CN113215148B - 一种病毒基因组核酸快速提取试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于试剂盒技术领域，公开了一种病毒基因组核酸快速提取试剂盒及其使用方法，所述病毒基因组核酸快速提取试剂盒由溶液I、溶液II、的溶液III、Eluent溶液、带硅膜柱的制备管、2mL离心管、1.5mL离心管和使用说明书组成。本发明操作方法简单快速，重复性好，无需进行酚氯仿或Trizol抽提；可同时提取任何液体中的微量DNA/RNA；本试剂盒核酸提取的效率高，优于Trizol法，提取过程中核酸损失极少；提取得到的DNA/RNA纯度高，特别适用于后续的分子生物学实验。

Description

一种病毒基因组核酸快速提取试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于试剂盒技术领域，尤其涉及一种病毒基因组核酸快速提取试剂盒及其使用方法。

背景技术

目前，核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命必不可少的组成物质，广泛存在于动植物细胞、微生物体内，分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。目前，在分子生物学科的各个研究检测领域都离不开核酸的检测，核酸的提取纯化是分子生物学研究和临床检测的基础。

现有的核酸提取方法主要包括碱裂解法、酚氯仿抽提法、螯合树脂法、离心柱膜吸附法以及磁珠法等。但是，现有的核酸提取方法具有核酸质量不佳、操作步骤繁琐、耗时较长的缺陷。因此，亟需一种新的核酸提取方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的核酸提取方法具有核酸质量不佳、操作步骤繁琐、耗时较长、且所用试剂具有一定毒性的缺陷。

解决以上问题及缺陷的难度为：目前市场上常用的病毒基因组核酸提取试剂盒分别是针对DNA提取和RNA提取的，很少能同时提取DNA和RNA。经常用于提取病毒基因组核酸的方法能够满足试验要求，但碱裂解法、酚氯仿抽提法和异丙醇沉淀法等方法操作复杂，使用的试剂具有一定的毒性，对操作人员的健康危害大；磁珠法对DNA提取效果好，但价格昂贵，不适用于生产应用。

解决以上问题及缺陷的意义为：本发明联合采用多种核酸提取成分和技术，操作过程中未用到酚、氯仿以及Trizol，可提取微量的核酸，提取方法简单快速，提取过程不需要使用昂贵的设备和试剂，提取的核酸纯度高，特别适用于下游分子生物学研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种病毒基因组核酸快速提取试剂盒及其使用方法。

本发明是这样实现的，一种病毒基因组核酸快速提取试剂盒，包含5-15mL的溶液I、10-20mL的溶液II、25-30mL的溶液III、1.5-2mL的Eluent、多支制备管、多支2mL离心管、多支1.5mL离心管和使用说明书。

进一步，所述溶液I包括1-6M异硫氰酸胍，同时包括10-30mM柠檬酸三钠、或者5-25mM十二烷基肌氨酸钠、或者1-10mM二硫苏糖醇、或者0.1-1mM乙二胺四乙酸二钠、或者0.01-1mg/ml的糖原。

进一步，所述溶液II包括40-60％异丙醇和3moL乙酸钠，pH小于等于5。

进一步，所述溶液III包括60-75％乙醇和1-10mM的Tris-HCl。

进一步，所述Tris-HCl的pH为7.5。

进一步，所述Eluent包括1-10mM/L的Tris-HCl，或者同时包括0.1-1mM/L的EDTA。

进一步，所述Tris-HCl的pH为7-9。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的病毒基因组核酸快速提取试剂盒的病毒基因组核酸快速提取试剂盒的使用方法，所述病毒基因组核酸快速提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：

步骤一，取待抽提的含有核酸的液体50ul，置于0.6mL或1.5mL离心管中，加入200ul溶液I，上下反转颠倒充分混匀，室温放置5min；

步骤二，加入250ul溶液II，上下反转颠倒混合均匀；吸取混合液，转移到DNA制备管，12000×g离心1min，弃滤液；

步骤三，将制备管置回2ml离心管，加500μl溶液III，12000×g离心30s，弃滤液；

步骤四，将制备管置于2ml离心管中，12000×g离心1min；

步骤五，将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加20-30μl核酸溶解液或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA/RNA。

进一步，步骤二中，所述DNA制备管事先置于2ml离心管中。

进一步，步骤五中，在制备膜中央加20-30μl核酸溶解液或去离子水之前，将核酸溶解液或去离子水加热至65℃。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的病毒基因组核酸快速提取试剂盒，联合采用多种核酸提取成分和技术，并进行了最大程度的优化，毋需进行酚氯仿抽提，毋需使用Trizol，即可从人体或动物的各种鼻咽拭子溶液、腹水、脑脊液、分泌液、细胞培养液及其它液体中对微量的核酸(DNA/RNA)进行简单快速的提取，并有效去除各种PCR抑制物；提取的核酸可用于PCR/RT-PCR、荧光定量PCR、DNA/RNA杂交等各种下游分子生物学研究。

