CN112626067A - 一种病毒rna快速提取的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速从各种来源的样本中提取病毒RNA的方法。由于病毒RNA样本中含量少，不稳定，对病毒RNA分子诊断的准确性造成干扰。本发明中的裂解液能够快速裂解样本并保持病毒RNA的稳定，提取效率高，可以稳定提取样本中及其微量RNA，并且操作简便快速，磁珠的应用可大大提高实验通量，可用于病毒RNA提取的自动化应用。

Description

一种病毒RNA快速提取的方法和试剂盒
技术领域
本发明属于RNA提取技术领域，具体涉及一种病毒RNA快速提取试剂盒及提取方法。
背景技术
RNA病毒作为感染性疾病重要的病原之一，其检测对于临床治疗有重要的意义。在临床上病毒核酸检测可作为病毒感染重要的参考依据，而病毒的核酸提取是首要工作。然而由于RNase酶广泛存在，在提取的过程中，RNA病毒核酸极易降解，导致其在检测会出现假阴性的现象。
目前针对RNA病毒的核酸提取，需要加入蛋白酶K辅助裂解，蛋白酶K长期保存需要低温，常温或者高于常温条件下蛋白酶K存在不稳定，并且需要多次漂洗，操作步骤复杂，时间过长，无法进行病毒样本的快速提取和现场检测。
硅基质膜吸附法的缺点在于需要反复离心，倾倒废液；操作繁琐和耗时长，在处理多个样本的时候容易交叉污染；由于样本是单管独立处理，难以形成自动化操作，满足不了临床高通量检测的需求。
而除此之外，TRIzol法中使用的重蒸酚和氯仿是有机溶剂，具有毒性；而普通的水煮法无法直接用于提取RNA，主要是因为样品中存在内源性的RNA酶，而这些RNA酶会将RNA降解。因此，在病毒RNA的检测领域尤其是大规模流行性RNA病毒的检测和筛查，需要一种快速简便易操作，效果稳定，病毒RNA提取效率高的方法和试剂盒。
由于可以用于自动化仪器，磁珠法核酸提取方法在病原体临床检测上应用越来越广泛，主要原理是基于磁珠在高盐和异丙醇混合Buffer中对病毒RNA进行特异性的吸附，然后经过RNA漂洗液Buffer分离和漂洗蛋白质和多糖等杂质后，在低盐Buffer中被洗脱下来，从而分离到高纯度病毒RNA。
由于磁珠法在自动化检测上的巨大优势，目前临床上大规模病毒RNA临床样本检测以磁珠法为主。但是目前的磁珠法试剂盒目前市面上的病毒核酸提取试剂盒操作步骤较为复杂，需要30分钟以上才能完成提取操作；并且需要加入蛋白酶K辅助裂解，蛋白酶K长期保存需要低温，常温或者高于常温条件下蛋白酶K存在不稳定，实际应用中由于灵敏度低等原因容易造成漏检，或者由于提取核酸不完全造成定量偏差，不能很好地反映样本的真实浓度。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的不足之处开展的实验研究，目的在提供一种快速简易、高可靠性的适合自动化操作的病毒RNA提取方法，推进人的磁珠法病毒RNA快速提取和检测在临床上的应用和推广。
为了实现上述发明目的，一种10分钟完成病毒RNA快速提取的方法和试剂盒，其包括如下步骤：
(1) 转移200µL病毒RNA样本拭子保存液等液体样品至 1.5ml 离心管，振荡混匀；
(2) 向样品中加入250µL RNA病毒样本裂解结合液， 10µL carrier RNA， 10 µL的市售磁珠溶液和125µL 异丙醇；
(3) 颠倒混匀15次，震荡30s；
(4) 离心管置于磁力架上；
(5) 磁珠完全吸附后，弃去上清；
(6) 将(5)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去；
(7) 将EP管或者96孔板取下磁力架，加入500µL RNA漂洗液，涡旋振荡混匀；
(8) 将(7)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管或者96孔板取下磁力架，室温放置2min；
(9) 将(8)中的溶液转移到1.5-2mL EP管或者96孔板，置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，磁力架上放置5min；将EP管或者96孔板取下磁力架，加入50μL RNA洗脱液，静置2min，涡旋振荡混匀；
(10) 将(9)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪吸取全部上清，磁珠弃去。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1. 本发明所述的病毒RNA快速提取方法操作简单，不但可以手动操作快速完成，还适合于核酸纯化自动化工作站；
2. 本发明所述的病毒RNA方法提取速度快，可在10分钟之内完成所有操作，完全可以满足后续分子检测的需求；
3. 本发明所述的病毒RNA提取方法适用性强，无需蛋白酶K辅助裂解，可靠性高，适合临床检测对质量稳定性的要求。
附图说明
图1是用本试剂盒提取的16个拭子样本的病毒RNA；
