物RNA检测流程虽然也能够获得部分DNA信息；但是，毕竟其是以获取RNA信息为主，获得的DNA信息并不完整，会有很多漏检。因此，为了获得待测样品更全面的微生物基因组信息，需要对待测样品分别进行微生物DNA检测流程和微生物RNA检测流程，即需要将待测样品分出至少两份分别进行检测，需要同时操作两个流程，会产生双份的人工成本和物料成本。然而，对于一些特殊样品或珍贵样品，由于样品采样或剩余量较少无法满足同时操作两个流程。

本申请研究显示，微生物RNA检测流程之所以能够获得部分DNA信息，是因为在RNA提取过程中会保留部分DNA；而之所以获得的DNA信息不完整或漏检较多，主要是因为RNA本身易降解因此RNA检测流程不含有较强烈的微生物裂解处理，这使得对于细胞壁较厚的微生物(如G+、真菌)往往会导致漏检。

基于以上研究和认识，本申请创造性的提出，在进行微生物RNA检测流程之前，预先对准备进行核酸提取的待测样品进行微生物细胞裂解处理；即采用真菌细胞壁溶解酶对待测样品进行细胞壁裂解处理，同时，在细胞壁裂解处理的溶液中添加RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇；细胞壁裂解处理完成后，进一步进行物理研磨；然后再进行后续的核酸提取以及微生物RNA检测流程。

通过以上方案，不仅能够有效裂解厚壁微生物的细胞壁，而且对RNA具有保护作用，避免病毒RNA受影响，从而充分释放并保护待测样品中全部微生物基因组信息。与直接采用RNA检测流程检测样品相比，大大提高了厚壁微生物的检出率，即弥补了RNA检测流程由于缺少微生物裂解流程导致的厚壁微生物漏检(如真菌、G+)情况。与一份样品同时进行DNA检测流程和RNA检测流程的方法相比，大大降低了检测成本和工作量，同时减少了样品用量，使得样品量较少的一些特殊样品或珍贵样品也能够满足检测需求。

本申请的一种实现方式中，同时检测多种微生物基因组的方法，如图1所示，具体包括酶裂解01、研磨裂解02、核酸提取03、逆转录04、MGISEQ平台文库构建05、MGISEQ平台文库测序06和数据分析07。本申请主要是通过高效微生物裂解技术达到充分释放并保护待测样品中全部微生物基因组核酸的效果。其中，MGISEQ测序平台可提供多种测序通量、多种测序读长类型的个性化测序方案，测序周期可缩短至4-5h，可满足快速检测的需求，同时测序成本也显著低于其他高通量测序平台。因此，MGISEQ测序平台是一个优质的选择，图1示出的是基于MGISEQ测序平台的微生物基因组RNA检测流程示意图；然而，可以理解，本申请的方法也可以在其它测序平台上实现。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。以下实施例中，除非特别说明，所有试剂、材料和设备都可以通过市场购买获得。

实施例

一、主要材料

本例采用的主要试剂及其详细信息如表1所示。

表1主要试剂信息

二、试验方法

本例采用含有已知的多种RNA微生物和DNA微生物的模拟样本进行试验，分别采用常规的微生物DNA检测流程和常规的微生物RNA检测流程作为对比。

模拟样本配制：为了测试检测流程对微生物检测的全面性，模拟样本配制时分别添加了肺炎克雷伯杆菌(G-)、金黄色葡萄球菌(G+)、白色念珠菌(酵母型真菌)、巴西曲霉(霉菌真菌)、巨细胞病毒(DNA病毒)、丙型肝炎病毒(RNA病毒)、柯萨奇病毒A2型(RNA病毒)到生理盐水中，作为模拟样本。

本例采用的常规的微生物DNA检测流程如下：

1.酶裂解：取配制好的模拟样本450μL加入1.5mL的EP管中，加入10U/μL的Lyticase溶壁酶5μL，震荡混匀，短暂离心，30℃温浴30min。

2.研磨裂解：将步骤1样本转移到加有0.5mm玻璃珠的2.0mL螺纹管中，用fastprep均质破碎仪按说明书研磨；然后8000rpm离心1min，取上清转移到新的1.5mL EP管中；

3.核酸提取：使用微量样品基因组DNA提取试剂盒按照说明书进行核酸提取。

4.MGISEQ平台文库构建：按照MGISEQ平台文库构建说明书进行文库构建。

5.MGISEQ平台测序：按照MGISEQ平台测序说明书进行测序。

本例采用的常规的微生物RNA检测流程如下：

1.核酸提取：使用QIAamp Viral RNAMini Kit试剂盒按照说明书对450μL的模拟样本进行核酸提取。

2.逆转录：按照Super Script II Reverse Transcriptase说明书进行逆转录及二链合成。

3.MGISEQ平台文库构建：按照MGISEQ平台文库构建说明书进行文库构建。

4.MGISEQ平台测序：按照MGISEQ平台测序说明书进行测序。

本例同时检测多种微生物基因组的方法，主要是在现有的微生物RNA检测流程基础上进行改进，即在进行微生物RNA检测流程之前，预先对准备进行核酸提取的待测样品进行微生物细胞裂解处理；该微生物细胞裂解处理包括，采用真菌细胞壁溶解酶对待测样品进行细胞壁裂解处理，同时，在细胞壁裂解处理的溶液中添加RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇；细胞壁裂解处理完成后，进一步进行物理研磨；然后再进行后续的核酸提取以及微生物RNA检测流程。本例采用MGISEQ平台进行测序，检测多种微生物基因组的方法如图1所示，包括酶裂解01、研磨裂解02、核酸提取03、逆转录04、MGISEQ平台文库构建05、MGISEQ平台文库测序06和数据分析07；本例检测多种微生物基因组的方法具体如下：