本发明操作方法简单快速(20min完成)，重复性好，不需要进行酚氯仿或Trizol抽提；可同时提取任何液体中的微量DNA/RNA；和其它试剂盒相比，本试剂盒核酸提取的效率非常高，优于Trizol法，提取过程中核酸的损失极少；提取得到的DNA/RNA纯度高，特别适用于后续的分子生物学实验。

对比的技术效果或者实验效果。包括：

图4是分别使用本发明试剂盒和Trizol法提取病毒核酸的PCR产物电泳结果示意图；

图4中：1：DL2000 DNA marker；2：EV71未感染细胞培养液，本发明试剂盒提取病毒RNA；3：EV71感染细胞培养液，本发明试剂盒提取病毒RNA；4：EV71未感染细胞培养液，传统方法提取病毒RNA；5：EV71感染细胞培养液，传统方法提取病毒RNA。

图5是分别使用本发明试剂盒和国内某品牌试剂盒提取病毒核酸，并将核酸浓度稀释100倍后的real-time PCR检测结果示意图；图5中：1、2、3：本发明试剂盒提取病毒核酸稀释100倍CT值(3个复孔)；4、5、6：国内某品牌试剂盒提取病毒核酸稀释100倍CT值(3个复孔)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的病毒基因组核酸快速提取试剂盒的使用方法流程图。

图2是本发明实施例提供的DNA病毒的PCR产物电泳结果示意图；

图中：M：100bp DNA marker；N：阴性对照；1：培养液1000倍稀释后提取核酸；2：100倍稀释后提取核酸；3：10倍稀释后提取核酸；4：培养液直接提取DNA(PCR产物：915bp)。

图3是本发明实施例提供的RNA病毒的PCR产物电泳结果示意图；

图中：M：DL10000 DNA marker；N：阴性对照；1：培养液100倍稀释后提取RNA；2：10倍稀释后提取RNA；3：培养液直接提取RNA(RT-PCR产物：1600bp)。

图4是本发明实施例提供的分别使用本发明试剂盒和Trizol法提取病毒核酸的PCR产物电泳结果示意图。

图5是本发明实施例提供的分别使用本发明试剂盒和国内某品牌试剂盒提取病毒核酸，并将核酸浓度稀释100倍后的real-time PCR检测结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种病毒基因组核酸快速提取试剂盒及其使用方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的病毒基因组核酸快速提取试剂盒包含5-15mL的溶液I、10-20mL的溶液II、25-30mL的溶液III、1-2mL的Eluent、多支制备管、多支2mL离心管、多支1.5mL离心管和使用说明书。

如图1所示，本发明实施例提供的病毒基因组核酸快速提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：

S101，取待抽提的含有核酸的液体50ul，置于0.6mL或1.5mL离心管中，加入200ul溶液I，上下反转颠倒充分混匀，室温放置5min；

S102，加入250ul溶液II，上下反转颠倒混合均匀；吸取混合液，转移到DNA制备管，12000×g离心1min，弃滤液；

S103，将制备管置回2ml离心管，加500μl溶液III，12000×g离心30s，弃滤液；

S104，将制备管置于2ml离心管中，12000×g离心1min；

S105，将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加20-30μl核酸溶解液或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA/RNA。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

本试剂盒联合采用多种核酸提取成分和技术，并进行了最大程度的优化，毋需进行酚氯仿抽提，毋需使用Trizol，即可从人体或动物的各种鼻咽拭子溶液、腹水、脑脊液、分泌液、细胞培养液及其它液体中对微量的核酸(DNA/RNA)进行简单快速的提取，并有效去除各种PCR抑制物；提取的核酸可用于PCR/RT-PCR、荧光定量PCR、DNA/RNA杂交等各种下游分子生物学研究。

病毒基因组核酸(DNA/RNA)快速提取试剂盒溶液I主要组成成分及含量见表1。

表1病毒基因组核酸(DNA/RNA)快速提取试剂盒溶液I主要组成成分及含量

试剂	含量
		异硫氰酸胍	4mol
柠檬酸三钠	25mmol
		二硫苏糖醇	20mmol
糖原	0.1％(m/v)

病毒基因组核酸(DNA/RNA)快速提取试剂盒溶液II主要组成成分及含量见表2。

表2病毒基因组核酸(DNA/RNA)快速提取试剂盒溶液II主要组成成分及含量

试剂	含量
		异丙醇	50％
乙酸钠	3mol

病毒基因组核酸(DNA/RNA)快速提取试剂盒溶液III主要组成成分及含量见表3。

表3病毒基因组核酸(DNA/RNA)快速提取试剂盒溶液III主要组成成分及含量

试剂	含量
		乙醇	70％
Tris-HCl(pH 7.5)	10mM

病毒基因组核酸(DNA/RNA)快速提取试剂盒Eluent主要组成成分及含量见表4。

表4病毒基因组核酸(DNA/RNA)快速提取试剂盒Eluent主要组成成分及含量

试剂	含量
		Tris-HCl(PH 8.5)	5mM/L
EDTA	0.1mM/L

本试剂盒组分见表5。

表5试剂盒组分

实施例2

本试剂盒的使用方法如下：

(1)取待抽提的含有核酸的液体50ul，置于0.6mL或1.5mL离心管中，加入200ul溶液I，上下反转颠倒充分混匀，室温放置5min。

(2)加入250ul溶液II，上下反转颠倒混合均匀。吸取混合液，转移到DNA制备管(事先置于2ml离心管中)，12000×g离心1min。弃滤液。

(3)将制备管置回2ml离心管，加500μl溶液III，12000×g离心30s，弃滤液。(*对复杂来源的标本，可再重复该步骤一次，提高核酸纯度)