图2采用荧光PCR对本试剂盒及方法提取的病毒RNA进行荧光扩增，3个靶向区域均正常扩增。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明；
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1
(1) 转移200µL病毒RNA样本拭子保存液等液体样品至 1.5ml 离心管，振荡混匀；
(2) 向样品中加入250µL RNA病毒样本裂解结合液， 10µL carrier RNA， 10 µL的市售磁珠溶液和125µL 异丙醇；
(3) 颠倒混匀15次，震荡30s；
(4) 离心管置于磁力架上；
(5) 磁珠完全吸附后，弃去上清；
(6) 将(5)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去；
(7) 将EP管或者96孔板取下磁力架，加入500µL RNA漂洗液，涡旋振荡混匀；
(8) 将(7)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管或者96孔板取下磁力架，室温放置2min。
实施例2
上机操作A：96通道核酸提取仪
(1) 取预封装96深孔板，使用前小心撕开铝箔封口膜，避免孔板震荡，防止试剂溅出。在“板位2”加入200~250µL样本备用；
(2) 上机操作，基本参数见下表1：
Figure 527534DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例3
上机操作B：16通道核酸提取仪
(1) 将解混合液中异丙醇，蛋白酶K，磁性微珠，CarrierRNA等裂解病毒结合核酸的成分，按照250µL RNA病毒样本裂解结合液， 10µL carrier RNA， 10 µL的磁珠溶液和125µL 异丙醇的比例混合，加入96孔板中的第1列和第7列孔位；
(2) 将RNA漂洗液加入96孔板中的第2，3列和第8，9列孔位；
(3) 加入200-250µL假病毒样本，上机操作，仪器参数设置如下表2：
Figure 146734DEST_PATH_IMAGE004
(4) 采用荧光PCR对提取的病毒RNA进行荧光扩增，3个靶向区域均正常扩增，结果如图2显示，以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域中的普通技术人员来说，在不脱离本发明核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种病毒RNA快速高效提取试剂盒，其特征在于：由以下三种溶液组成：
(1) RNA病毒样本快速裂解结合液：为醋酸钠、吐温80、盐酸胍、NaCl和异丙醇的混合溶液，混合溶液中醋酸钠的浓度为50-500mM之间，优选浓度为200 mM；吐温80的体积比为0.1-1%之间，优选质量浓度为0.2-0.5%之间； NaCl的浓度为20-600mM之间，优选浓度为50-200mM之间；盐酸胍的浓度为2-8M之间，优选浓度为3-4M之间；异丙醇的浓度为20-80 vt %之间，优选体积比为30-50 vt %之间；
(2)RNA漂洗液：为NaCl和乙醇的混合物，其中，乙醇的浓度为65-85 vt %之间，优选浓度为75-80 vt %之间；NaCl的浓度为20-200mM之间，优选浓度为50-100mM之间；
(3) RNA洗脱液：5mM的Tris-HCl缓冲液，pH值8.0-8.5。
2.一种通过权利要求1所述的病毒RNA提取的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1) 转移150 -300µL抗凝血液/血浆/淋巴液/唾液/肺泡灌洗液/拭子保存液等液体样品至 1.5ml 离心管，振荡混匀；
(2) 向样品中加入250µL RNA病毒样本裂解结合液， 10µL carrier RNA， 10 µL的市售磁珠溶液和125µL 异丙醇；
(3) 颠倒混匀15次，震荡30s，90度温育2min；
(4) 离心管置于磁力架上，磁珠完全吸附后，弃去上清；
(5) 将(4)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管或者96孔板取下磁力架，加入600µL RNA漂洗液，涡旋振荡混匀；
(6) 将(5)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置30s，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管或者96孔板取下磁力架，室温放置30s；
(7) 向(6)中的EP管或者96孔板加入70μL RNA洗脱液，静置1min，涡旋振荡混匀；
(8) 将(7)中的EP管或者96孔板置于磁力架上，放置30s，等磁珠全部吸附后，用移液枪吸取全部上清，磁珠弃去。
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