CN107201360A - 一种用于病毒基因组核酸快速提取试剂法 - Google Patents

一种用于病毒基因组核酸快速提取试剂法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种病毒基因组核酸快速提取试剂。主要用于从血清、血浆、淋巴液、无细胞体液、细胞培养上清液、尿液或各种病毒基因组核酸快速提取的试剂，该提取试剂体系包括裂解液和洗涤液，其中裂解液成分含有异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌氨酸钠、TritonX‑100、EDTA‑2Na；洗涤液成分含有氯化锂和无水乙醇。该提取试剂应用广泛，本发明试剂体系配合纳米级磁珠，可最大限度的去除样本的蛋白质及其他抑制性杂质污染，从而提取的DNA或RNA片段完整、产量高、纯度高、稳定性可靠、成本低，极大的方便了临床诊断的工作。

Description

一种用于病毒基因组核酸快速提取试剂法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及生物样品中病毒基因组核酸提取。
背景技术
在临床病毒核酸定量检测中，病毒基因组核酸提取是首先进行的第一步。目前，国内PCR试剂生产厂家很多，对于核酸提取方法各异，在检测灵敏度、特异性、定量准确性及检测范围等方面存在一定的差异。因此，导致不同医院之间的检测结果难以进行比较，其中核酸提取量多少与纯度直接影响检测结果的准确性，选择良好的提取方法和试剂是提高检测灵敏度的有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种病毒基因组核酸快速提取试剂，该体系试剂能快速从血清、血浆、淋巴液、无细胞体液、细胞培养上清液、尿液或各种病毒基因组核酸快速释放提取，获得的核酸适用于荧光PCR等下游检测，具有操作简便、使用安全、成本低廉的优点，适合在临床基因检测中推广应用。
本发明提供一种核酸基因组快速提取试剂，包括裂解液和洗涤液，其中裂解液成分含有异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌氨酸钠、TritonX-100、EDTA-2Na；洗涤液成分含有氯化锂和无水乙醇。
其中裂解液的配制方法为：称取47.2g异硫氰酸胍、0.6gTris、1.5g柠檬酸钠，0.83g十二烷基肌氨酸钠、用去离子水溶解后，调整PH值至6.0-6.5，加入8ml TritonX-100、2ml 0.5M EDTA-2Na混匀后，用去离子水定容至100ml。
洗涤液配制方法为：氯化锂12.6g、无水乙醇80ml，混匀后，用去离子水定容至100ml。
本发明的核酸基因组快速提取试剂可在室温保存。
本发明的核酸基因组快速提取试剂使用方法为：取上述配制的病毒裂解液，按照缓冲液和样品的比例3∶1混合，用移液器反复吹打5-10次混匀，室温放置5-10分钟后，取混合物过吸附柱离心或者硅基磁珠吸附，通过洗涤液漂洗后直接洗脱病毒核酸基因组，获得的核酸可直接作为模板用于荧光PCR下游检测。
本发明的核酸基因组快速提取试剂具有操作简便、使用安全的特点，优于传统提取方法，无需用到较多有挥发性的化学试剂、也无需蛋白酶K消化。该体系试剂能快速破坏病毒颗粒外壳蛋白结构，释放核酸基因组，获得的核酸可适用于各种常规操作，包括RT-PCR、荧光定量PCR等各种下游实验。整个过程安全、便捷，提取的病毒DNA/RNA得率高、纯度高、质量稳定可靠，也可适合高通量工作站的自动化提取。
具体实施方式
下面结合具体实施例，并结合阳性样品进行不同方法的提取，进一步阐述本发明。
(1)HBV阳性血清核酸提取
选取5例HBV阳性血清样品，采用本发明内容中的提取试剂分别用两种方法进行提取。
吸附离心柱法提取步骤：
(a)吸取300ul的病毒裂解液和100ul样品混合，振荡混匀、室温放置5分钟。
(b)吸取混合物至离心柱，12000rpm离心1分钟，弃废液。
(c)吸取500ul病毒洗涤液至离心柱，离心3分钟，弃废液。
(d)取出CT2号柱(带盖)，放入一个无RNase的离心管中，在吸附膜的中间部位加30μl无DNase和RNase的水，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟。
(e)洗脱的DNA/RNA备用或者储存-70℃保存。
硅基磁珠法提取步骤：
(a)加入磁珠裂解样品 吸取300ul的病毒裂解液和100ul样品，分别加入有磁珠的离心管中，盖紧上盖，颠倒混匀，裂解5分钟，期间重复颠倒离心管几次，使其完全裂解。
(b)磁分离把EP管放到磁架上，静置半分钟，磁珠自动被吸附在管壁上，吸弃上清。(磁分离操作要在磁架上完成，以避免吸掉磁珠)
(c)洗涤从磁架上取下EP管，加人病毒洗涤液0.5mL，吸10S使磁珠与洗涤液混合均匀，磁分离，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖放置3min，使磁珠干燥，管内及管盖上残液要抽净。注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱核酸。
(d)洗脱加人无DNase和RNase的水30ul，抽吸10S混匀，盖紧上盖，室温放置，取出EP管后立即放到磁架上10s，吸取上清至新的EP管中。
(e)将提取好的核酸溶液适当条件保存。
本提取试剂方法同碱裂解法提取荧光PCR检测结果，荧光定量PCR仪(BIO-RADCXF96)
(2)HIV阳性血清核酸提取
本提取试剂方法同酚氯仿抽提方法提取荧光PCR检测结果，荧光定量PCR仪(BIO-RAD CXF96)

Claims (2)

1.本发明为一种用于从血清、血浆、淋巴液、无细胞体液、细胞培养上清液、尿液或各种病毒基因组核酸快速提取的试剂，该提取试剂体系主要由病毒裂解液、病毒洗涤液及不含DNase、RNase的水组成。该提取试剂含有盐酸胍、SDS、十二烷基肌氨酸钠、tween20、异丙醇，应用广泛。本发明试剂体系配合纳米级磁珠或吸附离心柱，可最大限度的去除样本的蛋白质及其他抑制性杂质污染，从而提取的DNA或RNA片段完整、产量高、纯度高、稳定性可靠、成本低。
2.如权利要求1所述，其特征在于，使用时取该核酸快速提取试剂病毒裂解液，按照样品和缓冲液1∶3的比例均匀混合并反复吹打5-10次混匀，室温放置5-10分钟后，取混合物过吸附柱离心或者硅基磁珠吸附，通过洗涤液漂洗后直接洗脱病毒核酸基因组。并进行下一步实验。
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