(4)将制备管置于2ml离心管中，12000×g离心1min。

(5)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加20-30μl核酸溶解液或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA/RNA(*将核酸溶解液或去离子水加热至65℃，可提高核酸提取率)。

实际使用效果如下：

(1)DNA病毒

对临床分离的DNA病毒进行培养后，培养液进行10-1000倍梯度稀释，然后利用该核酸提取试剂盒，取50ul培养液(稀释液)，按照试剂盒操作方法，提取病毒DNA，再做普通PCR，32个循环，扩增915bp的病毒基因片段，PCR产物电泳结果如图2所示。

(2)RNA病毒

对临床分离的RNA病毒进行初步培养，收集得到的培养液10-100倍梯度稀释，取50ul稀释后的病毒液，利用该核酸提取试剂盒进行RNA提取，逆转录(RT)，再做PCR，32个循环，扩增1600bp的病毒基因片段，PCR产物电泳结果如图3所示。

图4是分别使用本发明试剂盒和Trizol法提取病毒核酸的PCR产物电泳结果示意图；图4中：1：DL2000 DNA marker；2：EV71未感染细胞培养液，本发明试剂盒提取病毒RNA；3：EV71感染细胞培养液，本发明试剂盒提取病毒RNA；4：EV71未感染细胞培养液，传统方法提取病毒RNA；5：EV71感染细胞培养液，传统方法提取病毒RNA。

图5是分别使用本发明试剂盒和国内某品牌试剂盒提取病毒核酸，并将核酸浓度稀释100倍后的real-time PCR检测结果示意图；图5中：1、2、3：本发明试剂盒提取病毒核酸稀释100倍CT值(3个复孔)；4、5、6：国内某品牌试剂盒提取病毒核酸稀释100倍CT值(3个复孔)

实施例3

本试剂盒由11mL的溶液I、14mL的溶液II、25mL的溶液III、1.2mL的Eluent、50支制备管、50支2mL离心管、50支1.5mL离心管和使用说明书组成。

实施例4

本试剂盒包含5mL的溶液I、10mL的溶液II、20mL的溶液III、1mL的Eluent、50支制备管、50支2mL离心管、50支1.5mL离心管和使用说明书。

实施例5

本试剂盒包含15mL的溶液I、20mL的溶液II、30mL的溶液III、2mL的Eluent、50支制备管、50支2mL离心管、50支1.5mL离心管和使用说明书。

实施例6

本试剂盒包含10mL的溶液I、15mL的溶液II、25mL的溶液III、1.5mL的Eluent、50支制备管、50支2mL离心管、50支1.5mL离心管和使用说明书。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种病毒基因组核酸快速提取试剂盒，其特征在于，所述病毒基因组核酸快速提取试剂盒包含5-15mL的溶液I；所述溶液I包括1-4moL异硫氰酸胍、10-25mmoL柠檬酸三钠、10-20mmoL二硫苏糖醇和0.01-0.1％(m/v)糖原；

所述基因组核酸快速提取试剂盒进一步包含：

10-20mL的溶液II、25-30mL的溶液III、1.5-2mL的Eluent、多支制备管、多支2mL离心管、多支1.5mL离心管和使用说明书；

所述溶液II包括40-60％异丙醇和2-4moL乙酸钠，pH小于等于5；

所述溶液III包括60-75％乙醇和1-10mM的Tris-HCl，Tris-HCl的pH为6.5-8.0；

所述Eluent包括1-10mM/L的Tris-HCl和0.1-1mM/L的EDTA；

所述Tris-HCl的pH为7-9；

所述病毒基因组核酸快速提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：

步骤一，取待抽提的含有核酸的液体50ul，置于0.6mL或1.5mL离心管中，加入200ul溶液I，上下反转颠倒充分混匀，室温放置1-5min；

步骤二，加入250ul溶液II，上下反转颠倒混合均匀；吸取混合液，转移到DNA制备管，DNA制备管事先置于2ml离心管中，10000-13000×g离心1-3min，弃滤液；

步骤三，将制备管置回2ml离心管，加500μl溶液III，10000-13000×g离心30-60s，弃滤液；

步骤四，将制备管置于2ml离心管中，10000-13000×g离心30-90s；

步骤五，将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加20-50μlEluent，在制备膜中央加20-50μl Eluent之前，将Eluent加热至50-65℃，室温静置1-3min，10000-13000×g离心1-3min洗脱DNA/RNA。

Images