1.酶裂解：取配制好的模拟样本450μL加入1.5mL的EP管中，加入10U/μL的Lyticase溶壁酶5μL，震荡混匀，短暂离心；再加入0.1M的Dithiothreitol(DTT)10μL、40U/μL的RNase Inhibitor 5μL，震荡混匀，短暂离心，30℃温浴30min。

2.研磨裂解：将步骤1样本转移到加有0.5mm玻璃珠的2.0mL螺纹管中，fastprep均质破碎仪按说明书研磨；然后8000rpm离心1min，取上清转移到新的1.5mL EP管中；

3.核酸提取：使用Magnetic Viral DNA/RNAKit试剂盒按照说明书进行核酸提取。

需要说明的是，核酸提取步骤中，对步骤“2.研磨裂解”获得的上清液按照说明书的常规步骤进行核酸提取，包括采用试剂盒中的裂解液对样品进行再次裂解；可以理解，常规的微生物DNA检测流程和常规的微生物RNA检测流程是直接采用试剂盒对模拟样本进行相应的DNA或RNA提取；而本例同时检测多种微生物基因组的方法，相对而言增加了“1.酶裂解”和“2.研磨裂解”。

4.逆转录：按照Super Script II Reverse Transcriptase说明书进行逆转录及二链合成。

5.MGISEQ平台文库构建：按照MGISEQ平台文库构建说明书进行文库构建。

6.检测文库质量：采用Agilent 2100Bioanalyzer检测仪，操作流程按照Agilent2100Bioanalyzer说明书进行。

7.MGISEQ平台测序：按照MGISEQ平台测序说明书进行测序。

8.数据分析：下机数据分别与添加微生物的基因组比对，将仅能比上靶物种的读长(reads)进行计数，统计三种流程各微生物物种检出的reads情况。

三、结果及分析

1.Agilent 2100检测结果

本例对构建的MGISEQ平台测序文库进行Agilent 2100Bioanalyzer检测，结果如图2所示。图2的结果显示，本例构建的MGISEQ平台测序文库质量检测合格，能够满足后续测序使用需求。

2.数据分析结果

统计本例改进的同时检测多种微生物基因组的方法，以及常规的微生物DNA检测流程和常规的微生物RNA检测流程，三种检测流程各微生物物种检出的reads情况，结果如图3所示。图3的结果显示，本例方法对于所添加的G-、G+、真菌、DNA病毒、RNA病毒检出效果与单独的DNA检测流程和RNA检测流程的合并结果基本一致，而单独RNA检测流程则会对白色念珠菌等真菌产生漏检。

本例改进的同时检测多种微生物基因组的方法，本质上也是微生物RNA检测流程，但是，相比常规的微生物RNA检测流程，本例增加了“1.酶裂解”和“2.研磨裂解”两个步骤，使得本例改进的微生物RNA检测流程能够获得更多更完整的DNA信息。检测结果显示，本例改进的微生物RNA检测流程，其检出的DNA信息和RNA信息，与常规的微生物DNA检测流程和常规的微生物RNA检测流程，两个常规检测流程检测结果合并形成的微生物基因组信息，基本一致。也就是说，本例改进的微生物RNA检测流程，其检测能力和效果相当于常规的微生物DNA检测流程和常规的微生物RNA检测流程之和。

以上试验结果显示，本例的同时检测多种微生物基因组的方法，仅通过一个流程即可全面检测样品中包括RNA微生物和DNA微生物在内的微生物基因组核酸信息，这使得样品量较少的一些特殊样品或珍贵样品也能够更完整的获得其微生物基因组核酸信息。

在以上试验的基础上，可以将本例使用的真菌细胞壁溶解酶、RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇按照其用量配比组成一种新的用于同时检测多种微生物基因组的溶液，进而组装成用于同时检测多种微生物基因组的试剂盒，以方便使用。其中，试剂盒中还可以包含其它需要使用的试剂，例如玻璃珠、核酸提取试剂、逆转录试剂、文库构建试剂和测序试剂等。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种同时检测多种微生物基因组的方法，其特征在于：包括采用微生物RNA检测流程对待测样品进行高通量测序；并且，在进行微生物RNA检测流程之前，预先对准备进行核酸提取的待测样品进行微生物细胞裂解处理；

所述微生物细胞裂解处理包括，采用真菌细胞壁溶解酶对待测样品进行细胞壁裂解处理，同时，在细胞壁裂解处理的溶液中添加RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇；细胞壁裂解处理完成后，进一步进行物理研磨；然后再进行后续的核酸提取以及微生物RNA检测流程。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞壁裂解处理的条件为25℃-35℃温浴10min-60min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述物理研磨采用的是玻璃珠研磨法，玻璃珠研磨完成后，离心，取上清液用于核酸提取。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述离心的条件为8000rpm-10000rpm离心30sec-1min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述核酸提取采用的是RNA和DNA共提取试剂盒。

6.一种用于同时检测多种微生物基因组的溶液，其特征在于：所述溶液的活性成份包括真菌细胞壁溶解酶、RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇。

7.根据权利要求6所述的溶液，其特征在于：所述溶液中，真菌细胞壁溶解酶的含量为0.1-2.5U/μL，RNA酶抑制剂的含量为0.5-10U/μL，二硫苏糖醇的浓度为0.002-0.05mol/L。

8.一种用于同时检测多种微生物基因组的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求6或7所述的溶液，或者含有用于配制权利要求6或7所述的溶液的真菌细胞壁溶解酶、RNA酶抑制剂和二硫苏糖醇。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有玻璃珠；优选的，所述玻璃珠的粒径为0.5mm。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有核酸提取试剂、逆转录试剂、文库构建试剂和测序试剂中的至少一种。

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