CN107201360A - 一种用于病毒基因组核酸快速提取试剂法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种病毒基因组核酸快速提取试剂。主要用于从血清、血浆、淋巴液、无细胞体液、细胞培养上清液、尿液或各种病毒基因组核酸快速提取的试剂,该提取试剂体系包括裂解液和洗涤液,其中裂解液成分含有异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌氨酸钠、TritonX‑100、EDTA‑2Na;洗涤液成分含有氯化锂和无水乙醇。该提取试剂应用广泛,本发明试剂体系配合纳米级磁珠,可最大限度的去除样本的蛋白质及其他抑制性杂质污染,从而提取的DNA或RNA片段完整、产量高、纯度高、稳定性可靠、成本低,极大的方便了临床诊断的工作。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域,具体涉及生物样品中病毒基因组核酸提取。
背景技术
在临床病毒核酸定量检测中,病毒基因组核酸提取是首先进行的第一步。目前,国内PCR试剂生产厂家很多,对于核酸提取方法各异,在检测灵敏度、特异性、定量准确性及检测范围等方面存在一定的差异。因此,导致不同医院之间的检测结果难以进行比较,其中核酸提取量多少与纯度直接影响检测结果的准确性,选择良好的提取方法和试剂是提高检测灵敏度的有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种病毒基因组核酸快速提取试剂,该体系试剂能快速从血清、血浆、淋巴液、无细胞体液、细胞培养上清液、尿液或各种病毒基因组核酸快速释放提取,获得的核酸适用于荧光PCR等下游检测,具有操作简便、使用安全、成本低廉的优点,适合在临床基因检测中推广应用。
本发明提供一种核酸基因组快速提取试剂,包括裂解液和洗涤液,其中裂解液成分含有异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌氨酸钠、TritonX-100、EDTA-2Na;洗涤液成分含有氯化锂和无水乙醇。
其中裂解液的配制方法为:称取47.2g异硫氰酸胍、0.6gTris、1.5g柠檬酸钠,0.83g十二烷基肌氨酸钠、用去离子水溶解后,调整PH值至6.0-6.5,加入8ml TritonX-100、2ml 0.5M EDTA-2Na混匀后,用去离子水定容至100ml。
洗涤液配制方法为:氯化锂12.6g、无水乙醇80ml,混匀后,用去离子水定容至100ml。
本发明的核酸基因组快速提取试剂可在室温保存。
本发明的核酸基因组快速提取试剂使用方法为:取上述配制的病毒裂解液,按照缓冲液和样品的比例3∶1混合,用移液器反复吹打5-10次混匀,室温放置5-10分钟后,取混合物过吸附柱离心或者硅基磁珠吸附,通过洗涤液漂洗后直接洗脱病毒核酸基因组,获得的核酸可直接作为模板用于荧光PCR下游检测。
本发明的核酸基因组快速提取试剂具有操作简便、使用安全的特点,优于传统提取方法,无需用到较多有挥发性的化学试剂、也无需蛋白酶K消化。该体系试剂能快速破坏病毒颗粒外壳蛋白结构,释放核酸基因组,获得的核酸可适用于各种常规操作,包括RT-PCR、荧光定量PCR等各种下游实验。整个过程安全、便捷,提取的病毒DNA/RNA得率高、纯度高、质量稳定可靠,也可适合高通量工作站的自动化提取。
具体实施方式
下面结合具体实施例,并结合阳性样品进行不同方法的提取,进一步阐述本发明。
(1)HBV阳性血清核酸提取
选取5例HBV阳性血清样品,采用本发明内容中的提取试剂分别用两种方法进行提取。
吸附离心柱法提取步骤:
(a)吸取300ul的病毒裂解液和100ul样品混合,振荡混匀、室温放置5分钟。
(b)吸取混合物至离心柱,12000rpm离心1分钟,弃废液。
(c)吸取500ul病毒洗涤液至离心柱,离心3分钟,弃废液。
(d)取出CT2号柱(带盖),放入一个无RNase的离心管中,在吸附膜的中间部位加30μl无DNase和RNase的水,室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟。
(e)洗脱的DNA/RNA备用或者储存-70℃保存。
硅基磁珠法提取步骤:
(a)加入磁珠裂解样品 吸取300ul的病毒裂解液和100ul样品,分别加入有磁珠的离心管中,盖紧上盖,颠倒混匀,裂解5分钟,期间重复颠倒离心管几次,使其完全裂解。
(b)磁分离把EP管放到磁架上,静置半分钟,磁珠自动被吸附在管壁上,吸弃上清。(磁分离操作要在磁架上完成,以避免吸掉磁珠)
(c)洗涤从磁架上取下EP管,加人病毒洗涤液0.5mL,吸10S使磁珠与洗涤液混合均匀,磁分离,吸弃上清。重复洗涤一次,开盖放置3min,使磁珠干燥,管内及管盖上残液要抽净。注意:乙醇残留会抑制后续的酶反应,所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间,以免难以洗脱核酸。
(d)洗脱加人无DNase和RNase的水30ul,抽吸10S混匀,盖紧上盖,室温放置,取出EP管后立即放到磁架上10s,吸取上清至新的EP管中。
(e)将提取好的核酸溶液适当条件保存。
本提取试剂方法同碱裂解法提取荧光PCR检测结果,荧光定量PCR仪(BIO-RADCXF96)
(2)HIV阳性血清核酸提取
本提取试剂方法同酚氯仿抽提方法提取荧光PCR检测结果,荧光定量PCR仪(BIO-RAD CXF96)
Claims (2)
1.本发明为一种用于从血清、血浆、淋巴液、无细胞体液、细胞培养上清液、尿液或各种病毒基因组核酸快速提取的试剂,该提取试剂体系主要由病毒裂解液、病毒洗涤液及不含DNase、RNase的水组成。该提取试剂含有盐酸胍、SDS、十二烷基肌氨酸钠、tween20、异丙醇,应用广泛。本发明试剂体系配合纳米级磁珠或吸附离心柱,可最大限度的去除样本的蛋白质及其他抑制性杂质污染,从而提取的DNA或RNA片段完整、产量高、纯度高、稳定性可靠、成本低。
2.如权利要求1所述,其特征在于,使用时取该核酸快速提取试剂病毒裂解液,按照样品和缓冲液1∶3的比例均匀混合并反复吹打5-10次混匀,室温放置5-10分钟后,取混合物过吸附柱离心或者硅基磁珠吸附,通过洗涤液漂洗后直接洗脱病毒核酸基因组。并进行下一步实验。
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